多功能納米顆粒設(shè)計(jì)和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于裝配和實(shí)施具有空芯和可密封孔的納米顆粒的方法、結(jié)構(gòu)、裝置以及系統(tǒng)。在一方面，納米顆粒裝置可以包括殼結(jié)構(gòu)和在中空內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包含的物質(zhì)，該殼結(jié)構(gòu)包括至少兩層，所述至少兩層包括內(nèi)層和外層，該內(nèi)層被構(gòu)造成封閉中空內(nèi)部區(qū)域且包括一個(gè)或多個(gè)貫穿內(nèi)層的孔，該外層為多孔材料且在內(nèi)層周圍形成并密封一個(gè)或多個(gè)孔，所述物質(zhì)不能穿過該外層。
【專利說明】多功能納米顆粒設(shè)計(jì)和應(yīng)用
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求于2011年4月14日提交的第61/475，649號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，前述專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過援引并入本文作為本申請(qǐng)的公開的一部分。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究或研發(fā)的聲明
[0004]在國(guó)立衛(wèi)生研究院所給予的政府支持下(批號(hào)CA119335)進(jìn)行本發(fā)明。政府對(duì)本發(fā)明擁有某些權(quán)利。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本專利文件涉及納米技術(shù)。
[0006]發(fā)明背景
[0007]納米技術(shù)提供了用于裝配以分子尺度或原子尺度為特征的結(jié)構(gòu)、裝置和系統(tǒng)的技術(shù)或方法，例如在一些應(yīng)用中的一納米至數(shù)百納米的結(jié)構(gòu)。例如，納米尺度的裝置可以配置為尺寸比人細(xì)胞小100倍至1，000倍，例如，與一些諸如酶和受體的大生物學(xué)分子(生物分子)的尺寸相近。納米尺寸的材料用于創(chuàng)建納米結(jié)構(gòu)、納米裝置或納米系統(tǒng)，其可以展現(xiàn)出以較大尺寸按比例縮放的相同材料中不存在的多種獨(dú)特形式，并且可以開發(fā)此類性質(zhì)以用于廣泛的應(yīng)用。
[0008]發(fā)明概述
[0009]描述了用于裝配和實(shí)施納米結(jié)構(gòu)或納米顆粒的技術(shù)、系統(tǒng)和裝置，所述納米結(jié)構(gòu)或納米顆粒包括空芯和可密封孔。
[0010]在所公開的技術(shù)的一方面，裝配顆粒的方法包括將芯顆粒與一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒組合以形成模板，其中一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒與芯顆粒結(jié)合并且覆蓋芯顆粒表面的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中每一個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒中每一個(gè)掩蔽顆粒與芯顆粒之間所形成的表面區(qū)域，在模板之上形成多孔材料層，其中該層形成在除已覆蓋的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之外的芯顆粒的表面之上，以及移除模板以產(chǎn)生由多孔材料形成的顆粒，該顆粒具有一個(gè)或多個(gè)在中空的內(nèi)部區(qū)域與顆粒的外表面之間延伸的孔，所述一個(gè)或多個(gè)孔在外表面上具有基本為所述表面區(qū)域尺寸的尺寸，并且分布在顆粒上的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
[0011]實(shí)施可以任選地包括下列特征中的一個(gè)或多個(gè)。例如，方法還可以包括將物質(zhì)通過一個(gè)或多個(gè)孔裝載入顆粒的內(nèi)部區(qū)域，該物質(zhì)不能穿過多孔材料，以及在顆粒之上形成允許所選顆粒穿過的外部多孔層，其中外部多孔層密封顆粒的一個(gè)或多個(gè)孔，從而將物質(zhì)封閉在顆粒內(nèi)。
[0012]在另一方面，用于運(yùn)載負(fù)荷的納米顆粒裝置包括殼結(jié)構(gòu)，該殼結(jié)構(gòu)包括至少兩層，所述至少兩層包括內(nèi)層和外層，內(nèi)層被構(gòu)造為封閉中空內(nèi)部區(qū)域并且包括一個(gè)或多個(gè)貫穿內(nèi)層的孔，外層在內(nèi)層周圍形成，其中殼結(jié)構(gòu)包括在中空內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的物質(zhì)，該物質(zhì)已通過一個(gè)或多個(gè)孔進(jìn)入殼結(jié)構(gòu)并且不能穿過外層。
[0013]在另一方面，納米顆粒裝置包括:殼結(jié)構(gòu)，殼結(jié)構(gòu)被構(gòu)造為包括在中空內(nèi)部區(qū)域與殼結(jié)構(gòu)的外表面之間延伸的一個(gè)或多個(gè)孔；以及至少一個(gè)中心顆粒，其包含于內(nèi)部區(qū)域內(nèi)并具有比一個(gè)或多個(gè)孔中每一個(gè)孔的尺寸更大的尺寸，其中一個(gè)或多個(gè)孔被構(gòu)造為接收進(jìn)入內(nèi)部區(qū)域的物質(zhì)，并且該物質(zhì)與至少一個(gè)中心顆粒結(jié)合。
[0014]在另一方面，裝配顆粒的方法包括將芯顆粒與一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒組合以形成模板，其中一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒與芯顆粒結(jié)合并且覆蓋芯顆粒表面的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，該一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中每一個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于在一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒中每一個(gè)掩蔽顆粒與芯顆粒之間所形成的表面區(qū)域，在模板之上形成層，其中該層形成在除已覆蓋的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之外的芯顆粒的表面之上，以及移除模板以產(chǎn)生具有一個(gè)或多個(gè)在中空內(nèi)部區(qū)域與外表面之間延伸的孔的殼結(jié)構(gòu)，該一個(gè)或多個(gè)孔在外表面上具有基本為所述表面區(qū)域尺寸的尺寸，并且分布在殼結(jié)構(gòu)上的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域。
[0015]實(shí)施可以任選地包括下列特征中的一個(gè)或多個(gè)。例如，方法還可以包括將物質(zhì)通過一個(gè)或多個(gè)孔裝載入殼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域，并且在殼結(jié)構(gòu)之上形成外部層，其中外部層密封殼結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)孔并且將所述物質(zhì)封閉在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)。
