本發(fā)明屬于miRNA遞送載體生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于超小(小于10nm)金納米顆粒的表面改性得到的miRNA遞送載體，該載體負(fù)載miRNA后能夠進(jìn)入細(xì)胞，可以促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

背景技術(shù)：

作為具有功能的生物分子，miRNAs經(jīng)常被用于骨組織缺損再生及疾病治療(Stegen,S.；van Gastel,N.et al.Bone 2015,70,19-27；Li,Y.；Fan,L.et al.Biomaterials 2013,34,5048-58；Zhang,X.；Li,Y.et al.Nat.Commun.2016,7)。很多結(jié)果都表明可以遞送miRNA到組織再生區(qū)域和靶細(xì)胞。

但是，由于miRNA和細(xì)胞膜都擁有相同類型的電荷——負(fù)電荷，很難獨(dú)自穿過細(xì)胞膜。遞送miRNA經(jīng)常在體內(nèi)很快被降解(Kai,Z.S.；Pasquinelli,A.E.et al.Nat.Struct.Mol.Biol.2010,17,5-10)。因此，探索一種可以保護(hù)和遞送miRNA到靶細(xì)胞的高效低毒性的載體是非常必要的。病毒載體和脂質(zhì)體作為基因載體已經(jīng)被廣泛研究，但是仍然有研究表明它們有很多缺點(diǎn)比如免疫反應(yīng)以及在血液中并不穩(wěn)定(Bozzuto,G.；Molinari,A.Int.J.Nanomed.2015,10,975；Pattni,B.S.；Chupin,V.V.et al.Chem.Rev.2015,115,10938-10966)。并且，人工合成的陽離子PEI已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于在體內(nèi)和體外遞送miRNA進(jìn)入細(xì)胞(Yin,H.；Kanasty,R.L.et al.Nat.Rev.Genet.2014,15,541-555；Wang,W.；Li,W.et al.Curr.Pharm.Biotechno.2013,14,46-60)。但是，高分子量的PEI(25KD)在擁有良好的轉(zhuǎn)染能力的同時(shí)細(xì)胞毒性很強(qiáng)，低分子量的PEI(低于2KD)幾乎沒有細(xì)胞毒性但是轉(zhuǎn)染效率很低(Arote,R.；Kim,T.-H.et al.Biomaterials 2007,28,735-744；Xiong,M.P.；Forrest,M.L.et al.Biomaterials 2007,28,4889-4900)。探索出一種新的miRNA遞送體系，同時(shí)擁有高轉(zhuǎn)染效率，低細(xì)胞毒性已經(jīng)成為了組織再生和癌癥療法的研究熱點(diǎn)(Conde,J.；Edelman,E.R.et al.Adv.Drug Deliver.Rev.2015,81,169-183；Dong,H.；Dai,W.et al.ACS Appl.Mater.Inter.2015,7,11015-11023；Xinluan,W.；Yuxiao,L.et al.Curr.Pharm.Design 2015,21,1575-1583)。

金納米顆粒因?yàn)橐子谥苽?、大小及分布可控、有很好的生物相容性，并且容易表面功能化改性而被認(rèn)為是一種新興的無毒基因遞送載體(Ding,Y.；Jiang,Z.et al.Mol.Ther 2014,22,1075-1083；Almeida,J.P.M.；Figueroa,E.R.et al.Nanomed-Nanotechnol.2014,10,503-514；Austin,L.A.；Mackey,M.A.et al.Arch.Toxicol.2014,88,1391-1417)。金納米顆粒已經(jīng)非常成功地運(yùn)用保護(hù)和遞送基因包括DNA，siRNA和miRNA(Ghosh,R.；Singh,L.C.et al.Biomaterials 2013,34,807-816；Wang,H.；Jiang,Y.et al.Adv.Drug Deliver.Rev.2015,81,142-160；Bishop,C.J.；Tzeng,S.Y.et al.Acta Biomater.2015,11,393-403)。然而用于基因遞送的一般的金納米顆粒大于10nm會累積在不同的組織中，很難經(jīng)腎臟清除出去，可能會引起長期毒性(Longmire,M.；Choyke,P.L.et al.Nanomedicine 2008,3,703-717；Wang,B.；He,X.；et al.Accounts of chemical research 2013,46,761-769.Karmali,P.P.；Simberg,D.Expert opinion on drug delivery 2011,8,343-357)。目前用金納米顆粒制備miRNA遞送載體的方法為化學(xué)接枝方法，但是該方法具有反應(yīng)溫度高、時(shí)間長和副反應(yīng)嚴(yán)重等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體及其制備方法和應(yīng)用，該載體中金納米顆粒的粒徑小于10nm，不會產(chǎn)生腎臟毒性，而且其制備方法采用逐層組裝的方法，具有方便簡單，可控性高等優(yōu)點(diǎn)，并且該載體與miRNA負(fù)載后可被細(xì)胞內(nèi)吞，可以促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體，該miRNA遞送載體以粒徑小于10nm的超小金納米顆粒為核，在核表面組裝有聚乙烯亞胺或脂質(zhì)體，或者在核表面由內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的制備方法，包括以下步驟：

