專利名稱：從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品防腐劑提取方法，特別涉及一種從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法。
背景技術(shù)：
在食品工業(yè)中防腐劑是最重要的添加劑之一，食品防腐劑一般分為合成防腐劑和天然防腐劑。經(jīng)長(zhǎng)期的研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)防腐劑的使用主要存在以下問(wèn)題(1)食品防腐劑品種較少，無(wú)法滿足人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的對(duì)食品多樣性的需求；(2)傳統(tǒng)防腐劑主要以酸性防腐劑為主，在較低的pH條件下才能發(fā)揮作用，在中性或弱堿性條件下不能發(fā)揮作用，致使應(yīng)用范圍受到很大的限制；(3)長(zhǎng)期使用這些防腐劑，一些食物腐敗菌已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，按照國(guó)家食品添加劑衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的添加量已不能起到預(yù)期的防腐目的，以至于防腐劑用量超標(biāo)的質(zhì)量事故頻頻發(fā)生。
天然防腐劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒、水溶性好、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等合成防腐劑無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到廣泛的開(kāi)發(fā)。經(jīng)多年精心研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾十種細(xì)菌素，其中已被廣泛應(yīng)用的是Nisin，也稱尼生素。
Nisin的物理性質(zhì)乳酸鏈球菌素又稱乳球菌肽或乳鏈菌肽，英文名為Nisin，是N型血清的某些乳酸鏈球菌在代謝過(guò)程中合成和分泌的具有很強(qiáng)殺菌作用的小肽。
Nisin能抑制大部分G+菌及其芽孢的生長(zhǎng)和繁殖，如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的細(xì)菌，特別是對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌、肉毒桿菌作用明顯。另外，Nisin還可以和某些絡(luò)合劑(如EDTA或檸檬酸)等一起作用，可是只有部分G-菌對(duì)之敏感。從分子水平上探尋Nisin的抑菌機(jī)理一直是研究的熱點(diǎn)，但至今觀點(diǎn)不一。
早在1928年，美國(guó)Roger等人發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌的代謝產(chǎn)物能抑制保加利亞乳桿菌，在其后的20多年里，許多科學(xué)家對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行了深入的研究。
Nisin的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由34個(gè)氨基酸組成的多肽，N末端為異亮氨酸，C端為賴氨酸，含兩種特殊氨基酸Dha和Dhb，有5個(gè)硫醚鍵形成的分子內(nèi)環(huán)，其中一個(gè)稱為羊毛硫氨酸，其他四個(gè)是β-甲基羊毛硫氨酸。相對(duì)分子質(zhì)量為3510，活性分子常為二聚體或四聚體。Nisin有6種類型，分別為A、B、C、D、E和Z，其中對(duì)NisinA和NisinZ的研究最活躍。NisinZ和NisinA僅在27位氨基酸殘基有差別，A為His，而Z為Asp。兩者的抗菌特性幾乎無(wú)差別。
Nisin的溶解度隨著pH值的下降而顯著增加，當(dāng)pH＝2.5時(shí)溶解度為12％，pH＝5.0時(shí)為4.0％，但當(dāng)pH為中性和堿性時(shí)，Nisin幾乎不溶解。
Nisin的穩(wěn)定性與溶液的pH值和溫度有緊密關(guān)系，當(dāng)把Nisin溶于pH＝2的鹽酸中，Nisin可經(jīng)115.6℃高壓滅菌而不失活；而在pH＝5時(shí)，滅菌后喪失40％的活性；當(dāng)pH＝6.8時(shí)喪失90％以上活性。但把Nisin加入食品后，由于受到牛奶等大分子的保護(hù)，穩(wěn)定性大大提高。有關(guān)研究資料表明，Nisin的穩(wěn)定性與防腐的底物、熱處理?xiàng)l件等因素有關(guān)。
迄今為止，已有英、美、法等50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)批準(zhǔn)Nisin作為食品防腐劑，乳酸鏈球菌素(Nisin)作為一種安全的食品防腐劑在發(fā)達(dá)國(guó)家被應(yīng)用的歷史已達(dá)40余年，世界上有不少國(guó)家，如英國(guó)、法國(guó)、澳大利亞等對(duì)在食品中Nisin的添加量不做任何限制。1992年3月，我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)使用乳酸鏈球菌素。
目前提取Nisin工藝存在的問(wèn)題自二十世紀(jì)六十年代以來(lái)，從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法和手段不斷被建立起來(lái)，常用的有板框過(guò)濾固液分離法、有機(jī)溶劑萃取法、固體顆粒表面吸附法、單膜超濾法等。一般在發(fā)酵液中加入固體顆粒吸附劑進(jìn)行吸附，制成吸附劑-乳酸鏈球菌素復(fù)合物，然后用含有機(jī)溶劑的解吸附劑進(jìn)行解吸附，解吸附液在噴霧干燥器上進(jìn)行噴霧干燥，即得粉末狀乳酸鏈球菌素產(chǎn)品；另一種常用工藝為采用板框過(guò)濾對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，去除菌體等固形物，濾液用超濾膜濃縮后，濃縮液鹽析或噴霧干燥，得乳酸鏈球菌素粉。