[0016]在另一方面，納米顆粒裝置包括殼結(jié)構(gòu)和物質(zhì)，該殼結(jié)構(gòu)包括至少兩層，所述至少兩層包括內(nèi)層和外層，內(nèi)層被構(gòu)造為封閉中空內(nèi)部區(qū)域并且包括一個(gè)或多個(gè)貫穿內(nèi)層的孔，外層為多孔材料且在內(nèi)層周圍形成并密封所述一個(gè)或多個(gè)孔，所述物質(zhì)包含在空芯內(nèi)部區(qū)域內(nèi)且不能穿過外層。
[0017]可以以特定方式實(shí)施本專利文件中所述的主題，所述方式提供了下列特征中的一個(gè)或多個(gè)。例如，所公開的納米和微觀結(jié)構(gòu)可以包括具有中空內(nèi)部的可密封孔的納米顆粒，所述可密封孔可以封裝在中空區(qū)域內(nèi)包含的其他物質(zhì)。例如，示例的具有可密封孔的中空納米顆粒還可以包括允許所選顆?；蛭镔|(zhì)傳輸而不允許所封裝的物質(zhì)傳輸?shù)目紫?。描述了用于裝配所公開的納米顆粒(例如，示例的中空多孔納米顆粒(HPNP))的示例性方法，所述方法例如利用各種材料在納米顆粒的尺寸和滲透性方面提供精確的控制和柔韌性。所述的納米和微觀結(jié)構(gòu)包括示例的特征，包括例如高表征表面區(qū)域和能夠裝載物質(zhì)的中空內(nèi)部，這可使得實(shí)施能用于廣泛的應(yīng)用，例如包括納米醫(yī)學(xué)、催化作用、光學(xué)、廢棄物排除以及諸多其他應(yīng)用。所公開的納米和微觀結(jié)構(gòu)可以應(yīng)用于醫(yī)療診斷、監(jiān)控和治療，例如前物-酶治療、酶或基因遞送以及傳感器應(yīng)用。示例性納米醫(yī)學(xué)應(yīng)用可以包括藥物、生物分子和化學(xué)品的控制釋放，生物分子和生物活性物質(zhì)的免疫分離和防護(hù)，建造光子晶體模塊，以及廢棄物質(zhì)的排除。例如，一個(gè)或多個(gè)大分子或大分子系統(tǒng)可以被封裝在示例性HPNP中，然后被密封，例如，形成密封的中空多孔納米顆粒(SHPNP)，此后，示例性大分子仍然可以與環(huán)境保持連通，例如，經(jīng)由可通過SHPNP的孔隙出入的小分子。
[0018]在一利用所公開技術(shù)的應(yīng)用的實(shí)例中，封裝在示例性SHPNP中的示例性大分子可以為能夠信號(hào)傳導(dǎo)諸如PH變化的特定事件的發(fā)生的分子。當(dāng)環(huán)境中的pH改變時(shí)，可以通過示例性封裝的大分子檢測(cè)到PH變化，例如，由于離子可以穿過示例性SHPNP的孔隙。例如，在這種配置中，沒有將用于檢測(cè)PH變化的示例性大分子引導(dǎo)到環(huán)境中，因此不能激活任何免疫反應(yīng)。類似地，示例性SHPNP可以用于不同的應(yīng)用，例如，其中所封裝的結(jié)構(gòu)為酶。例如，酶可以被封裝在SHPNP中并且用于激活藥物分子，例如酶一旦與藥物分子結(jié)合就激活，否則就失活。使示例性酶在示例性SHPNP內(nèi)以免于免疫系統(tǒng)，并且示例性SHPNP的外部可以與靶向劑結(jié)合以實(shí)現(xiàn)與環(huán)境內(nèi)的靶位點(diǎn)特異性結(jié)合。一旦具有封裝的酶的示例性SHPNP被遞送到靶位點(diǎn)(例如，腫瘤)，就可以將失活的藥物引入到有機(jī)體的血流中(例如，因?yàn)樗幬锸鞘Щ畹?，所以沒有藥物劑量的限制)。另外，例如，因?yàn)樗幬餅樾☆w粒，因此它可以擴(kuò)散到許多與靶位點(diǎn)有關(guān)的區(qū)域。然而，只有在具有封裝示例性酶的SHPNP的區(qū)域處才可以激活藥物，例如，該SHPNP可以靶向于特定位點(diǎn)或區(qū)域。因此，在這一實(shí)例中，藥物只有在靶位點(diǎn)被激活，例如，通過穿過SHPNP孔隙并且與封裝的酶相互作用(例如，激活藥物)，然后通過SHPNP孔隙穿出以治療腫瘤。例如，經(jīng)由所公開的納米顆粒的藥物遞送可以用于提供穩(wěn)定性、延長(zhǎng)的循環(huán)以及靶向。在其他實(shí)例中，封裝的負(fù)荷可以包括負(fù)責(zé)激活某些機(jī)制的蛋白、其他的納米顆粒、和/或毒性物質(zhì)，例如，其免于示例性SHPNP所布置的生物環(huán)境。
[0019]附圖簡(jiǎn)述
[0020]圖1A-1C示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0021]圖2A-2B示出了示例性納米顆粒合成方案的流程圖。
[0022]圖3示出了示例性透射電子顯微鏡(TEM)圖像，該圖像示出示例性中空多孔納米顆粒的結(jié)構(gòu)特性。
[0023]圖4示出了掃描電子顯微照相(SEM)圖像，該圖像展示了對(duì)示例性中空納米顆粒特征的合成自由度。
[0024]圖5A和5B示出了示例性聚集體和所得中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0025]圖5C示出了示例性未密封的和密封的中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0026]圖6示出了利用所公開的密封的中空多孔納米顆粒的示例性實(shí)施的例示。
[0027]圖7A和7B示出了示例性中空多孔納米顆粒的SEM圖像。
[0028]圖8A-8I示出了示例性中空多孔二氧化硅納米顆粒的電子顯微圖。
[0029]圖9A-9D示出了用以創(chuàng)建密封的中空多孔納米顆粒的示例性裝配過程的示意圖。
[0030]圖1OA和IOB示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出所公開的技術(shù)的密封的中芯多孔納米顆粒的活性。
[0031]圖10C-10E示出了顯示示例性納米顆粒的電子顯微圖。
[0032]圖11示出了展示所公開的技術(shù)的體內(nèi)活性的圖。
[0033]圖12示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出與蛋白酶K孵育或不與蛋白酶K孵育的游離蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)青霉素酶的活性。
[0034]圖13示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出與蛋白酶K孵育或不與蛋白酶K孵育的游離海腎(Renilla reniformis)突光素酶的活性。
[0035]圖14示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出蠟樣芽孢桿菌青霉素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036]圖15示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出與封裝在密封的中空多孔納米顆粒內(nèi)的蠟樣芽孢桿菌青霉素酶比較，不同濃度的游離蠟樣芽孢桿菌青霉素酶的活性。
[0037]圖16示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出海腎熒光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0038]圖17示出了數(shù)據(jù)圖，該數(shù)據(jù)圖示出與封裝在密封的中空多孔納米顆粒內(nèi)的海腎熒光素酶比較，不同濃度的游離海腎熒光素酶的活性。
[0039]圖18A和18B示出了例示示例性金屬納米顆粒合成方案的示意圖。
[0040]圖18C示出了示例性中空多孔金納米顆粒的圖像。
[0041]圖19示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0042]圖20示出了例示示例性納米顆粒合成方案的示意圖。[0043]各種圖中相同的標(biāo)號(hào)和命名指示相同的元素。
[0044]詳細(xì)描述