1)超小金納米顆粒的制備

按照(0.2～1.5):(0.2～1.2)的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，攪拌條件下加入硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5～12h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到粒徑小于10nm的超小金納米顆粒；其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為(12～30):(0.5～1.3)；

2)超小金納米顆粒的改性

將步驟1)制得的超小金納米顆粒溶解在pH＝9～14的氫氧化鈉溶液中，加入16-巰基十六烷基酸，室溫下攪拌反應(yīng)10～14小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、洗滌，再用水重懸得到改性后的超小金納米顆粒，然后將改性后的超小金納米顆粒重懸在磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為(0.2～1.5):(0.3～1.8)；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝

按體積比為(1～3):(2～45)向超小金納米顆粒的重懸液中加入聚乙烯亞胺，在30～40℃混合20～60分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為(1～10):(2～10)向超小金納米顆粒的重懸液中加入脂質(zhì)體，在30～40℃混合20～60分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為(0.2～1.5):(0.3～1.4)將Au@PEI和Au@Lipo在30～40℃混合20～60分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；其中符號A@B表示B組裝在A表面；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

所述步驟1)的反應(yīng)液中氯金酸的濃度為2～5mmol/L，檸檬酸的濃度為2～8mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.04～0.12mol/L。

所述步驟2)中將每0.01～0.05mmol的超小金納米顆粒溶解在15～30mL氫氧化鈉溶液中，將每0.5～1.2mmol的改性后的超小金納米顆粒重懸在2～5mL pH值為7.0～8.5的磷酸鹽緩沖溶液中。

所述步驟3)中聚乙烯亞胺的濃度為0.5～5mg/L，脂質(zhì)體的濃度為0.5～5mg/L，逐層組裝在Opti-Mem培養(yǎng)基(Thermo Fisher)中進(jìn)行。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA的方法，其具體步驟為：按體積比為(20～50):(0.8～3.5)將基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體與miRNA溶液在30～40℃的Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并在孵育20～60分鐘，然后離心，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miRNA；其中miRNA溶液的濃度為0.1～1.5mg/mL。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體作為將miRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)部的載體的應(yīng)用。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體與miRNA負(fù)載后阻止miRNA被血清中的酶降解方面的應(yīng)用。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體與miRNA負(fù)載后促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化方面的應(yīng)用。

所述的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體與miRNA負(fù)載后提高細(xì)胞成骨分化基因表達(dá)方面的應(yīng)用，所述的細(xì)胞成骨分化基因?yàn)锳lp、Runx2、Ocn和Sox9。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體，以粒徑小于10nm的超小金納米顆粒為核，在核表面組裝有聚乙烯亞胺或脂質(zhì)體，或者在核表面由內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體。該載體中金納米顆粒的粒徑小于10nm，不會產(chǎn)生腎臟毒性，并且該載體具有良好的細(xì)胞相容性，能夠提高miRNA的遞送效率，該載體與miRNA負(fù)載后可被細(xì)胞內(nèi)吞，可以促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

本發(fā)明提供的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的制備方法，采用逐層組裝的方法，在超小金納米顆粒表面組裝有聚乙烯亞胺或脂質(zhì)體，或者在超小金納米顆粒表面由內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體，得到基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。該方法能夠增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，降低PEI的毒性，并且能夠充分應(yīng)用超小金納米顆粒的優(yōu)勢。與現(xiàn)有的化學(xué)接枝方法來固定miRNA相比，本發(fā)明的逐層組裝法具有很多的優(yōu)點(diǎn)，比如方便簡單、可控性高等。

