本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前全球工業(yè)化和城市化對環(huán)保的影響很大，各國人民普遍關(guān)注污染問題。表現(xiàn)在美容護(hù)膚品上，就是人們尋找具有高科技含量、有益肌膚健康又不受化學(xué)品污染的生物技術(shù)護(hù)膚品。另外，隨著人們安全意識的提高，為避免對皮膚的不良影響，人們更傾向于選擇安全性高的皮膚護(hù)理產(chǎn)品。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種能有效促進(jìn)皮膚更新、減少黑色素合成、具有美白功效、能有效清除自由基、改善真皮組織生理功能，具有抗衰功效、且安全性較高的乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明第一方面提供一種乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物，其有效成分為：乳酸菌菌種于種子培養(yǎng)基中擴(kuò)培后，于發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵而得的初始體系，經(jīng)離心、乳化和滅活處理后，得到的溶胞產(chǎn)物。進(jìn)一步的，所述乳酸菌包括乳桿菌中的一種或多種、以及雙歧桿菌中的一種或多種。應(yīng)當(dāng)說明的是，由于乳桿菌和雙歧桿菌的培養(yǎng)條件有一定差別，優(yōu)選的，乳桿菌采取兼性厭氧培養(yǎng)，雙歧桿菌采取厭氧培養(yǎng)，因而，乳桿菌和雙歧桿菌優(yōu)選的分別擴(kuò)培、發(fā)酵并離心后，再混合乳化滅菌處理。進(jìn)一步的，所述乳桿菌包括植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌；所述雙歧桿菌包括乳雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌。進(jìn)一步的，所述種子培養(yǎng)基包括如下比例的各組分：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、無水乙酸鈉5g、吐溫-801ml、檸檬酸氫二銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.58g、一水硫酸錳0.19g、加水至1000ml。進(jìn)一步的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計包括：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、無水乙酸鈉0.5％、吐溫-800.1％、檸檬酸氫二銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、七水硫酸鎂0.058％、一水硫酸錳0.019％、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1％。本發(fā)明第二方面提供一種乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：S1、將乳酸菌菌種分別于種子培養(yǎng)基中擴(kuò)培，所述乳酸菌包括乳桿菌中的一種或多種、以及雙歧桿菌中的一種或多種；S2、將擴(kuò)培的乳桿菌和雙歧桿菌種子分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到發(fā)酵液；S3、將發(fā)酵液離心處理，得到菌泥；S4、根據(jù)菌泥質(zhì)量添加保護(hù)劑，高速攪拌以充分乳化，得到乳化液；S5、將乳化液高溫滅菌，得到乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物。進(jìn)一步的，步驟S1中，乳酸菌菌種以占比種子培養(yǎng)基1％-10％的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，接種溫度為35-45℃，種子成熟OD為2.0-5.0，pH<5.0，乳桿菌采取兼性厭氧培養(yǎng)，雙歧桿菌采取厭氧培養(yǎng)。進(jìn)一步的，步驟S2中，將步驟S1擴(kuò)培后的種子，按照占比發(fā)酵培養(yǎng)基1％-10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度37℃，控制起始pH6.0-7.0、發(fā)酵pH4.5-6.0、攪拌轉(zhuǎn)速60-100r/min、發(fā)酵時間7-10h、放罐OD7-10。進(jìn)一步的，步驟S3中，控制發(fā)酵液離心轉(zhuǎn)數(shù)為5000-10000r/min，離心半徑為6-12cm，離心時間為15-30min，離心后倒掉上清液得到菌泥。進(jìn)一步的，步驟S4中，將乳桿菌和雙歧桿菌菌泥進(jìn)行混合，混合比例1:1-1:10，根據(jù)混合菌泥質(zhì)量，按照1:1-1:10添加保護(hù)劑，經(jīng)高速攪拌器進(jìn)行充分乳化。進(jìn)一步的，步驟S5中，乳化液高溫濕熱滅菌溫度95-121℃，滅菌時間15-30min。本發(fā)明第二方面提供一種乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物，在化妝品中的應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)說明的是，所述化妝品應(yīng)包括但不限于乳液、唇、唇彩、化妝水、面膜、面霜、精華露、軟膏、摩絲、貼劑、發(fā)蠟、溶液、噴霧劑、蠟基棒狀物或濕紙巾；尤其是在面霜、精華露中的應(yīng)用。借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點：乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物是乳酸菌菌體與保護(hù)劑進(jìn)行乳化滅菌而得到的，該2種原料都是可食用的，且在整個制備過程中，發(fā)酵溫度和發(fā)酵pH溫和，且不添加任何有機(jī)試劑，確保產(chǎn)品對人體的安全。乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物富含功能性大分子肽聚糖、酯磷壁酸、益生菌源脫氧核糖核酸(DNA)等成分，能有效促進(jìn)皮膚更新、減少黑色素合成，具有美白功效。另外，其還富含益生菌的超氧化物歧化酶、細(xì)菌素、益生菌源活性肽，能有效清除自由基、改善真皮組織生理功能，具有抗衰功效，從而對皮膚具有較強(qiáng)的美白、抗衰功能。上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。