有機(jī)溶劑萃取法需要低溫操作，能耗高，有機(jī)溶劑的加入有可能使乳酸鏈球菌素失活，且增加了后處理的難度；固體顆粒吸附劑在吸附乳酸鏈球菌素的同時(shí)，也吸附色素和多肽，產(chǎn)品外觀和純度難以提高；板框過(guò)濾法需要大量助濾劑，操作強(qiáng)度大，設(shè)備占地面積大，作業(yè)時(shí)間長(zhǎng)；超濾膜濃縮乳酸鏈球菌素的同時(shí)，也濃縮色素和多肽，同樣存在產(chǎn)品外觀和純度難以提高的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題與不足而提供的一種從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法，該方法易于操作、產(chǎn)品外觀優(yōu)純度高，具有不消耗有機(jī)溶劑、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、成本低、收率高及安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法是采用四級(jí)過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素，第一級(jí)為板框過(guò)濾，首先將發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH至酸性，加入助濾劑，攪拌均勻，然后使用板框進(jìn)行過(guò)濾，去除發(fā)酵液中的培養(yǎng)基顆粒和大量菌體；第二級(jí)為微濾過(guò)濾，將濾液使用孔徑在0.05μm～0.5μm范圍內(nèi)的微濾膜過(guò)濾，除去剩余的菌體和部分大分子雜蛋白；第三、四級(jí)為兩種分子量的超濾膜過(guò)濾，包括截留分子量在1000～50000道爾頓范圍內(nèi)的超濾膜，其中一級(jí)超濾濃縮乳酸鏈球菌素，并去除水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸小分子有機(jī)物，另一級(jí)超濾去除雜蛋白、色素、大分子雜質(zhì)，得到純度較高的乳酸鏈球菌素料液，最后再將料液結(jié)晶干燥，即得到粉末狀乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
本發(fā)明中，在第一級(jí)過(guò)濾中，板框過(guò)濾的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，加量為發(fā)酵液體積的0.2％～0.9％，減少微濾設(shè)備——陶瓷膜的壓力，減少過(guò)濾時(shí)間。
第二級(jí)微濾過(guò)程中，最后的濃縮液回收時(shí)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理液pH相等的稀鹽酸或稀硫酸溶液，酸水用量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍，最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。濃縮液的處理目的提高產(chǎn)品的收率。
在超濾濃縮過(guò)程中，將微濾后的濾出液用截留分子量為1000～5000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮5～10倍。
在超濾去除雜蛋白、色素、大分子雜質(zhì)過(guò)程中，將超濾濃縮后的濃縮液用截留分子量為10000～20000道爾頓的超濾膜常溫下超濾，最后10％的濃縮液分兩次或四次用二倍或四倍體積的酸水稀釋后再超濾，收集濾出液。
本發(fā)明中的在在第三、四級(jí)超濾過(guò)程中，超濾濃縮和超濾除色素、蛋白過(guò)程可以前后調(diào)整。
所述微濾膜可采用陶瓷膜、金屬氧化膜等。超濾膜采用聚楓膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜、再生纖維素膜等。
在第一級(jí)板框過(guò)濾中，pH值最好調(diào)至2～5。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于采用預(yù)處理板框過(guò)濾，微濾、二級(jí)超濾分別濃縮和除色素等技術(shù)手段，從乳酸鏈球菌的發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素，獲得了天然食品防腐劑乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。該方法易于操作、產(chǎn)品外觀優(yōu)、純度高，不但具有不消耗有機(jī)溶劑、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、成本低、收率高及安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的創(chuàng)造性在于采用四級(jí)過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素，全部流體操作，勞動(dòng)強(qiáng)度低，無(wú)污染，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定且質(zhì)量高，成本低，收率高，從而開(kāi)創(chuàng)了廉價(jià)提取高質(zhì)量的乳酸鏈球菌素的創(chuàng)新技術(shù)，具有更廣泛及實(shí)用的經(jīng)濟(jì)效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明以下結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1本發(fā)明的具體步驟如下1)預(yù)處理將含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH＝2～5，常溫下加入助濾劑(珍珠巖或硅藻土)，攪拌均勻，進(jìn)行板框過(guò)濾。棄去濾餅，收集濾液。
2)微濾將板框過(guò)濾后的濾液，常溫下用陶瓷膜進(jìn)行微濾(孔徑為0.05μm～0.5μm之內(nèi))。濾出液達(dá)到發(fā)酵液體積的90％后，剩余10％的濃縮發(fā)酵液。濃縮發(fā)酵液含雜質(zhì)較多，應(yīng)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液，加量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍。最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。
