本發(fā)明屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種、使用及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法。

背景技術(shù)：

由于煤、石油、天然氣、木材、作物秸稈等碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵蛟谶€原性條件下發(fā)生熱分解以及汽車、飛機(jī)等交通運(yùn)輸工具廢氣的排放和焦化煤氣、石油工業(yè)、煉鋼煉鐵工廠的任意排放與垃圾滲透液、污水灌溉等，使得水體中普遍存在多環(huán)芳烴類污染物。

在遼寧、山東、陜西、重慶、湖北、河北等地均發(fā)生過(guò)石油天然氣泄露事故，如2013年河北衡水的天然氣泄漏和大連石油爆炸泄露。多環(huán)芳烴類物質(zhì)不溶于或難溶于水體，易溶于苯類芳香性溶劑，一般漂浮或沉淀于水體中。多環(huán)芳烴類物質(zhì)主要包括萘、菲、芘、蒽、苯并(a)芘等。

氯代烴是地下水系統(tǒng)中檢測(cè)到的最普遍的污染物之一，氯代烴因含有鹵代基團(tuán)而難以被生物降解，是有毒有害的有機(jī)污染物，其具有高揮發(fā)性、脂溶性而易被皮膚吸收，被認(rèn)為是“三致”物質(zhì)，對(duì)人體的肝、腎、心血管和胃腸等器官都有極強(qiáng)的毒害作用。

在中國(guó)許多水體中同時(shí)檢測(cè)到鹵代烴和萘系物的存在，現(xiàn)在對(duì)于受到兩類物質(zhì)污染的水體，采用最多的方法是使用活性炭粉末進(jìn)行吸附，但這種方法只是將污染物從一相轉(zhuǎn)移到另一相，不能從根本上去除污染物。采用化學(xué)方法可以去除部分污染物而很難同時(shí)徹底去除上述兩類物質(zhì)，且經(jīng)濟(jì)費(fèi)用較高。微生物處理技術(shù)能夠有效的降低經(jīng)濟(jì)成本，適用范圍廣與此同時(shí)微生物還能夠通過(guò)共代謝，同時(shí)有效去除上述兩類物質(zhì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題就在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種的使用及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，該菌種能夠有效地降解萘和氯仿，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明公開(kāi)了一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種，菌種的名稱為：香坊腸桿菌Enterobacter xiangfangensis，編號(hào)為：MF-Ⅰ；已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No.12367，并有存活證明。

所述菌種在好氧條件下以萘作為碳源，通過(guò)共代謝降解氯仿；對(duì)于同時(shí)受萘和氯仿污染的水體，能夠有效地降解萘和氯仿，達(dá)到修復(fù)污染水體的作用。

本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種的使用方法，將MF-I菌用富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)；將滅菌的富集培養(yǎng)基定量備用；將富集培養(yǎng)后的菌株接種至滅菌過(guò)的富集培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，恒溫振蕩2～5天；將菌液在溫度為4℃、轉(zhuǎn)數(shù)為5000的高速離心機(jī)中離心10分鐘，棄上清液，以pH＝7.0磷酸鹽緩沖液對(duì)沉淀清洗并離心，重復(fù)三次，在吸光度為600nm的紫外分光光度計(jì)下，以磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌懸液濃度為OD600＝1.0。

優(yōu)選的，所述的富集培養(yǎng)基由以下組分組成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g和水1L，富集培養(yǎng)基的pH為7。

本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法，包括以下步驟：

1)配制培養(yǎng)基于血清瓶中并高壓滅菌，消除培養(yǎng)基中本身的原著菌和空氣中附著的雜菌，更好的讓目標(biāo)菌生長(zhǎng)；

2)在血清瓶中添加萘和氯仿，調(diào)整萘和氯仿的濃度，確定萘和氯仿的最佳濃度；

3)在紫外滅菌后的潔凈工作臺(tái)上以菌株MF-Ⅰ菌懸液進(jìn)行接種，以紫外分光光度儀進(jìn)行測(cè)量以表征生物量，調(diào)整生物量到設(shè)計(jì)值，調(diào)節(jié)菌體濃度；

4)放入水浴振蕩箱中進(jìn)行以萘作為碳源共代謝降解氯仿的代謝降解反應(yīng)，利用水溫調(diào)節(jié)反應(yīng)器皿的溫度，使其保持恒定值；振蕩使得微生物充分接觸污染物物質(zhì)，擴(kuò)大接觸面積。

優(yōu)選的，步驟1)中所用培養(yǎng)基的化學(xué)組分為：Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KNO₃0.5g/L,CaCl₂ 0.001g/L，微量元素1mL/L。前兩個(gè)組分組成緩沖溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的少量酸，保持溶液pH的穩(wěn)定；后幾個(gè)組分分別為微生物提供生長(zhǎng)代謝所必須的銨、鎂、氮及鈣元素，同時(shí)還為微生物的生長(zhǎng)提供了所需的氫、磷、鉀等元素。