附圖說明圖1是本發(fā)明中GC-MS分析乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用曲線圖；圖3是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的抑制酪氨酸酶活性示意圖；圖4是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對色斑數(shù)量改善結(jié)果圖；圖5是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對面部黑色素數(shù)值降低程度結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對皺紋數(shù)量減少程度結(jié)果圖；圖7是本發(fā)明中乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對皮膚平滑度改善程度結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物制備本實施例提供一種乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的制備方法，包括以下步驟：S1、將乳酸菌菌種分別于種子培養(yǎng)基中擴(kuò)培，所述乳酸菌包括乳桿菌中的一種或多種、以及雙歧桿菌中的一種或多種；其中，種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g、蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母膏5g、無水乙酸鈉5g、吐溫-801ml、檸檬酸氫二銨2g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0.58g、一水硫酸錳0.19g、加水至1000ml，調(diào)pH至6.8，滅菌118℃，20min；S2、將擴(kuò)培的乳桿菌和雙歧桿菌種子分別接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到發(fā)酵液；發(fā)酵溫度：37℃、控制起始pH:6.8、發(fā)酵pH:5.5攪拌轉(zhuǎn)速：80r/min；其中，發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉浸粉0.5％、酵母膏1％、無水乙酸鈉0.5％、吐溫-800.1％、檸檬酸氫二銨0.2％、磷酸氫二鉀0.2％、七水硫酸鎂0.058％、一水硫酸錳0.019％、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1％。發(fā)酵時間：8.5h，放罐OD：9.5；S3、將發(fā)酵液離心處理，離心轉(zhuǎn)速6500r/min，時間15min，傾倒上清液收集菌泥；S4、將乳桿菌和雙歧桿菌菌泥進(jìn)行混合，混合比例1:1-1:10，根據(jù)混合菌泥質(zhì)量，按照1:1-1:10添加保護(hù)劑，保護(hù)劑成分：5-50％海藻糖，優(yōu)選28％海藻糖，經(jīng)高速攪拌器進(jìn)行充分乳化，得到乳化液；S5、將乳化液高溫濕熱滅菌，溫度95-121℃，滅菌時間15-30min，得到乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物。實施例2乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物在化妝品中的應(yīng)用一、乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的性質(zhì)實施例1制備所得的乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物，外觀為澄清液體、顏色為透明至淡黃色，pH值5.0-6.0，可溶性固含物含量15-25％，菌落總數(shù)小于50CFU/ml，無致病菌檢出。根據(jù)化妝品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB7916-87，化妝品細(xì)菌總數(shù)不高于1000CFU/ml，因此，該發(fā)酵提取物符合化妝品質(zhì)量要求。采用高效液相色譜(HLPC)技術(shù),研究了乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的相關(guān)成分，具體數(shù)據(jù)如下：蘋果酸：0.32g/100mL，乳酸：1.90g/100mL，乙酸：2.99g/100mL。維生素含量：維生素B1：0.013mg/100g，維生素B2：0.285mg/100g，維生素B6：0.0211mg/ml，維生素C：0.0134mg/ml。氨基酸含量：蘇氨酸：0.019g/100g，谷氨酸：0.103g/100g，組氨酸：0.048g/100g，天冬氨酸：0.025g/100g，胱氨酸：0.026g/100g，異亮氨酸：0.004g/100g，酪氨酸：0.029g/100g。用GC-MS分析乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的化學(xué)成分，具體如表1和圖1所示：表1GC-MS分析乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的化學(xué)成分表二、乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的安全性檢測人體斑貼試驗主要是用于檢測化妝品終產(chǎn)品或原料的刺激性。本發(fā)明對實施例1獲得的乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物進(jìn)行人體封閉式斑貼試驗，旨在對其潛在皮膚刺激性進(jìn)行評估。1、試驗對象選擇合適的志愿者30人，年齡范圍在18-60歲隨機(jī)選擇。2、試驗方法稱取0.020g-0.025g固體樣品或半固體的樣品放入斑試器中備用。將液體樣品0.2mL到0.025mL滴加在濾紙片上，再將濾紙片置于斑試器內(nèi)。每個樣品均設(shè)置空白對照，在對照斑試器孔內(nèi)加入與樣品等量的樣品溶劑，如蒸餾水或橄欖油。試驗部位選為人體背部，利用無刺激性的膠帶將斑試器固定貼敷于受試者背部。測試周期持續(xù)24h。為了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確、可信和科學(xué)，在測試期間志愿者按照要求，不能摘掉斑試器，亦不可使受試部位接觸水。24h后去除斑試器，靜置30min后，等待壓痕消失，觀察皮膚的反應(yīng)。如果試驗結(jié)果為陰性，則需要在斑貼試驗后24h和48h分別再觀察一次。3、試驗結(jié)果斑貼試驗結(jié)果如表2所示："-"＝陰性反應(yīng)；"±"＝可疑反應(yīng)：僅有微弱紅斑；"+"＝弱陽性反應(yīng)(紅斑反應(yīng))：紅斑、浸潤、水腫、可有丘疹；"++"＝強(qiáng)陽性反應(yīng)(皰疹反應(yīng))；紅斑、浸潤、水腫、丘疹、皰疹；反應(yīng)可超出受試區(qū)；"+++"＝極強(qiáng)陽性反應(yīng)(融合性皰疹反應(yīng))；明顯紅斑、嚴(yán)重浸潤、水腫、融合性皰疹；反應(yīng)超出受試區(qū)。