[0045]諸如納米顆粒的納米結(jié)構(gòu)可以用于運(yùn)載作為負(fù)荷的化學(xué)或生物物質(zhì)(例如藥物)并且被布置以用于在各種環(huán)境中遞送所裝載的物質(zhì)，所述環(huán)境包括生物環(huán)境，諸如有機(jī)體內(nèi)。例如，布置在體內(nèi)環(huán)境中的納米結(jié)構(gòu)載體自身可以觸發(fā)免疫反應(yīng)和/或引起毒性問題，例如，這可以歸因于納米顆粒載體材料和/或所裝載的物質(zhì)材料。在某些情況下，經(jīng)由納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)可能需要所裝載的物質(zhì)的修飾，這可能降低所裝載的物質(zhì)的所需功倉泛。
[0046]描述了用于裝配和實(shí)施包括空芯和可密封孔的納米顆粒的技術(shù)、系統(tǒng)和裝置。
[0047]所公開的納米顆粒和納米顆粒系統(tǒng)可以包括基于中空納米顆粒的載體平臺(tái)，所述載體平臺(tái)能夠封裝和保護(hù)納米顆粒內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的物質(zhì)，例如通過可密封孔。例如，基于所公開的納米顆粒的載體平臺(tái)可以包括中空多孔納米顆粒，所述納米顆粒能夠封閉分子負(fù)荷，以使其在空芯內(nèi)而躲避免疫系統(tǒng)，同時(shí)允許所封閉的負(fù)荷在期望的環(huán)境中受控地相互作用，例如，經(jīng)由通向納米顆粒內(nèi)部區(qū)域的在表面上的孔隙。例如，示例性中空多孔納米顆?？勺陨頌樯锵嗳莸模巧锵嗳菪载?fù)荷。例如，將所公開的納米顆粒和納米顆粒系統(tǒng)用于某些應(yīng)用的實(shí)施可以消除修飾有效負(fù)荷物質(zhì)的需要，當(dāng)布置有機(jī)體中時(shí)避免觸發(fā)不期望的免疫反應(yīng)，允許納米顆粒的柔性表面功能化(例如用于靶向)，或延長(zhǎng)納米顆粒的循環(huán)壽命(與所裝載的物質(zhì)無關(guān))。還例如，所公開的納米顆粒和納米顆粒系統(tǒng)還可以包括基于中空無孔納米顆粒的載體平臺(tái)，所述載體平臺(tái)能夠通過可密封孔來封裝和保護(hù)納米顆粒內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的物質(zhì)并且將所封裝的物質(zhì)釋放入納米顆粒所布置的環(huán)境中，例如，其中可密封孔可以溶解并且將負(fù)荷釋放到入所布置的環(huán)境中。在其他實(shí)例中，所公開的納米顆粒和納米顆粒系統(tǒng)可以包括基于中空納米顆粒的載體平臺(tái)，所述載體平臺(tái)能夠通過可密封孔來封裝和保護(hù)納米顆粒內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的物質(zhì)并且將所封裝的物質(zhì)釋放入納米顆粒所布置的環(huán)境中，例如，其中納米顆?？梢匀芙獠⑶覍⒇?fù)荷釋放入所布置的環(huán)境中。
[0048]在一方面，所公開的技術(shù)包括裝配技術(shù)，其可以用于創(chuàng)建具有可密封孔和小孔隙(各自為可控尺寸)的納米尺度結(jié)構(gòu)(例如，諸如納米籠或納米殼的顆粒)，例如，其中結(jié)構(gòu)可以封裝內(nèi)部區(qū)域內(nèi)所包含的其他物質(zhì)。描述了裝配方法，其可以產(chǎn)生具有配置為可控尺寸的孔的中空多孔納米顆粒(HPNP)，例如所述可控尺寸可以允許其他的物質(zhì)或顆粒(例如大分子)進(jìn)入到中空內(nèi)部。所述的裝配方法包括密封HPNP的孔的技術(shù)，例如，形成密封的中空多孔納米顆粒(SHPNP)，其可以封閉SHPNP內(nèi)所裝載的物質(zhì)或顆粒。例如，為裝配HPNP，芯顆粒被用作起始模板材料，例如，其可以為任何形狀的形式，包括球體、圓錐、棒、長(zhǎng)方體、管，以及其他形狀。掩蔽顆?？梢越Y(jié)合模板材料的外表面，例如通過分子間相互作用?？梢酝ㄟ^將涂覆材料應(yīng)用到形成芯殼納米顆粒的模板材料周圍，從而形成多孔殼。然后，可以去除芯和結(jié)合的掩蔽顆粒，例如通過溶解或煅燒或其他類似方法，其中多孔外殼得到保留。這一過程的實(shí)施可以形成中空多孔納米顆粒，并且其他分子可以被封裝在所產(chǎn)生的納米顆粒的內(nèi)部之內(nèi)。例如，所述的裝配方法可以包括裝載和完全密封孔的技術(shù)，例如，一旦將示例性大分子封裝在內(nèi)部，則使多孔殼顆粒能夠作為負(fù)荷的載體。例如，不依賴于納米顆粒尺寸的大小，可以調(diào)節(jié)孔的尺寸。例如，所述的裝配方法可以包括獨(dú)立地調(diào)節(jié)孔隙尺寸的技術(shù)。
[0049]描述了基于示例性模板的技術(shù)，該技術(shù)可以使用各種材料(例如包括聚合物、陶瓷和金屬)來制備具有單分散尺寸的HPNP，例如，芯顆粒直徑范圍從幾十納米到微米?；谑纠阅０宓募夹g(shù)可以用于沿著中空顆粒殼產(chǎn)生可控尺寸的表面孔，例如，孔直徑范圍從幾納米到數(shù)十或數(shù)百納米。所述的裝配技術(shù)可以提供HPNP滲透性的獨(dú)立控制。例如，可以通過控制殼材料的多孔性來配置HPNP的滲透性，例如，產(chǎn)生的孔隙的尺寸范圍可以從幾納米到數(shù)納米(a few to several nanometers)。例如,納米孔隙尺寸可以導(dǎo)致大分子擴(kuò)散入/出HPNP的相對(duì)較低的滲透性，例如，避免酶、蛋白或較大的生物活性物質(zhì)擴(kuò)散穿過HPNP，但仍然允許較小的物質(zhì)擴(kuò)散穿過孔隙。例如，描述了利用二氧化硅和金HPNP的示例性實(shí)施，其例示了對(duì)顆粒尺寸和表面多孔性的精確控制?？梢孕薷乃龅难b配技術(shù)來產(chǎn)生不同材料的HPNP，例如，包括但不限于，基于鈣的納米顆粒，諸如磷酸鈣或鈣涂覆的顆粒、氧化鐵納米顆粒，以及其他材料。例如，裝配不同材料的HPNP可以提供可適用于特定所需應(yīng)用的HPNP性質(zhì)的設(shè)計(jì)。
[0050]示例性技術(shù)可以包括在具有不同化學(xué)和物理性質(zhì)的表面上的膠體制模反應(yīng)(templating reaction)。例如,殼材料層在具有由較小的掩蔽膠體顆粒所封閉的表面部分的膠體顆粒模板上生長(zhǎng)。隨后，通過諸如煅燒和/或溶解的方法去除模板和掩蔽顆粒，從而留下在表面上具有開放的孔的中空顆粒。例如，顆粒的總尺寸由模板顆粒來決定。例如，可以通過改變掩蔽顆粒的尺寸來調(diào)節(jié)孔的直徑，并且可以通過模板和掩蔽顆粒的相對(duì)摩爾濃度來控制顆粒表面上的孔的數(shù)量。
[0051]所公開的技術(shù)包括用于裝配具有空芯、多孔表面和可密封孔的納米顆粒的幾個(gè)方案。圖1A-1C示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0052]圖1A示出了過程110的實(shí)例，其中掩蔽顆粒115與一個(gè)或多個(gè)芯或模板顆粒111混合在一起。例如，掩蔽顆粒115可以是配置為具有表面電荷、例如負(fù)表面電荷的納米顆粒。例如，掩蔽顆粒115還可以包括具有功能化外表面116的顆粒，例如具有表面電荷。例如，示例性掩蔽顆粒115可以為聚苯乙烯納米顆粒，并且示例性功能化表面116可以為羧化功能層。例如，模板顆粒111可以是配置為具有與掩蔽顆粒115的表面電荷的極性相反的表面電荷、例如正表面電荷的納米顆粒。例如，模板顆粒111還可以包括功能化外表面112。例如，示例性模板顆粒111可以為聚苯乙烯納米顆粒，并且示例性功能化表面112可以為胺功能層。例如，一旦將示例性羧化掩蔽顆粒115與胺化模板顆粒111混合，則羧化顆粒115可以與胺化模板顆粒111結(jié)合。
[0053]圖1A還示出了例如通過靜電相互作用來使具有羧化功能化表面116的掩蔽顆粒115與模板顆粒111的胺化功能化表面112結(jié)合的過程120的實(shí)例。例如，當(dāng)示例性羧化顆粒115具有帶負(fù)電荷的表面時(shí)，它們排斥負(fù)離子并且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應(yīng)，例如，封閉示例性胺化模板顆粒111的外表面的某些帶正電荷的區(qū)域。在其他實(shí)例中，過程120可以包括通過其他顆粒吸引方式來使掩蔽顆粒115與模板顆粒111的表面112結(jié)合，例如，所述顆粒吸引方式包括但不限于氫鍵、共價(jià)鍵、磁吸引、疏水性相互作用等。