優(yōu)選的，所用的微量元素的化學(xué)組分為：FeCl₂·4H₂O 1.5g/L，CoC_l2·6H₂O 0.19g/L，MnSO₄ 7H₂O 0.1g/L，ZnCl₂ 0.07g/L，NiCl₂·6H₂O0.024g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g/L，MnCl₂·4H₂O 0.006g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L。

優(yōu)選的，步驟2)中萘和氯仿的濃度經(jīng)過(guò)調(diào)整后，萘的濃度為20mg/L，氯仿的濃度為20ug/L。關(guān)于萘的濃度選擇：在菌馴化階段，加入萘的濃度分別為1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L，經(jīng)檢測(cè)，萘的去除率均大于95％。去除率相差不大，故選用萘初始濃度較高的。關(guān)于氯仿的濃度選擇：經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在共代謝碳源萘濃度為20mg/L條件下，當(dāng)氯仿的初始濃度設(shè)為10μg/L、20μg/L、30μg/L時(shí)，氯仿的最終去除率分別為76.6％、44.5％和32.2％。在參考實(shí)際廢水濃度并保證氯仿具有較高去除率的情況下，故選擇氯仿為20μg/L。

優(yōu)選的，步驟3)中紫外分光光度儀的吸光度為600nm，當(dāng)吸光度為600nm時(shí)對(duì)菌濁度反應(yīng)較敏感，吸光度達(dá)到最大。

優(yōu)選的，步驟4)中的水浴振蕩箱的溫度為30℃，水浴振蕩箱的轉(zhuǎn)速為150r/min。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明提供的MF-Ⅰ菌株在好氧條件下能夠以萘作為碳源，通過(guò)共代謝降解氯仿。對(duì)于同時(shí)受萘和氯仿污染的水體，該菌種能夠有效地降解萘和氯仿，達(dá)到修復(fù)污染水體目的。

附圖說(shuō)明

圖1為利用萘作為碳源共代謝降解氯仿和利用萘作為碳源共代謝降解四氯化碳的曲線圖；

圖2為菌株MF-Ⅰ在萘的濃度為20mg/L下對(duì)不同濃度的氯仿降解曲線圖；

圖3為菌株MF-Ⅰ在不同濃度的氯仿存下對(duì)濃度為20mg/L的萘降解曲線圖；

圖4為不同濃度的氯仿對(duì)菌株MF-Ⅰ在濃度為20mg/L的萘的生長(zhǎng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明：

本發(fā)明提供了一種萘作為碳源共代謝降解氯仿的菌種，菌種的名稱為：香坊腸桿菌，編號(hào)為：MF-Ⅰ，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.12367，并有存活證明。

所述菌種在好氧條件下以萘作為碳源，通過(guò)共代謝降解氯仿；對(duì)于同時(shí)受萘和氯仿污染的水體，能夠有效地降解萘和氯仿，達(dá)到修復(fù)污染水體目的。

具體使用方法：

首先將MF-I菌用富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)；將滅菌的富集培養(yǎng)基定量備用；將富集培養(yǎng)后的菌株接種至滅菌過(guò)的富集培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，恒溫振蕩3天；將菌液在溫度為4℃、轉(zhuǎn)數(shù)為5000的高速離 心機(jī)中離心10分鐘，棄上清液，以pH＝7.0磷酸鹽緩沖液對(duì)沉淀清洗并離心，重復(fù)三次，在吸光度為600nm的紫外分光光度計(jì)下，以磷酸鹽緩沖液調(diào)整菌懸液濃度為OD600＝1.0。

所述富集培養(yǎng)基由以下組分組成：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g和水1L，富集培養(yǎng)基的pH為7。

具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法：

1)配制培養(yǎng)基于血清瓶中并高壓滅菌；

2)在血清瓶中添加萘和氯仿，調(diào)整萘和氯仿的濃度；

3)在紫外滅菌后的潔凈工作臺(tái)上以菌株MF-Ⅰ菌懸液進(jìn)行接種，以紫外分光光度儀進(jìn)行測(cè)量以表征生物量，調(diào)整生物量到設(shè)計(jì)值；

4)放入水浴振蕩箱中進(jìn)行以萘作為碳源共代謝降解氯仿的代謝降解反應(yīng)。

所用培養(yǎng)基具體的成分為Na₂HPO₄·12H₂O 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，KNO₃ 0.5g/L,CaCl₂ 0.001g/L,微量元素1mL/L。

其中，所用的微量元素的化學(xué)組分為：FeCl₂·4H₂O 1.5g/L，CoC_l2·6H₂O 0.19g/L，MnSO₄ 7H₂O 0.1g/L，ZnCl₂ 0.07g/L，NiCl₂·6H₂O0.024g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.024g/L，MnCl₂·4H₂O 0.006g/L，CuCl₂·2H₂O 0.002g/L。