本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體易于制備，制得的該載體溶液檢測出zeta電勢為正的32mV和37.5mV，便于miRNA等帶負(fù)電荷的生物分子與其結(jié)合。

(2)本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體，使用逐層組裝的方式，使得其負(fù)載的miRNA穩(wěn)定性高。在3h左右觀察發(fā)現(xiàn)，裸miRNA已經(jīng)沒有完整的miRNA分子存在。而基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA后，即使在血清環(huán)境中也能存在較長時(shí)間，在24h后，仍有超過80％的完整miRNA穩(wěn)定存在。

(3)本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的遞送效率較高，48h時(shí)，已有67.87％的細(xì)胞轉(zhuǎn)染入Au@Lipo負(fù)載的miRNA，35.54％的細(xì)胞轉(zhuǎn)入Au@PEI@Lipo負(fù)載的miRNA，比單純用脂質(zhì)體(Lipo)遞送miRNA組的27.42％高很多。

(4)本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體具有很好的生物相容性，在24h左右，用本發(fā)明的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體遞送miRNA組比單純用聚乙烯亞胺(PEI)遞送miR組和單純用脂質(zhì)體(Lipo)遞送miRNA組的細(xì)胞相容性高很多，表明本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體對細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)。

(5)本發(fā)明制得的逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體將miR-5106遞送至細(xì)胞內(nèi)后，能顯著促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞很好地分化為類成骨細(xì)胞，成骨相關(guān)標(biāo)記基因Alp、Runx2和Ocn的表達(dá)量較其他組上調(diào)明顯。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA之后的力學(xué)性能表征圖，其中a是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的透射電鏡表征；b是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的顆粒大小表征；c是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的UV-vis紫外光譜表征；d是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的zeta點(diǎn)位分析圖；e是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的凝膠電泳阻滯圖；f是結(jié)合miRNA后基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的血清穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合熒光標(biāo)記的miRNAs后轉(zhuǎn)染效率表征圖，其中a是BMSCs轉(zhuǎn)染miRNAs后熒光共聚焦圖片；b是BMSCs轉(zhuǎn)染miRNAs后miRNAs表達(dá)量的圖；c是流式細(xì)胞表征圖；d是流式細(xì)胞結(jié)果的定量圖。

圖3是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miR-5106后細(xì)胞活性評價(jià)圖，其中a是轉(zhuǎn)染miR-5106后1-7天細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)圖；b是轉(zhuǎn)染miR-5106后24小時(shí)live/dead染色圖。

圖4是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miR-5106后BMSCs的ALP活性、鈣礦化的表征圖，其中a是7天、14天、21天的BMSCs的alp活性數(shù)據(jù)圖；b-c是轉(zhuǎn)染miR-5106后BMSCs茜素紅染色圖；d是14天和21天鈣含量檢測數(shù)據(jù)圖。

圖5是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miR-5106后BMSCs的成骨分化相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)量的檢測圖，其中a是Alp；b是Runx2；c是Ocn；d是Sox9。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，其中聚乙烯亞胺以PEI 25KD、LIPO以lipofectamine^TM 2000、miRNA以小鼠miR-5106為代表說明，以@表明逐層組裝的過程，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

本發(fā)明提供了一種表面改性的超小金納米粒子負(fù)載miR-5106及其促進(jìn)骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的應(yīng)用，將miR-5106用改性過的超小金納米離子負(fù)載及轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞后，可研究miR-5106對骨組織來源基質(zhì)多能細(xì)胞成骨相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。

本發(fā)明中將超小金納米顆粒表面改性并逐層組裝PEI和脂質(zhì)體用于miRNA遞送，發(fā)現(xiàn)這種金包裹PEI包裹脂質(zhì)體的納米體系可以展現(xiàn)出好的細(xì)胞相容性(相比于PEI)，提高miR-5106的遞送效率(相比于脂質(zhì)體)并且顯著提高BMSCs的成骨分化能力。

實(shí)施例1

1)超小金納米顆粒的制備：按照1:0.9的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，劇烈攪拌并快速滴加入新鮮制備的的硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到大小在8nm左右的檸檬酸封端的超小金納米顆粒。其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為22.5:1，反應(yīng)液中氯金酸的濃度為4mmol/L，檸檬酸的濃度為3.6mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.09mol/L。