[0054]圖1A還示出了將層131添加至掩蔽顆粒115—模板顆粒111復(fù)合體的過程130的實(shí)例。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至包含與模板顆粒111結(jié)合的掩蔽顆粒115的溶液。示例性溶膠凝膠反應(yīng)可以只發(fā)生在沿著模板顆粒111的表面112的帶正電荷的區(qū)域中，例如沒有被掩蔽顆粒115覆蓋或封閉的區(qū)域。例如，過程130可以用覆蓋層131覆蓋模板顆粒111暴露的表面，而不覆蓋存在掩蔽顆粒115的位置。例如，覆蓋層131可以為多孔的材料。例如，層131可以為一種材料(例如二氧化硅)，以使過程130可以產(chǎn)生形成在模板顆粒111表面上的多孔層。例如，過程130中的溶膠凝膠試劑的添加可以啟動(dòng)二氧化硅生長(zhǎng)，例如根植于示例性胺化功能化表面112的氨基。例如，覆蓋層131還可以為無孔材料。在某些實(shí)例中，過程130可以包括通過其他方式將層131添加至掩蔽顆粒115—模板顆粒111復(fù)合體，例如所述方式包括但不限于基于材料的排他性、或氧化還原化學(xué)，以及其他技術(shù)，所述氧化還原化學(xué)只在一顆粒(例如模板顆粒111)的表面上而不在其他顆粒(例如掩蔽顆粒115)的表面上形成層131。用作覆蓋層的示例性材料可以包括多孔的或無孔的材料，或可降解的材料(例如，其可以在某些環(huán)境中或在特定條件下或通過示例性觸發(fā)而溶解或降解，例如，條件和/或觸發(fā)包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他條件和/或觸發(fā))。
[0055]另外，圖1A示出了例如通過移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115而形成中空納米顆粒的過程140的實(shí)例。例如，一旦形成了具有期望厚度的層131，則例如通過各種方法，包括通過溶劑將它們?nèi)芙?、煅燒、熔融、或燃燒、或這些方法或其他相似方法的組合來移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115。例如，過程140可以包括將二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、或其他溶劑和/或熱引入到層覆蓋的掩蔽顆粒115—模板顆粒111復(fù)合體。例如，過程140的實(shí)施產(chǎn)生了 HPNP，所述HPNP包括具有孔145的空(empty)的或中空的多孔殼141和空的或中空的內(nèi)部142，例如，當(dāng)層131由多孔材料形成時(shí)。在某些實(shí)例中，可以實(shí)施過程140以形成中空無孔納米顆粒，例如，通過移除模板顆粒111和掩蔽顆粒115。例如，可以通過將示例性無孔材料用作覆蓋層131來實(shí)施過程130，從而形成中空無孔納米顆粒。在此類實(shí)例中，示例性殼141為中空無孔殼。
[0056]一旦創(chuàng)建了示例性HPNP，則它們可以裝載有其他物質(zhì)并且進(jìn)行密封以封裝所裝載的物質(zhì)。
[0057]圖1B示出了用于將負(fù)荷顆粒151裝載入殼結(jié)構(gòu)141的中空內(nèi)部區(qū)域142中的過程150的實(shí)例。例如，通過將高濃度的負(fù)荷物質(zhì)的溶液添加至殼結(jié)構(gòu)的溶液，可以使殼結(jié)構(gòu)(例如HPNP)的溶液裝載有負(fù)荷物質(zhì)?？梢酝ㄟ^幾種方法之一來實(shí)施過程150。例如，負(fù)荷顆粒151可穿過孔145而擴(kuò)散入殼結(jié)構(gòu)141中。在其他實(shí)例中，負(fù)荷顆粒151可通過包括例如電泳力在內(nèi)的非擴(kuò)散方式穿過它們的孔145而進(jìn)入殼結(jié)構(gòu)141的內(nèi)部區(qū)域142。將各種類型的材料用作負(fù)荷，可以實(shí)施過程150以用于各種應(yīng)用，所述材料例如包括但不限于藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶、激素、和/或其他蛋白、糖蛋白、糖脂、碳水化合物、脂質(zhì)、核酸、適配子、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。
[0058]在用負(fù)荷顆粒151裝載殼結(jié)構(gòu)141之后，可以密封孔145。圖1C示出了過程160和170，所述過程示出例如通過密封示例性HPNP141的孔145而形成密封的中空多孔納米顆粒175，其將負(fù)荷顆粒151封閉在中空內(nèi)部區(qū)域142內(nèi)。在該實(shí)例中，可以用所示為層171的其他的多孔材料(例如二氧化硅)層來密封孔145。在其他實(shí)例中，可以用其他的無孔材料層(例如，金屬層或其他無孔材料)(其也可以由層171表示)來密封孔145。
[0059]過程160可以包括用層161 (例如，大的帶正電荷的聚合物，諸如聚-L-賴氨酸(PLL))部分地覆蓋孔145。例如，PLL聚合物可以在示例性HPNP141的表面和孔145之上創(chuàng)建網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。過程170可以包括在示例性HPNP141內(nèi)密封負(fù)荷顆粒151以形成密封的中空多孔納米顆粒175。例如，過程170可以包括在示例性PLL覆蓋的HPNP141之上形成層171。例如，溶膠凝膠試劑的進(jìn)一步添加可以在覆蓋孔145的初始層(例如，層161)的頂部上創(chuàng)建另一層(例如，層171)，例如，通過在示例性PLL聚合物上的成核位點(diǎn)，由此形成示例性SHPNP175。例如，示例性負(fù)荷顆粒151可以被永久地密封和封閉在示例性SHPNP175內(nèi)部。在某些實(shí)例中，在不實(shí)施過程160的情況下，可以實(shí)施過程170以形成示例性密封的中空多孔納米顆粒175，例如，通過直接在示例性殼結(jié)構(gòu)141之上形成層171。在某些實(shí)例中，將示例性無孔材料用作覆蓋層131，通過實(shí)施過程160和170，可以形成密封的中空無孔納米顆粒。在此類實(shí)例中，示例性殼141為中空無孔的殼(例如，具有在中空內(nèi)部區(qū)域142內(nèi)的負(fù)荷顆粒151)，所述殼141可以覆蓋有層161 (例如，大的帶正電荷的材料，在示例性殼結(jié)構(gòu)141和孔145之上形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu))，并且通過在示例性層161覆蓋的殼結(jié)構(gòu)141之上形成層171，可以密封孔145(例如，將負(fù)荷顆粒151封閉在示例性殼結(jié)構(gòu)141內(nèi))，由此形成示例性密封的中空納米顆粒175。在該實(shí)例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和多孔層171，例如，其中小的顆粒或物質(zhì)可以進(jìn)出示例性納米顆粒175。在此類實(shí)例中，在不實(shí)施過程160的情況下，還可以實(shí)施過程170以形成示例性密封的中空納米顆粒175，例如通過直接在示例性殼結(jié)構(gòu)141 (例如，裝載有在中空內(nèi)部區(qū)域142內(nèi)的負(fù)荷顆粒151)上形成層171。
[0060]例如，過程170可以包括可基于所需應(yīng)用來確定用于層171的材料。在某些實(shí)例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括多孔層141和多孔層171。在其他實(shí)例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和多孔層171。在其他實(shí)例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括多孔層141和無孔層171。以及在其他實(shí)例中，示例性密封的中空納米顆粒175可以包括無孔層141和無孔層171。