3)超濾濃縮微濾的濾出液用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮10倍。將5000道爾頓以下的小分子物質(zhì)濾出。
4)超濾除色素超濾濃縮的濃縮液用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜常溫下超濾。最后10％的濃縮液分兩次用二倍體積的與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液稀釋后再超濾。收集濾出液。
5)結(jié)晶、干燥超濾出的濾出液進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液用沉降式離心機(jī)3500rpm離心10min，取沉淀真空干燥，粉碎后即得乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法中，整個(gè)流程中預(yù)處理板框收率99％以上，微濾的收率為92％，濃縮收率為87％，結(jié)晶干燥收率為88％，整體收率達(dá)69.73％，乳酸鏈球菌素產(chǎn)品純度達(dá)到38％。
實(shí)施例2本實(shí)施例中，從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)預(yù)處理將含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH＝2～5，常溫下加入助濾劑(珍珠巖或硅藻土)，攪拌均勻，進(jìn)行板框過(guò)濾。棄去濾餅，收集濾液。
2)微濾將板框過(guò)濾后的濾液，常溫下用陶瓷膜進(jìn)行微濾(孔徑為0.05μm～0.5μm之內(nèi))。濾出液達(dá)到發(fā)酵液體積的90％后，剩余10％的濃縮發(fā)酵液。濃縮發(fā)酵液含雜質(zhì)較多，應(yīng)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液，加量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍。最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。
3)超濾濃縮微濾的濾出液用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮5倍。將5000道爾頓以下的小分子物質(zhì)濾出。
4)超濾除色素超濾濃縮的濃縮液用截留分子量為10000道爾頓的超濾膜常溫下超濾。最后10％的濃縮液分四次用四倍體積的與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液稀釋后再超濾。收集濾出液。
5)結(jié)晶、干燥超濾出的濾出液進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液用沉降式離心機(jī)3500rpm離心10min，取沉淀真空干燥，粉碎后即得乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法中，整個(gè)流程中預(yù)處理板框收率99％以上，微濾的收率為91％，濃縮收率為94％，結(jié)晶干燥收率為77％，整體收率達(dá)65.2％，乳酸鏈球菌素產(chǎn)品純度達(dá)到39％。
實(shí)施例3本實(shí)施例中，從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下
1)預(yù)處理將含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH＝2～5，常溫下加入助濾劑(珍珠巖或硅藻土)，攪拌均勻，進(jìn)行板框過(guò)濾。棄去濾餅，收集濾液。
2)微濾將板框過(guò)濾后的濾液，常溫下用陶瓷膜進(jìn)行微濾(孔徑為0.05μm～0.5μm之內(nèi))。濾出液達(dá)到發(fā)酵液體積的90％后，剩余10％的濃縮發(fā)酵液。濃縮發(fā)酵液含雜質(zhì)較多，應(yīng)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液，加量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍。最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。
3)超濾除色素微濾后的清液用截留分子量為20000道爾頓的超濾膜常溫下超濾。最后10％的濃縮液分兩次用二倍體積的與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液稀釋后再超濾。收集濾出液。
4)超濾濃縮超濾后的濾出液用截留分子量為3000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮10倍。將3000道爾頓和以下的物質(zhì)濾出。
5)結(jié)晶、干燥超濾的濾出液進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液用沉降式離心機(jī)3500rpm離心10min，取沉淀真空干燥，粉碎后即得乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法中，整個(gè)流程中預(yù)處理板框收率99％以上，微濾的收率為91％，濃縮收率為94％，結(jié)晶干燥收率為85％，整體收率達(dá)71.98％，乳酸鏈球菌素產(chǎn)品純度達(dá)到34％。
實(shí)施例4本實(shí)施例中，從乳酸鏈球菌發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的具體步驟如下1)預(yù)處理將含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH＝2～5，常溫下加入助濾劑(珍珠巖或硅藻土)，攪拌均勻，進(jìn)行板框過(guò)濾。棄去濾餅，收集濾液。