2)超小金納米顆粒的改性：將步驟1)制得的0.04mmol的超小金納米顆粒溶解在pH＝10的15mL氫氧化鈉溶液中，加入0.036mmol 16-巰基十六烷基酸(MHA)，室溫下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、用水洗滌、再離心，然后用水重懸，得到MHA改性后的羧基封端的超小金納米顆粒，然后將0.5mmol改性后的超小金納米顆粒重懸在pH＝7.0的2mL磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為1:0.9；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝：按體積比為1:2向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為1mg/L的聚乙烯亞胺(PEI)，在32℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合40分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為1:2向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為1mg/L的脂質(zhì)體(Lipo)，在32℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合40分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為0.3:0.5將Au@PEI和Au@Lipo在32℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合40分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

4)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA：按體積比為50:2分別將3種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo與濃度為1mg/mL的miR-5106溶液在32℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并孵育40分鐘，然后12000rpm離心30分鐘，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miR-5106；得到Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106。

實(shí)施例2

1)超小金納米顆粒的制備：按照0.2:0.2的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，劇烈攪拌并快速滴加入新鮮制備的的硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到大小在9nm左右的檸檬酸封端的超小金納米顆粒。其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為12:0.6，反應(yīng)液中氯金酸的濃度為2mmol/L，檸檬酸的濃度為2mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.04mol/L。

2)超小金納米顆粒的改性：將步驟1)制得的0.01mmol的超小金納米顆粒溶解在pH＝9的20mL氫氧化鈉溶液中，加入0.015mmol 16-巰基十六烷基酸(MHA)，室溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、用水洗滌、再離心，然后用水重懸，得到MHA改性后的羧基封端的超小金納米顆粒，然后將0.6mmol改性后的超小金納米顆粒重懸在pH＝7.5的3mL磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為0.2:0.3；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝：按體積比為1.5:5向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為0.5mg/L的聚乙烯亞胺(PEI)，在30℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合60分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為2:3向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為0.5mg/L的脂質(zhì)體(Lipo)，在30℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合60分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為0.2:0.3將Au@PEI和Au@Lipo在30℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合60分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

4)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA：按體積比為20:0.8分別將3種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo與濃度為0.1mg/mL的miR-5106溶液在30℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并孵育60分鐘，然后12000rpm離心30分鐘，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miR-5106；得到Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106。

實(shí)施例3

1)超小金納米顆粒的制備：按照0.625:1的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，劇烈攪拌并快速滴加入新鮮制備的的硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到大小在10nm左右的檸檬酸封端的超小金納米顆粒。其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為30:1.25，反應(yīng)液中氯金酸的濃度為5mmol/L，檸檬酸的濃度為8mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.12mol/L。

2)超小金納米顆粒的改性：將步驟1)制得的0.02mmol的超小金納米顆粒溶解在pH＝11的25mL氫氧化鈉溶液中，加入0.02mmol 16-巰基十六烷基酸(MHA)，室溫下攪拌反應(yīng)11小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、用水洗滌、再離心，然后用水重懸，得到MHA改性后的羧基封端的超小金納米顆粒，然后將0.8mmol改性后的超小金納米顆粒重懸在pH＝8.0的4mL磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為0.7:0.7；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝：按體積比為3:45向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為2mg/L的聚乙烯亞胺(PEI)，在40℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合20分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為10:8向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為2mg/L的脂質(zhì)體(Lipo)，在40℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合20分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為1.5:1.4將Au@PEI和Au@Lipo在40℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合20分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

4)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA：按體積比為40:3.5分別將3種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo與濃度為0.5mg/mL的miR-5106溶液在40℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并孵育20分鐘，然后12000rpm離心30分鐘，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miR-5106；得到Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106。

實(shí)施例4

1)超小金納米顆粒的制備：按照1.5:1的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，劇烈攪拌并快速滴加入新鮮制備的的硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到大小在8.5nm左右的檸檬酸封端的超小金納米顆粒。其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為18:0.5，反應(yīng)液中氯金酸的濃度為3mmol/L，檸檬酸的濃度為2mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.108mol/L。