[0061]示例性負(fù)荷顆粒151可以包括可降解的材料(例如，其在某些環(huán)境中或在特定條件下或通過示例性觸發(fā)而溶解或降解，例如條件和/或觸發(fā)包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他的條件和/或觸發(fā))。例如，可以在特定環(huán)境中布置示例性密封的中空納米顆粒175負(fù)荷顆粒151，其中示例性負(fù)荷顆粒151(例如，為可降解材料)可以經(jīng)受降解(例如，基于特定環(huán)境的條件)并且通過示例性SHPNP175的孔隙而被釋放到顆粒外，或在某些實(shí)例中，與示例性密封的中空納米顆粒175的降解相組合。
[0062]將具有氨基官能團(tuán)的聚苯乙烯納米顆粒用作示例性模板顆粒并且將具有羧基官能團(tuán)的聚苯乙烯納米顆粒用作示例性掩蔽顆粒，可以實(shí)施圖1A所述的示例性裝配過程。例如，氨基官能團(tuán)為帶正電荷的，并且可以促進(jìn)示例性裝配過程中所用的化學(xué)過程。在某些實(shí)例中，示例性溶膠凝膠試劑需要帶正電荷的成核位點(diǎn)，可以通過胺化功能化表面來提供所述成核位點(diǎn)。將諸如囊液(vesicular solution)、膠體、乳滴和聚合物的材料用作模板以用于形成靶材料的層或其前體，可以實(shí)施示例性HPNP的裝配。例如，利用用作前體的硅酸，可以實(shí)施示例性裝配過程。例如，硅酸向溶液給予將帶負(fù)電荷的含硅的離子。這些示例性帶負(fù)電荷的離子被帶正電荷的模板納米顆粒表面吸引。例如，可以將二氧化硅選作掩蔽的模板表面之上的覆蓋層材料；例如，二氧化硅的性質(zhì)可包括可調(diào)節(jié)的多孔性、熱力和機(jī)械穩(wěn)定性、低密度、高比表面積、以及生物可相容性和生物可降解性，這些可為基于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的應(yīng)用中重要的性質(zhì)。
[0063]裝配示例性二氧化硅HPNP以用于所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施。例如，胺官能化的聚苯乙烯納米顆粒(APNP)可以用作模板，該模板用于納米多孔二氧化硅溶膠凝膠網(wǎng)絡(luò)的成核生長(zhǎng)。例如，在水溶液中水解四甲氧基硅烷(TMOS)，從而產(chǎn)生硅酸，其用作用于在顆粒表面上的縮聚反應(yīng)的前體。下列的示例性化學(xué)反應(yīng)描述了娃酸的縮聚反應(yīng)的起始階段，產(chǎn)生了二氧化硅層的生長(zhǎng)。
[0064]Si (OCH3) 4+4H20 — Si (OH) 4+4H0CH3+40H ^
[0065]Si (OH) 4+0H- — Si (OH)3CT+H2O
[0066]Si (OH) 4+Si (OH)3CT — (HO)3S1-O-Si (OH) 3+0H_
[0067]例如，示例性裝配過程可以包括在水溶液中將APNP與羧基官能化聚苯乙烯乳膠納米顆粒(CPNP)混合(例如，圖1A的過程110所例示)。示例性APNP和CPNP可以聚集在一起，例如，由于官能團(tuán)的靜電相互作用(例如，圖1A的過程120所例示)。例如，在溶液中，帶有相反電荷的表面官能團(tuán)的示例性顆粒相互吸引。例如，與酸性羧基官能化表面比較，胺官能化表面創(chuàng)建了更有效率的用于堿催化的硅膠生長(zhǎng)的成核位點(diǎn)。在接觸點(diǎn)處，CPNP用作帶負(fù)電荷的納米掩模(nanomask)以用于在顆粒表面上的溶膠凝膠反應(yīng)。示例性裝配過程可以包括將硅烷添加至待水解的溶液并且產(chǎn)生硅酸，例如，其用作二氧化硅層的前體。例如，APNP上的堿性胺基可以有效地模塑(template)硅膠生長(zhǎng)，而CPNP上的酸性羧基可以掩蔽與APNP的接觸點(diǎn)的反應(yīng)(例如，圖1A的過程130所例示)。示例性裝配過程可以包括例如通過煅燒或溶解來去除APNP和CPNP。一旦形成具有所需厚度的二氧化硅層，則通過溶解或煅燒來去除聚苯乙烯顆粒，留下二氧化硅HPNP結(jié)構(gòu)(例如，圖1A的過程140所例示)。在某些實(shí)例中，示例性裝配過程可以包括利用渦旋混合和溫和超聲處理而在水中再懸浮和分散HPNP。例如， 煅燒后的最終顆粒直徑可為初始500nm模板APNP的直徑的約85%，這可能與在加熱或用無水溶劑的萃取期間，硅膠羥基的部分脫水有關(guān)。
[0068]例如，可以實(shí)施裝配過程以產(chǎn)生具有允許小分子通過的孔隙的二氧化硅殼顆粒(例如，圖1A中的HPNP141和圖1C中的SHPNP175)。然而，大的分子負(fù)荷(例如，圖1C所示的負(fù)荷顆粒151)不能通過孔，因此被密封在顆粒內(nèi)?？纱嬖谀軌蚧谒钁?yīng)用的該示例性裝配技術(shù)的其他各種變體(圖1A-1C中所述的)。例如，HPNP可由金屬(例如金)形成，或可存在形成HPNP的不同材料的多個(gè)或多個(gè)不同的層，例如，金屬的第一內(nèi)層和聚合物的第二外層(例如二氧化硅)?？梢杂赡０孱w粒的尺寸來確定顆粒的尺寸，并且可以由封閉或掩蔽顆粒的尺寸來確定孔的尺寸?？梢韵嗷オ?dú)立地配置所公開的中空多孔納米顆粒的尺寸和它的孔的尺寸。另外，可不依賴于HPNP的尺寸和它的孔的尺寸來配置HPNP的多孔性。
[0069]圖2A-2B示出了示例性合成方案的流程圖，所述合成方案產(chǎn)生了中空多孔納米顆粒和密封的中空多孔納米顆粒。圖2A示出了流程圖200，所述流程圖200包括將納米掩模顆粒結(jié)合于芯顆粒的過程201，在納米掩模結(jié)合的芯顆粒之上形成層的過程202，以及例如通過去除納米掩模顆粒和芯顆粒來形成包括孔的中空多孔殼顆粒的過程203。圖2B示出了流程圖210，所述流程圖210包括通過孔將分子或其他物質(zhì)裝載至中空多孔殼顆粒的過程211和密封中空多孔殼顆粒的孔以在內(nèi)部封閉所裝載的分子或其他物質(zhì)的過程212。
[0070]所公開的技術(shù)的示例性裝配方法獨(dú)立地提供了對(duì)納米多孔性和顆粒直徑的精確控制。例如，示例性裝配方法可以應(yīng)用于廣泛的可通過溶膠凝膠合成路線而獲得的材料。另外，示例性裝配方法可以應(yīng)用于包括基于金和氧化還原化學(xué)過程在內(nèi)的不同化學(xué)過程，例如，將HPNP的適用性擴(kuò)展至廣泛的應(yīng)用。
[0071]例如，利用四甲氧基硅烷(TMOS)溶液來應(yīng)用示例性裝配方法，所述四甲氧基硅烷獲取自Aldrich-Sigma Ltd。示例性化學(xué)物質(zhì)被原樣使用(used as received)。例如,胺官能化聚苯乙烯球獲取自Polysciences, Inc,以及羧基官能化聚苯乙烯乳膠顆粒獲取自LifeTechnologies, Inc。
[0072]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括制備中空多孔二氧化硅納米球。例如，50iiL模板顆粒溶液與相應(yīng)量的掩蔽顆粒溶液混合以制備所需的顆粒濃度比例。振蕩所得的混合物過夜并且向溶液添加IOOOiI L無水乙醇。為了產(chǎn)生二氧化硅前體并啟動(dòng)二氧化硅生長(zhǎng)，向溶液添加1000 的四甲氧基硅烷。振蕩混合物過夜，并且通過離心分離(例如5分鐘，14000rpm)來收集懸浮顆粒，用去離子水洗滌數(shù)次，并在蓋玻片上真空干燥過夜。為除去有機(jī)化合物，將運(yùn)載納米顆粒粉末的蓋玻片置于熱板之上并且在450°C下煅燒過夜。煅燒的粉末被轉(zhuǎn)移至管，并且懸浮在水中(例如50UL)并通過溫和超聲處理而分散。
[0073]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括制備密封的中空多孔二氧化硅納米球。例如，將