根據(jù)化妝品衛(wèi)生規(guī)范2007，人體斑貼試驗判斷標(biāo)準(zhǔn)為：30例受試者中出現(xiàn)1級皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于5例，或二級皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于2例，或出現(xiàn)任何1例三級或三級以上皮膚不良反應(yīng)時，則判定受試物對人體有不良反應(yīng)，反之，則視為對人體無不良反應(yīng)。從表2中可以看出：實施例1得到的乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物未產(chǎn)生可疑反應(yīng)，說明本發(fā)明提供的乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物均具有安全性，不會給人體帶來不良反應(yīng)。表2乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的斑貼試驗結(jié)果三、乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的抗氧化性能檢測DPPH是一種早期合成的有機(jī)自由基，常用來評估抗氧化物的供氫能力，它在有機(jī)溶劑中非常穩(wěn)定，呈紫色，而且在517nm處有一個特征吸收峰，當(dāng)遇到自由基清除劑時，DPPH的孤對電子被配對而使其退色，也就是在最大吸收波長處的吸光值變小。因此，可通過測定吸光值的變化來評價樣品對DPPH自由基的清除效果。DPPH自由基清除實驗的具體實驗步驟為：以實施例1所得乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物作為待測物；(1)取等體積(一般為3mL)的待測物與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻(A1管)；(2)取等體積的無水乙醇(待測物溶劑)與2×10-4mol/L的DPPH溶液混勻(A2管)；(3)取等體積的無水乙醇與待測物混勻(A3管)；(4)反應(yīng)30min后，在517nm下測A1、A2、A3管吸光度值。清除率計算公式為：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2做出乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對DPPH自由基清除作用曲線，見圖2。由圖可知，實施例1所得乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對DPPH清除作用的IC50＝8.6％，說明乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可清除自由基，促進(jìn)細(xì)胞代謝，增強(qiáng)細(xì)胞活力，改善機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能，提高機(jī)體生命力，從而延緩細(xì)胞老化，發(fā)揮其抗衰老的作用。三、乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的美白功效分析酪氨酸酶是黑素生成的關(guān)鍵酶，它控制著黑素的形成過程,其活性程度對色素的沉積起主要作用。目前市場上銷售的許多美白、祛斑產(chǎn)品都是以抑制酪氨酸酶達(dá)到美白作用,故對酪氨酸酶抑制作用的強(qiáng)弱是評價增白化妝品的主要指標(biāo)。通過測定樣品對酪氨酸酶的影響來評價樣品的美白功能，具體方法如下：按表3配置溶液：表3、溶液配制列表單位(mL)C1C2T1T2L-酪氨酸2222樣品0022PBS4523酪氨酸酶1010總體積7777注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活為100U/mL；樣品為實施例1所得乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物；(1)C2管配好搖勻后，在37℃水浴鍋中水浴加熱10min，波長475nm下調(diào)零。(2)C1管溶液配好搖勻，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，繼續(xù)水浴10分鐘，測定C1吸光度值。(3)按(1)(2)同樣方法，以T2調(diào)零測定T1吸光度值。(4)計算樣品對酪氨酸酶的活性抑制率T(％)：T(％)＝(C1-T1)/C1×100％實驗證明，本發(fā)明實施例1所得10％乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物對酪氨酸酶活性的抑制率為38.46％，1％的熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制率98.12％，如圖3所示，即本發(fā)明提供的10％乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的美白效果相當(dāng)于0.392％的熊果苷的效果，具有一定的美白功效。四、乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物化妝品人體測試方法：分別各選20名年齡在28-50歲之間的女性志愿者使用含10％、20％乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的面膜，以不含乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物的基質(zhì)配方作為空白對照，每天晚上使用1次。使用VISIA全臉分析儀拍照分析，使用MPA580皮膚測試儀分析黑色素數(shù)值。結(jié)果：乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物可顯著降低皮膚色斑數(shù)量，提亮膚色，減輕皺紋數(shù)量和程度，提高平滑度，使肌膚年輕化。1.祛斑與亮膚效果如圖4所示，乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物使用4周色斑數(shù)量已有顯著改善，如圖5所示，使用6周后皮膚黑色素數(shù)值有顯著下降。2.撫平皺紋效果如圖6所示，乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物具有顯著的促進(jìn)皮膚年輕化效果，使用4周后，不同濃度處理組皺紋數(shù)量均有極顯著降低。3.改善皮膚平滑度如圖7所示，乳酸菌發(fā)酵溶胞產(chǎn)物可快速改善皮膚平滑度，使用2周后有顯著改善。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3