2)微濾將板框過(guò)濾后的濾液，常溫下用陶瓷膜進(jìn)行微濾(孔徑為0.05μm～0.5μm之內(nèi))。濾出液達(dá)到發(fā)酵液體積的90％后，剩余10％的濃縮發(fā)酵液。濃縮發(fā)酵液含雜質(zhì)較多，應(yīng)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液，加量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍。最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。
3)超濾除色素微濾后的清液用截留分子量為20000道爾頓的超濾膜常溫下超濾。最后10％的濃縮液分四次用四倍體積的與預(yù)處理的發(fā)酵液pH相等的稀硫酸或稀鹽酸水溶液稀釋后再超濾。收集濾出液。
4)超濾濃縮超濾后的濾出液用截留分子量為3000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮5倍。將3000道爾頓和以下的物質(zhì)濾出。
5)結(jié)晶、干燥超濾的濾出液進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶液用沉降式離心機(jī)3500rpm離心10min，取沉淀真空干燥，粉碎后即得乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
本發(fā)明的方法中，整個(gè)流程中預(yù)處理板框收率99％以上，微濾的收率為92％，濃縮收率為91％，結(jié)晶干燥收率為87％，整體收率達(dá)72.1％，乳酸鏈球菌素產(chǎn)品純度達(dá)到36％。
權(quán)利要求
1.一種從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于它是采用四級(jí)過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素，第一級(jí)為板框過(guò)濾，首先將發(fā)酵液用稀硫酸或稀鹽酸調(diào)pH至酸性，加入助濾劑，攪拌均勻，然后使用板框進(jìn)行過(guò)濾，去除發(fā)酵液中的培養(yǎng)基顆粒和大量菌體；第二級(jí)為微濾過(guò)濾，將濾液使用孔徑在0.05μm～0.5μm范圍內(nèi)的微濾膜過(guò)濾，除去剩余的菌體和部分大分子雜蛋白；第三、四級(jí)為兩種分子量的超濾膜過(guò)濾，包括截留分子量在1000～50000道爾頓范圍內(nèi)的超濾膜，其中一級(jí)超濾濃縮乳酸鏈球菌素，并去除水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸小分子有機(jī)物，另一級(jí)超濾去除雜蛋白、色素、大分子雜質(zhì)，得到乳酸鏈球菌素料液，最后再將料液結(jié)晶干燥，即得到粉末狀乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在第一級(jí)過(guò)濾中，板框過(guò)濾的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，加量為發(fā)酵液體積的0.2％～0.9％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在第二級(jí)微濾過(guò)程中，最后的濃縮液回收時(shí)邊微濾邊等速流加與預(yù)處理液pH相等的稀鹽酸或稀硫酸溶液，酸水用量為濃縮發(fā)酵液體積的二倍，最終的濃縮發(fā)酵液體積為發(fā)酵液體積的1％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在超濾濃縮過(guò)程中，將微濾后的濾出液用截留分子量為1000～5000道爾頓的超濾膜常溫下濃縮5～10倍。根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在超濾去除雜蛋白、色素、大分子雜質(zhì)過(guò)程中，將超濾濃縮后的濃縮液用截留分子量為10000～20000道爾頓的超濾膜常溫下超濾，最后10％的濃縮液分兩至四次用二倍至四倍體積的酸水稀釋后再超濾，收集濾出液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在第三、四級(jí)超濾過(guò)程中，超濾濃縮和超濾除色素、蛋白過(guò)程可以前后調(diào)整。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于微濾膜采用陶瓷膜或金屬氧化膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于超濾膜采用聚楓膜、硝酸纖維膜、醋酸纖維膜或再生纖維素膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于在第一級(jí)板框過(guò)濾中，pH值最好調(diào)至2～5。
全文摘要
一種從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素的方法，采用四級(jí)過(guò)濾技術(shù)從發(fā)酵液中提取乳酸鏈球菌素，第一級(jí)為板框過(guò)濾，去除發(fā)酵液中的培養(yǎng)基顆粒和大量菌體；第二級(jí)為微濾過(guò)濾，除去剩余的菌體和部分大分子雜蛋白；第三、四級(jí)為兩種不同截留分子量的超濾膜過(guò)濾，一級(jí)為1000～5000道爾頓超濾膜過(guò)濾，去除水、無(wú)機(jī)鹽、氨基酸小分子有機(jī)物，另一級(jí)為10000～50000道爾頓超濾膜過(guò)濾超濾去除分子量大于7000道爾頓的雜蛋白、色素和大分子雜質(zhì)，然后結(jié)晶干燥，即得到粉末狀的產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)是采用四級(jí)過(guò)濾提取技術(shù)，全部流體操作，勞動(dòng)強(qiáng)度低，無(wú)污染，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定且質(zhì)量高，成本低，收率高。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101066994SQ20071005425
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日
發(fā)明者魯來(lái)政, 孫遠(yuǎn)功 申請(qǐng)人:上海奇泓生物科技有限公司