4ii L的lOmg/mL酶溶液添加至50 y L示例性中空多孔二氧化硅納米球溶液并孵育過夜。用1000 u L磷酸鹽緩沖鹽水和50 u L0.1%的具有150-300kDa分子量的聚-L-賴氨酸稀釋示例性溶液。例如，可以稀釋溶液以防止聚集。以74:500的體積比將TMOS添加至ImM HC1，并且混合幾分鐘以產(chǎn)生硅酸溶液。在稀釋后立即將25 y L示例性硅酸溶液添加至以上多孔二氧化硅納米球溶液，并且振蕩I小時(shí),從而例如產(chǎn)生密封的中空多孔二氧化硅納米球。稍后，通過離心分離(例如，5分鐘，14000rpm)來收集懸浮的密封的中空多孔二氧化硅納米球，并且用水洗滌幾次。在37°C下，以在IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)溶液中為0.lmg/mL的濃度，將樣品暴露于蛋白酶-K酶過夜，隨后通過離心分離(例如，5分鐘，14000rpm)，再用IX PBS連續(xù)洗滌以除去蛋白酶-K。所述的方案可以用于有效負(fù)荷物質(zhì)的封裝。例如，示例性實(shí)施中所利用的有效負(fù)荷物質(zhì)包括青霉素酶和海腎(Renilla reniformis)熒光素酶,例如,其被封裝在示例性中空多孔二氧化硅納米球內(nèi)。
[0074]例如，來自臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的青霉素酶獲取自Sigma-AldrichC0.LLC0 CCF2-AM 獲取自 Life Technologies, Inc., San Diego, California, USA。兔多克隆生物素化抗體獲取自GeneTex, Inc.(San Antonio, Texas, USA)。所有的突光強(qiáng)度都在Infinite200Pro (TECAN, Switzerland)上測(cè)量。
[0075]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括中空二氧化硅納米球的制備，其中實(shí)施了與所述中空多孔二氧化硅納米球的裝配方案類似的裝配方案，但省略了納米掩模。
[0076]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括用Cy5標(biāo)記青霉素酶。例如，Cy5馬來酰亞胺被用作標(biāo)記劑以用于例示所述方案的示例性實(shí)施。例如，以10mg/mL濃度，將Img青霉素酶溶解于100 u L脫氣的PBS緩沖液。例如，在脫氣的溶劑/緩沖液中，在氮?dú)庀逻M(jìn)行硫醇修飾。將示例性溶液在室溫下保持30分鐘左右。將約100摩爾的過量的TCEP添加至示例性溶液。小瓶用氮?dú)鉀_洗，加蓋，徹底地混合。在室溫下孵育該反應(yīng)10分鐘。將IOOiig Cy5馬來酰亞胺溶解在2 UL 二甲基甲酰胺(DMF)中，并將其添加至酶溶液。小瓶再次用氮?dú)鉀_洗，力口蓋，徹底地混合。在室溫下孵育該反應(yīng)2小時(shí)，同時(shí)每隔30分鐘進(jìn)行混合。最終，將反應(yīng)在2_8°C下保持過夜。稍后，通過分子量截留為7kDa的脫鹽柱來除去未結(jié)合的染料。
[0077]通過409nm的激發(fā)來測(cè)量在100%正常小鼠血清中的活性，作為藍(lán)色熒光(447nm)與綠色熒光(520nm)之比的增加的初始速率。
[0078]通過測(cè)量620nm激發(fā)和665nm發(fā)射的熒光強(qiáng)度來檢測(cè)酶載量(例如示例性Cy5標(biāo)
記的青霉素酶)。[0079]以下列示例性方式測(cè)量抗體結(jié)合。例如，用生物素基團(tuán)功能化抗青霉素酶。將具有鏈霉親和素的Alexa488染料添加至所有的樣品，隨后連續(xù)的洗滌。在480nm激發(fā)和530nm發(fā)射處進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)量。
[0080]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括體內(nèi)活性測(cè)量，以下列示例性方式制備和進(jìn)行所述體內(nèi)活性測(cè)量。例如，BALB/c小鼠用于示例性實(shí)施。例如，用IOOyL海腎熒光素酶(RenLuc)酶肌內(nèi)注射一小鼠，所述海腎熒光素酶被密封的中空多孔二氧化硅納米球溶液封裝。以5.68X IO12個(gè)顆粒/mL濃度，將示例性密封的中空多孔二氧化硅納米球懸浮在IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。例如，用IOOii L的g/mL濃度的游離RenLuc肌內(nèi)注射其他小鼠。游離RenLuc被懸浮在IX PBS中。5分鐘后，將10 y g芐基-腔腸素(benzyl-coelenterazine)靜脈給予入每一小鼠的側(cè)面尾靜脈中。將10 ii g節(jié)基-腔腸素溶解于95%酒精中，并用IX PBS稀釋到酒精的最終濃度為10%。給予小鼠異氟烷，并且通過2秒的暴露來測(cè)量靜脈注射后的每一小鼠的發(fā)光強(qiáng)度。
[0081]所公開的技術(shù)的示例性實(shí)施包括納米結(jié)構(gòu)的表征。例如，在FEI/PhilipsXL30FEG ESEM上進(jìn)行SEM測(cè)量，并且在IOkV加速電壓的FEI SFEG UHR SEM(例如，在加州大學(xué)圣地亞哥分校，Calit2Nano3設(shè)施)上進(jìn)行超高分辨率(UHR)SEM測(cè)量。使用FEI Technai Sphera200kV(例如，加州大學(xué)圣地亞哥分校，冷凍電子顯微鏡)獲取TEM圖像。在200kV下操作的日立HD-2000儀器用于掃描透射電子顯微鏡(STEM)圖像。來自 Xenogen Corporation (Alameda, California)的 IVIS 成像系統(tǒng) 200 系列(ImagingSystem200Series)用于體內(nèi)發(fā)光測(cè)量。
[0082]描述了所進(jìn)行的示例性實(shí)施，所述實(shí)施例示了利用所公開的技術(shù)的裝配技術(shù)，對(duì)示例性二氧化硅中空多孔納米顆粒的顆粒直徑、孔徑和孔濃度的精確控制。例如，所公開的裝配技術(shù)的穩(wěn)健性(robustness)和靈活性提供了在許多領(lǐng)域的各種通用的和獨(dú)特的應(yīng)用中實(shí)施所裝配的納米顆粒的能力。
[0083]圖3展示了揭示所產(chǎn)生的孔的結(jié)構(gòu)的高分辨率電子顯微圖。圖3示出了示例性透射電子顯微鏡(TEM)圖像301、302、303和304，所述圖像展示了示例性HPNP的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。例如，將500nm APNP用作模板顆粒和將IOOnm CPNP用作掩蔽或封閉顆粒，可以產(chǎn)生示例性HPNP。圖301示出了示例性HPNP的表面特征的近貌圖，例如，通過掃描透射電子顯微鏡(STEM)的次級(jí)電子模式所采集的，所述近貌圖揭示了在模板與掩蔽顆粒的接觸點(diǎn)處所形成的30±10nm孔的形成。圖302示出了示例性HPNP的TEM圖像，所述TEM圖像展示了孔結(jié)構(gòu)和二氧化硅殼的厚度。圖303示出了 SEM顯微圖，例如，用超高分辨率模式所采集的，所述SEM顯微圖從內(nèi)部視角示出了整個(gè)殼的開放孔結(jié)構(gòu)和殼的厚度。圖304示出了寬場(chǎng)電子顯微圖，例如，通過STEM的透射模式所采集的，所述電子顯微圖示出了示例性均勻HPNP的單分散性和均勻度。例如，圖3的圖像示出了在兩個(gè)顆粒之間的接觸點(diǎn)周圍完全防止二氧化硅的形成，并且由所得顆粒的表面形貌來反映掩蔽CPNP表面的曲率。例如，利用500nmAPNP模板且TMOS與APNP重量比為3:1的示例性合成可以產(chǎn)生25nm厚度的二氧化硅殼。該厚度可與產(chǎn)生穩(wěn)定顆粒有關(guān)。