具體方法為：配制50mL培養(yǎng)基于120mL血清瓶中以Teflon丁基塞與鋁蓋雙重密封并對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，添加萘與氯仿，使得萘濃度為20mg/L，氯仿濃度為20μg/L；在紫外滅菌后的潔凈工作臺(tái)上以菌株MF-Ⅰ菌懸液進(jìn)行接種，以紫外分光光度儀在吸光度在600nm(OD₆₀₀)下進(jìn)行測(cè)量以表征生物量，調(diào)整生物量到設(shè)計(jì)值，放入溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min的恒溫水浴振蕩箱中進(jìn)行以萘作為碳源共代謝降解氯仿的代謝降解反應(yīng)。

如圖1所示，在兩個(gè)培養(yǎng)瓶中，一個(gè)培養(yǎng)瓶加入萘和氯仿，另一 個(gè)培養(yǎng)瓶中加萘和四氯化碳，兩個(gè)培養(yǎng)瓶中萘的濃度一致，氯仿和四氯化碳的濃度也一致，反應(yīng)一段時(shí)間后，觀察兩個(gè)培養(yǎng)瓶中不同物質(zhì)的剩余量。通過(guò)圖1可知，萘的去除率均大于95％，氯仿的去除率為42.6％，四氯化碳的去除率僅為7.26％，這是由于當(dāng)萘消耗完后，共代謝停止，符合共代謝原理，故選用以萘作為碳源共代謝降解氯仿。

本發(fā)明提供的MF-Ⅰ菌株在好氧條件下能夠以萘作為碳源，通過(guò)共代謝降解氯仿。對(duì)于同時(shí)受萘和氯仿污染的水體，該菌種能夠有效地降解萘和氯仿，達(dá)到修復(fù)污染水體目的。

試驗(yàn)例1菌株MF-Ⅰ對(duì)萘降解最佳條件的確定

以L₉(3⁴)正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)在120mL的頂空中進(jìn)行，其中包括50mL反應(yīng)體系及70mL頂空容量為菌株降解供氧。反應(yīng)體系中的各組分及反應(yīng)條件均按正交實(shí)驗(yàn)表調(diào)配及進(jìn)行，反應(yīng)瓶以Teflon丁基塞與鋁蓋雙重密封，Rpm＝150，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為36h。表1-1為正交實(shí)驗(yàn)因素及水平。

通過(guò)ANOVA方法就行統(tǒng)計(jì)分析。在表1-2中列出菌株MF-Ⅰ對(duì)于萘的最佳降解條件，菌株MF-Ⅰ在30℃，pH＝7.0，初始接種量為15％并且表面活性劑為SDS時(shí)，為最佳的反應(yīng)狀況。

表1-1萘的正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

表1-2萘的最佳降解條件

試驗(yàn)例2氯仿初始濃度對(duì)菌株MF-Ⅰ共代謝降解的影響

氯仿的初始濃度分別為0ug/L、10ug/L、20ug/L、30ug/L時(shí)，菌 株MF-Ⅰ對(duì)濃度為20mg/L濃度的萘的降解曲線如圖2所示；菌株MF-Ⅰ對(duì)于濃度分別為10ug/L、20ug/L、30ug/L的氯仿的降解曲線圖如圖3所示；菌株MF-Ⅰ在不同濃度的氯仿和濃度為20mg/L的萘的條件下的生長(zhǎng)曲線如圖4所示。

圖2顯示不同濃度的氯仿對(duì)于菌株MF-Ⅰ對(duì)萘的降解產(chǎn)生了一定影響。隨著氯仿濃度的升高，菌株對(duì)于萘的降解受到了一定的抑制，但其對(duì)于萘的降解率均在8小時(shí)內(nèi)到達(dá)95％以上。圖3顯示菌株MF-Ⅰ在碳源萘濃度為20mg/L時(shí)對(duì)不同濃度氯仿的共代謝，氯仿為10μg/L時(shí)，菌株MF-Ⅰ對(duì)于氯仿的共代謝降解率最高達(dá)到67.6％，而在30μg/L時(shí)，菌株MF-Ⅰ對(duì)于氯仿的共代謝降解率最低只為32.2％。由此可見(jiàn)氯仿的濃度對(duì)于菌株MF-Ⅰ共代謝氯仿有著較大影響。圖4為菌株MF-Ⅰ在20mg/L濃度的萘作為碳源的情況下，不同濃度的氯仿對(duì)于菌株的生長(zhǎng)曲線影響，氯仿的加入對(duì)菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制。隨著氯仿濃度的升高，其對(duì)菌株MF-Ⅰ的生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制增強(qiáng)。

綜上所述，菌株MF-Ⅰ對(duì)于受萘和氯仿共同污染的水體能夠起到很好的降解效果。在實(shí)際工程中受萘和氯仿共同污染的水體可以先經(jīng)過(guò)化學(xué)氧化或者物理方法預(yù)處理后，運(yùn)用該菌種作為后續(xù)處理工藝，可以達(dá)到很好的去除效果。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。