2)超小金納米顆粒的改性：將步驟1)制得的0.03mmol的超小金納米顆粒溶解在pH＝12的30mL氫氧化鈉溶液中，加入0.036mmol 16-巰基十六烷基酸(MHA)，室溫下攪拌反應(yīng)13小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、用水洗滌、再離心，然后用水重懸，得到MHA改性后的羧基封端的超小金納米顆粒，然后將1mmol改性后的超小金納米顆粒重懸在pH＝8.5的5mL磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為1.5:1.8；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝：按體積比為2.5:30向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為3mg/L的聚乙烯亞胺(PEI)，在37℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合30分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為5:6向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為3mg/L的脂質(zhì)體(Lipo)，在37℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合30分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為1:1將Au@PEI和Au@Lipo在37℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合30分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

4)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA：按體積比為30:1分別將3種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo與濃度為1.5mg/mL的miR-5106溶液在37℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并孵育30分鐘，然后12000rpm離心30分鐘，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miR-5106；得到Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106。

實(shí)施例5

1)超小金納米顆粒的制備：按照0.8:1.2的摩爾比將氯金酸與檸檬酸加入去離子水中，劇烈攪拌并快速滴加入新鮮制備的的硼氫化鈉溶液，得到反應(yīng)液，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后，對反應(yīng)體系離心、用水重懸，得到大小在9.5nm左右的檸檬酸封端的超小金納米顆粒。其中加入的硼氫化鈉溶液中的硼氫化鈉與氯金酸的摩爾比為26:1.3，反應(yīng)液中氯金酸的濃度為3.5mmol/L，檸檬酸的濃度為5.25mmol/L，硼氫化鈉的濃度為0.07mol/L。

2)超小金納米顆粒的改性：將步驟1)制得的0.05mmol的超小金納米顆粒溶解在pH＝14的18mL氫氧化鈉溶液中，加入0.0625mmol 16-巰基十六烷基酸(MHA)，室溫下攪拌反應(yīng)14小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，離心、用水洗滌、再離心，然后用水重懸，得到MHA改性后的羧基封端的超小金納米顆粒，然后將1.2mmol改性后的超小金納米顆粒重懸在pH＝7.8的3.5mL磷酸鹽緩沖液中，得到超小金納米顆粒的重懸液；其中超小金納米顆粒與16-巰基十六烷基酸的摩爾比為1.2:1.5；

3)超小金納米顆粒的逐層組裝：按體積比為2:15向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為5mg/L的聚乙烯亞胺(PEI)，在35℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合35分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有聚乙烯亞胺的超小金納米顆粒載體，記為Au@PEI；按體積比為8:10向超小金納米顆粒的重懸液中加入濃度為5mg/L的脂質(zhì)體(Lipo)，在35℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合35分鐘進(jìn)行逐層組裝，得到表面組裝有脂質(zhì)體的超小金納米顆粒載體，記為Au@Lipo；再按照體積比為0.8:1.2將Au@PEI和Au@Lipo在35℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合35分鐘進(jìn)行第二次逐層組裝，得到超小金納米顆粒表面從內(nèi)到外依次組裝有聚乙烯亞胺和脂質(zhì)體的載體，記為Au@PEI@Lipo；得到的Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo即為基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體。

4)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA：按體積比為35:1.5分別將3種基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo與濃度為0.8mg/mL的miR-5106溶液在35℃Opti-Mem培養(yǎng)基中混合并孵育35分鐘，然后12000rpm離心30分鐘，再用新鮮的Opti-MEM培養(yǎng)基重懸，即在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的表面負(fù)載上了miR-5106；得到Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106。

本發(fā)明中將制得的逐層組裝好的Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染并檢測細(xì)胞毒性及成骨分化的效率。具體進(jìn)行了以下檢測：

(1)透射電子顯微鏡。測定負(fù)載miR-5106與未負(fù)載miR-5106的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的粒徑大小是否不同。顆粒大小測定需要取TEM圖片中50個(gè)基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體做測定；

(2)zeta電勢測定。用動態(tài)光散射儀器測定負(fù)載miR-5106與未負(fù)載miR-5106的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的zeta電勢是否不同。

(3)UV-vis紫外測定。測定負(fù)載miR-5106與未負(fù)載miR-5106的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的紫外圖譜是否有峰的變化。

(4)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。測定負(fù)載miR-5106與未負(fù)載miR-5106的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體在凝膠中體現(xiàn)在條帶的變化。

將制好的Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106及miR-5106、PEI～miR-5106、Lipo～miR-5106一起進(jìn)行凝膠阻滯電泳。將這些混合溶液震蕩10秒，加6×loading buffer在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳20分鐘(115V)。