[0084]圖4示出了掃描電子顯微鏡(SEM)圖像401、402、403和404，所述圖像展示了對(duì)示例性HPNP特征的合成自由度。圖401示出了示例性HPNP表面，所述表面展示出約25-30個(gè)孔，例如通過利用500nm APNP模板顆粒和IOOnm CPNP掩蔽顆粒且APNP與CPNP數(shù)量比為1:30而制備的。圖402示出了示例性HPNP表面，所述表面展示出約10-15個(gè)孔，例如通過利用相同的模板和掩蔽顆粒且APNP與CPNP數(shù)量比為1:15而制備的。圖403示出了通過SEM所采集的利用500nm APNP和40nm CPNP所獲取的HPNP的顯微圖。圖404示出了利用200nm APNP和40nm CPNP所產(chǎn)生的HPNP的SEM圖像。插圖405示出了這些示例性顆粒的更高分辨率的近貌TEM顯微圖，例如，其中示例性箭頭表示在顆粒表面上的孔。圖401、402、403和404所示的示例性比例尺代表IOOnm,以及插圖405所示的示例性比例尺代表50nm。
[0085]所公開的裝配程序可以包括在產(chǎn)生HPNP中的多重自由度。例如，示例性裝配過程可以包括控制表面上的孔的數(shù)量(例如，圖402所例示的)，孔的直徑(例如，圖403所例示的)和總顆粒尺寸(例如，圖404所例示的)。例如，通過APNP與CPNP的相對(duì)摩爾濃度可以控制表面上的孔的平均數(shù)量。圖401和402中的SEM顯微圖示出，當(dāng)溶液中APNP與CPNP摩爾比率分別為1:30和1:15時(shí)，表面上的孔分布。APNP與CPNP的示例性摩爾比率可以產(chǎn)生約25-30個(gè)孔/顆粒(對(duì)1:30比率而言)和約10-15個(gè)孔/顆粒(對(duì)1:15比率而言)。
[0086]例如，通過選擇不同直徑的掩蔽CPNP可以調(diào)節(jié)表面上所創(chuàng)建的孔的尺寸(例如孔直徑)，這與HPNP的總直徑無關(guān)。圖401所示的HPNP的示例性孔尺寸包括30±6nm直徑的孔，例如在500nm APNP上利用IOOnm直徑的CPNP所創(chuàng)建的。圖402所示的HPNP的示例性孔尺寸包括20±3nm直徑的孔洞，例如在500nm APNP上利用60nm直徑的CPNP所創(chuàng)建的?？梢耘渲弥睆郊s20nm的示例性CPNP以產(chǎn)生具有直徑為幾納米的孔的HPNP。
[0087]例如，HPNP的總尺寸取決于模板顆粒尺寸?？梢栽趶V泛的尺寸范圍內(nèi)，例如在約30nm至幾個(gè)微米的范圍內(nèi)，配置示例性APNP以制備HPNP。例如，模板移除后，由500nm APNP模板創(chuàng)建的HPNP可以收縮約15%，例如，產(chǎn)生了 430nm直徑的HPNP (如圖401中示例性HPNP所示)。然而，例如，隨著改變APNP模板顆粒尺寸，收縮的百分比不是恒定的；在示例性實(shí)施中，通過利用200nm APNP和40nm CPNP所裝配的HPNP產(chǎn)生了 150nm的總顆粒尺寸，這相當(dāng)于煅燒后收縮了約25%(如圖404中示例性HPNP所示)。例如，當(dāng)使用較小的顆粒時(shí)，由脫水的羥基與總二氧化硅體積的較高的相對(duì)體積比率可解釋收縮增加。示例性模板和掩蔽顆粒組合產(chǎn)生的孔為初始掩蔽顆粒直徑的約25-35%，例如，通過較小的尺寸而略微減少。例如，對(duì)較小的納米掩模而言，略微的減少可與增加表面曲率以產(chǎn)生更小的接觸點(diǎn)有關(guān)。例如，150nm HPNP的插圖405中所示的更放大的且更高分辨率的TEM顯微圖包括指示在顆粒表面上的孔的箭頭。例如，在利用200nm APNP/40nm CPNP對(duì)所裝配的HPNP上所形成的孔的直徑為12±2nm。
[0088]圖5A示出了示例性聚集體的SEM圖510,所述示例性聚集體是通過500nm APNP作為模板顆粒和IOOnm CPNP作為掩蔽或封閉顆粒所形成的。圖5B示出了利用圖510中顆?？蚣艿乃檬纠訦PNP的SEM圖520。圖510和520所示的示例性比例尺代表200nm。
[0089]圖5C示出了示例性未密封的HPNP(圖531所示)和密封的中空多孔的納米顆粒(SHPNP)(圖532所示)的SEM圖像。圖5C所示的示例性比例尺代表IOOnm0
[0090]可以在各種應(yīng)用中實(shí)施所公開的多孔納米顆粒，所述應(yīng)用包括不可能通過任何其他方法的非常獨(dú)特的應(yīng)用。例如，非人源的酶可用于各種治療應(yīng)用。然而，產(chǎn)生了針對(duì)這些異種蛋白的免疫反應(yīng)、以及內(nèi)吞細(xì)胞器和新陳代謝清除的器官之內(nèi)的蛋白水解，并且可以阻礙它們的治療功能。
[0091]在另一方面，所公開的技術(shù)可以包括基于多孔殼的納米載體平臺(tái)，所述平臺(tái)可以封裝并保護(hù)來自于可能使貨物的所需功能受損的抗體、蛋白酶和其他生物分子的異種大分子貨物(cargo)。所述的基于多孔殼的納米載體平臺(tái)也可以稱作HPNP。例如，基于多孔殼的納米載體平臺(tái)可以包括能夠高容量裝載未修飾的大分子的包括孔(例如介孔)的中空球狀納米殼，其中隨后可以用納米多孔材料密封所裝載的顆粒，所述納米多孔材料仍然允許小分子易于擴(kuò)散進(jìn)出，但是阻止大分子進(jìn)入或離開?；谒龅拿芊舛嗫讱さ募{米載體平臺(tái)也可以稱作SHPNP。
[0092]示例性SHPNP可以應(yīng)用于體內(nèi)醫(yī)療診斷、監(jiān)測(cè)和治療，例如酶-前藥治療、酶替代治療、基于腫瘤營(yíng)養(yǎng)物的酶消耗的治療以及體內(nèi)生物傳感。例如，因?yàn)镾HPNP可以被配置為薄的中空納米殼，所以引入最少的無機(jī)物質(zhì)，同時(shí)使體內(nèi)負(fù)荷容量最大。例如，可以實(shí)施所公開的SHPNP以防止針對(duì)它們的異種酶貨物的免疫反應(yīng)并且使它們免于蛋白水解。在該示例性實(shí)施中，SHPNP可以包括在它們表面上的納米孔(例如<2nm直徑)，以使底物觸及空芯內(nèi)部?jī)?nèi)所封裝的酶，與酶相互作用及被酶修飾，以及擴(kuò)散出(如圖6所例示的)。
[0093]圖6示出了示意圖600，例示了所公開的密封中空多孔納米顆粒的示例性實(shí)施，所述納米顆粒已裝載了用于酶-前藥治療應(yīng)用的酶貨物。圖600示出了密封中空多孔納米顆粒611，其將酶615封閉在它的中空內(nèi)部?jī)?nèi)以與前藥分子616相互作用，相互作用發(fā)生在SHPNP611之內(nèi)。例如，在SHPNP611內(nèi)部保護(hù)所封閉的酶615以例如免于免疫系統(tǒng)或SHPNP611所布置的環(huán)境中的其他物質(zhì)。例如，因?yàn)轭w粒表面為多孔的，所以前藥分子616可以擴(kuò)散入SHPNP611并且隨后與酶615相互作用，例如，被描述為前藥-酶復(fù)合體617。例如，酶615可以用于激活前藥分子616，例如，否則其是失活的。前藥-酶復(fù)合體617處的酶615與前藥616之間的相互作用可以導(dǎo)致激活的藥物626的形成。激活的藥物626可以從SHPNP611擴(kuò)散出并且隨后與藥物所要處理的靶標(biāo)相互作用。
[0094]SHPNP611的示例性實(shí)施可以包括在活體中布置以用于治療性藥物遞送。例如，SHPNP611的外表面可以結(jié)合靶向劑，例如以能與環(huán)境內(nèi)的靶向位點(diǎn)特異性結(jié)合。例如，一旦將具有已封裝的酶615的SHPNP611遞送到靶位點(diǎn)(例如腫瘤)，則可以將失活的藥物(例如前藥616)引入有機(jī)體的血流中。盡管可以將前藥616暴露在有機(jī)體內(nèi)多個(gè)區(qū)域，但前藥616僅可以在具有示例性酶封裝的SHPNP611的區(qū)域處被激活，例如，所述前藥616可以靶向于該特定位點(diǎn)或區(qū)域。因此，在該實(shí)例中，只在靶位點(diǎn)處激活前藥616，例如，通過穿過孔隙移動(dòng)進(jìn)入SHPNP611并且與封裝的酶615相互作用(例如激活前藥616)，之后將激活的藥物626通過孔隙移動(dòng)出SHPNP611以處理示例性腫瘤。