(5)血清穩(wěn)定性測試。按體積比為1:4將胎牛血清和得到的Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106混合，然后放入37℃水浴鍋孵育，并按照不同時(shí)間取樣(0、0.25、0.5、1、3、6、12和24h)，加入1μL RNase抑制劑放于-20度冰箱保存。所有樣品取樣結(jié)束后，加入肝素鈉在32℃水浴鍋孵育1h進(jìn)行miRNA的競爭性釋放。將處理好的樣品進(jìn)行4％瓊脂糖凝膠(115V)電泳20min。

(6)在細(xì)胞培養(yǎng)孔板中接種骨髓來源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，濃度為1×10⁴細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37℃-5％CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為alpha-MEM+20％FBS。接種細(xì)胞后24h，細(xì)胞用PBS洗3次，加入100μg/mL Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106到培養(yǎng)板中。在1、3、5、7天時(shí)，分別加入10％的Alamar blue進(jìn)行細(xì)胞增殖活性的測定，使用Spectramax^@熒光讀數(shù)比較細(xì)胞增殖狀態(tài)。在1天時(shí)，同時(shí)做每組樣品的live/dead染色45min，用PBS洗2次，用IX53倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞死活狀態(tài)。

(7)在Opti-MEM環(huán)境中轉(zhuǎn)染制得的Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106，同時(shí)以NC、PEI～miR-5106、Lipo～miR-5106作為對照。在細(xì)胞培養(yǎng)孔板中接種骨髓來源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，濃度為1×10⁴細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37℃-5％CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為alpha-MEM+20％FBS。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的效率，使用FAM標(biāo)記過的miR-5106。細(xì)胞被轉(zhuǎn)染后24h后換液，換為新鮮的alpha-MEM+20％FBS培養(yǎng)液。用IX53倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光比例。

在細(xì)胞被轉(zhuǎn)染48h后收樣，用PBS洗3次，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，用含有2％FBS的PBS洗一遍細(xì)胞，再用新的2％FBS的PBS重懸細(xì)胞，加入4％多聚甲醛(PFA)固定細(xì)胞，2h后用CytExpert流式細(xì)胞儀檢測陽性(綠色熒光)比例。

(8)檢測miR-5106誘導(dǎo)細(xì)胞的堿性磷酸酶(Alp)活性。在細(xì)胞培養(yǎng)孔板中接種骨髓來源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，濃度為2×10⁴細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)條件是37℃-5％CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基為alpha-MEM+20％FBS。細(xì)胞轉(zhuǎn)染入制得的Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106，同時(shí)以NC、PEI～miR-5106、Lipo～miR-5106為對照。在第7、14、21天時(shí)，消化離心收集細(xì)胞。細(xì)胞用PBS洗2次，用裂解液裂解細(xì)胞。離心后，細(xì)胞上清液用pNPP試劑盒，Spectramax^@酶標(biāo)儀405nm讀數(shù)測定Alp含量。

(9)鈣含量及細(xì)胞外基質(zhì)礦化檢測。

在上述實(shí)驗(yàn)(8)中BMSCs誘導(dǎo)分化14天及21天時(shí)，細(xì)胞用PBS洗2次，用alizarin red染色試劑盒固定及染色來檢測細(xì)胞外基質(zhì)礦化情況。

在上述實(shí)驗(yàn)(8)中BMSCs誘導(dǎo)分化14天及21天時(shí)，細(xì)胞用PBS洗2次，胰酶消化離心后，用ddH₂O重懸細(xì)胞，加入鈣染色試劑盒中的染色試劑來檢測細(xì)胞中鈣含量。Spectramax^@酶標(biāo)儀610nm讀數(shù)測定鈣含量。

(10)定量PCR檢測成骨相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)。在3、7、14、21天時(shí)，用Trizol收集細(xì)胞，提RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后做定量PCR反應(yīng)，加入相應(yīng)的引物，檢測miR-5106、Alp、Runx2、Ocn、Opn、Sox9等基因的表達(dá)情況。

通過上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所制備的超小金納米顆粒大小均勻，在8nm左右，其結(jié)合miRNA的能力隨著與PEI，Lipo等逐層組裝而增加。并且在負(fù)載miRNA前，Au@PEI、Au@Lipo和Au@PEI@Lipo的細(xì)胞毒性較??；負(fù)載miRNA后，Au@PEI@Lipo～miR-5106的促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的能力很好，下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)詳細(xì)分析。

圖1是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載miRNA之后的力學(xué)性能表征圖。其中a是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的TEM圖片，可以看出基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的大小均勻，分散性很好；結(jié)合miRNA后的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體有集中的趨勢，并且外層有類似薄膜的物質(zhì)。b是TEM檢測的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA前后的顆粒大小分布圖，可以看出結(jié)合miRNA后，基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的大小并沒有顯著性增加。c是UV-VIS檢測分布圖，可以看出結(jié)合miRNA后的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的峰有向右紅移的趨勢。d是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的zeta電勢水合粒徑的分布圖，可以看出結(jié)合miRNA之后，基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的zeta電勢有顯著性提升。有助于細(xì)胞轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞膜。e是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA后的凝膠阻滯圖，可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合miRNA之后，膠上已看不出miRNA的條帶，可能是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體較大，miRNA被包裹在基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的內(nèi)部，不能經(jīng)染料染色。f是結(jié)合miRNA后基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體的血清穩(wěn)定性試驗(yàn)，從圖中可以看出，裸miRNA在加入25％FBS后，在大約1小時(shí)的時(shí)候已經(jīng)被降解完全，而經(jīng)過逐層組裝的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體可以保護(hù)miRNA不被血清中的酶降解，這樣基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體負(fù)載的miRNA就更加穩(wěn)定，適合進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

圖2是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體結(jié)合miRNA后轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。其中a是FAM標(biāo)記的miR-5106被各種復(fù)合物轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞48h后拍攝的共聚焦顯微圖片，可以看出，經(jīng)過逐層組裝后的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體可以很好地遞送miRNA，并且能將miRNA遞送進(jìn)細(xì)胞核周圍的區(qū)域。b是miR-5106轉(zhuǎn)染后的定量PCR檢測結(jié)果，可以看出通過基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體遞送的組，miR-5106隨著時(shí)間的增加呈現(xiàn)表達(dá)量增加的趨勢。c-d是流式細(xì)胞儀檢測基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體遞送miRNA熒光表達(dá)情況，可以看出Au@Lipo～miR-5106組的熒光值最高，Au@PEI@Lipo～miR-5106組也較Lipo～miR-5106組更好。

圖3是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miR-5106后的細(xì)胞增殖活性檢測。其中a是alamar blue檢測，從圖中可以看出，PEI對于細(xì)胞的增殖影響較大，而其他基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體對細(xì)胞增殖影響不大，毒性可以忽略。b是24小時(shí)live/dead細(xì)胞死活染色圖，從圖中可以看出，Au@PEI～miR-5106、Au@Lipo～miR-5106和Au@PEI@Lipo～miR-5106組的細(xì)胞死亡較少。

圖4是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miR-5106后的細(xì)胞體外Alp活性、礦化及鈣含量檢測。其中a是7天、14天、21天的BMSCs的alp活性數(shù)據(jù)圖；b-c是轉(zhuǎn)染miR-5106后BMSCs茜素紅染色圖；d是14天和21天鈣含量檢測數(shù)據(jù)圖。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，Au@PEI～miRNA組在細(xì)胞成骨分化中作用明顯，鈣礦化的程度更明顯(顏色較深)，鈣含量檢測也與Alp活性檢測結(jié)果一致。

圖5是基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體轉(zhuǎn)染miRNA后的細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因的檢測。a-d分別是基因Alp、Runx2、Ocn、Sox9的表達(dá)，可以發(fā)現(xiàn)，Sox9作為miR-5106的靶基因，有隨著miRNA表達(dá)量增加而增加的趨勢，而且與成骨分化相關(guān)的基因都表達(dá)量較高。

通過上述實(shí)驗(yàn)可以看出，本發(fā)明中制備的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體，其制備過程簡單，無有機(jī)溶劑殘留，具有均勻的顆粒大小，細(xì)胞毒性很?。荒軌虺晒f送miRNA，并能顯著地促進(jìn)骨組織來源間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化。本發(fā)明的基于超小金納米顆粒的miRNA遞送載體在骨組織工程、藥物遞送和轉(zhuǎn)運(yùn)有著很好的應(yīng)用前景。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。