[0095]利用前述的和圖1A-1C中所示的技術(shù)可以裝配示例性SHPNP的裝配(例如圖600所例示的)，例如，其包括高產(chǎn)率和可擴(kuò)展的利用納米掩模的合成方法，阻止在部分殼表面上進(jìn)行制模反應(yīng)。例如，所述的裝配技術(shù)導(dǎo)致在HPNP和SHPNP中形成介孔(例如，范圍為2-50nm)以用于有效裝載較大的分子,例如酶。例如,示例性HPNP可以由表面上帶有介孔的納米多孔材料的殼制成，其允許大的生物分子擴(kuò)散入顆粒的中空內(nèi)部空間。例如，一旦裝載了目標(biāo)大分子，則可以用納米多孔殼材料(例如用于形成HPNP的相同的材料)密封介孔，因此形成了負(fù)荷的SHPNP。
[0096]例如，還可以功能化示例性SHPNP的表面以用于靶向和改善的循環(huán)半衰期。SHPNP的示例性另一功能化可以消除對(duì)所裝載的物質(zhì)進(jìn)行任何修飾的需要。例如，在這些條件下，可以遞送隱匿的SHPNP到靶向區(qū)域并且允許連續(xù)且可控的底物通路以與SHPNP的受保護(hù)的環(huán)境內(nèi)的酶貨物相互作用，例如使它們成為用于體內(nèi)酶遞送的理想治療平臺(tái)以用于包括癌癥在內(nèi)的疾病的前藥治療。
[0097]中空多孔納米顆粒的示例性SEM圖像示于圖7A和7B中，例如，其例示了所述HPNP合成技術(shù)的實(shí)施，例如先前圖1A-1C中所述的。圖7A示出了聚集的APNP和CPNP的SEM圖710。例如，CPNP與較大的APNP混合，并且具有帶相反電荷的表面官能團(tuán)的CPNP和APNP在溶液中相互吸引，引起聚集。圖710例示了用于示例性HPNP合成技術(shù)的框架，所述框架示出500nm APNP和IOOnm CPNP0例如，胺官能化表面的堿性性質(zhì)可以創(chuàng)建與酸性羧基官能化表面相比更有效率的用于堿催化的硅膠生長(zhǎng)的成核位點(diǎn)。例如，在接觸點(diǎn)，CPNP用作用于在顆粒表面上溶膠凝膠反應(yīng)的帶負(fù)電荷的納米掩模。例如，一旦形成具有所需厚度的二氧化硅層，則將聚苯乙烯顆粒移除，留下二氧化硅中空多孔納米顆粒結(jié)構(gòu)。圖7B示出了二氧化硅中空多孔納米顆粒的SEM圖720。例如，圖720所示的煅燒后的最終HPNP直徑為初始500nm模板APNP(如圖710所示)的直徑的約85%，例如這可能與在加熱或用無水溶劑萃取期間硅膠羥基的部分脫水有關(guān)。圖710和720中的示例性比例尺代表200nm。
[0098]所述中空多孔納米顆粒的結(jié)構(gòu)特征示于圖8A-8I中。圖8A-8I包括由500nm模板和IOOnm納米掩模制成的二氧化硅HPNP的電子顯微圖。圖8A示出了電子顯微圖801，其揭示了用STEM的次級(jí)電子模式所采集的示例性中空多孔納米顆粒的表面形貌。例如，圖801示出在兩個(gè)顆粒之間的接觸點(diǎn)周圍完全阻止二氧化硅形成以及掩蔽CPNP表面的曲率，其可通過所得顆粒的表面形貌來反映。圖8B示出了示例性HPNP的透射電子顯微圖802。例如，利用500nm APNP模板且TMOS與APNP重量比為3:1的示例性合成技術(shù)產(chǎn)生了 25nm厚度的二氧化硅殼。該示例性厚度可產(chǎn)生在該尺寸范圍內(nèi)的穩(wěn)定的顆粒。圖8C示出了示例性破裂的HPNP的掃描電子顯微圖803，其從內(nèi)部視角示出開放孔結(jié)構(gòu)。圖8D示出了用STEM的透射模式所采集的電子顯微圖804，其示出示例性HPNP的單分散性。
[0099]所公開的裝配程序可以應(yīng)用于廣泛尺寸的具有不同特征的顆粒。例如，HPNP的裝配中3個(gè)自由度可以包括表面上的孔的數(shù)量、孔直徑和總顆粒尺寸。圖SE示出了 SEM圖805，其示出由500nm模板和IOOnm納米掩模，例如，以1:30的特定數(shù)量比所形成的示例性HPNP。圖8F示出了 SEM圖806，其示出由500nm模板和IOOnm納米掩模，例如，以1:15的特定數(shù)量比所形成的示例性HPNP。例如，通過APNP與CPNP的相對(duì)摩爾濃度可以控制表面上孔的平均數(shù)量。圖8E和8F中的SEM顯微圖示出，當(dāng)溶液中APNP與CPNP摩爾比率分別為1:30和1:15時(shí)，表面上的孔分布。這些比率可以產(chǎn)生約25-30個(gè)孔/顆粒(對(duì)1:30比率而言)(例如，如圖8E所示)和約10-15個(gè)孔/顆粒(對(duì)1:15比率而言)(例如，如圖8F所示)。圖8G示出了 SEM圖807，其示出由500nm模板和60nm納米掩模所形成的示例性HPNP。例如，可以通過選擇具有不同直徑的掩蔽CPNP來調(diào)節(jié)表面上所創(chuàng)建的孔的大小，這與HPNP的總直徑無關(guān)。IOOnm掩蔽CPNP的使用可以產(chǎn)生30±4nm直徑的孔(例如，圖8E和8F所示)，并且60nm掩蔽CPNP的使用可以在接觸點(diǎn)處產(chǎn)生20±3nm直徑的孔(例如，圖8G所示)?？梢允褂镁哂?0nm直徑的示例性CPNP，例如，以高準(zhǔn)確度來產(chǎn)生低至幾個(gè)納米的孔。
[0100]圖8H示出了 SEM圖808，其示出由200nm模板和40nm納米掩模所形成的示例性HPNP0例如，可以基于模板顆粒尺寸配置HPNP的總尺寸。例如模板移除后，可以使由500nmAPNP模板所創(chuàng)建的示例性HPNP表現(xiàn)出直徑降低約15%，產(chǎn)生430nm直徑的HPNP (如圖8E-8G所示)。然而，隨著改變APNP模板顆粒尺寸，收縮的百分比不是恒定的；例如，通過利用200nm APNP和40nm CPNP所產(chǎn)生的示例性HPNP產(chǎn)生150nm的總顆粒尺寸，這相當(dāng)于煅燒后收縮約25%(如圖8H所示)。例如，增加的收縮可歸因于當(dāng)使用較小的顆粒時(shí)表面羥基與總二氧化硅體積的更高的相對(duì)體積比率。圖808中示例性比例尺代表50nm。
[0101]進(jìn)行的示例性實(shí)施示出模板和納米掩模顆粒組合產(chǎn)生的孔(例如介孔)為初始納米掩模直徑的約25-35%，例如，通過更小的尺寸而略微減少。例如,對(duì)更小的納米掩模而言，略微減少可與增加的表面曲率產(chǎn)生更小的接觸點(diǎn)有關(guān)。圖81示出了 SEM圖809，其示出150nm直徑的示例性HPNP。圖809所示的示例性箭頭表示表面上的孔。例如，孔的直徑示出為12±2nm，并且通過200nm APNP和40nm CPNP形成示例性HPNP。圖809中示例性比例尺代表50nm。
[0102]圖9A-9D示出了 SHPNP的示例性裝配技術(shù)的示意圖。圖9A示出了產(chǎn)生HPNP911的過程910，所述HPNP911包括中空內(nèi)芯912和延伸穿過HPNP911的外殼進(jìn)入到中空內(nèi)芯912的孔913(例如介孔)。例如，HPNP911可以包括允許小分子進(jìn)出HPNP911的小孔隙。例如，過程910可以包括過程110、120、130和140的實(shí)施以產(chǎn)生HPNP911。圖9B示出了將酶925裝載入HPNP911的過程920。例如，過程920可以包括將高濃度的含酶925的溶液添加至含HPNP911的溶液(例如，其可以在HPNP懸浮液中)。例如，過程920可以包括酶925，其通過擴(kuò)散穿過孔913擴(kuò)散入HPNP911的中空內(nèi)部912。例如，因?yàn)榕c酶比較，孔相對(duì)大，所以酶925可以自由地快速擴(kuò)散入結(jié)構(gòu)中，使HPNP911內(nèi)部和外部的濃度平衡。在其他實(shí)例中，過程920可以使酶925通過電泳力穿過孔913而裝載入HPNP911的中空內(nèi)部912。圖9C示出了用層931部分覆蓋孔913和HPNP911表面的過程930。例如，過程930可以包括沉淀大的帶正電荷的聚合物，諸如PLL。例如，層931可以配置為PLL聚合物層，其可以在HPNP911和孔913的表面之上創(chuàng)建網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。圖9D示出了將酶925密封在HPNP911內(nèi)以形成密封的中空多孔納米顆粒945的過程940。例如，過程940可以包括在層覆蓋的HPNP911之上形成層941。例如，溶膠凝膠反應(yīng)物的進(jìn)一步添加可以在覆蓋孔913的初始層的頂部上創(chuàng)建另一層(例如，層941)，例如，通過在示例性PLL聚合物上的成核位點(diǎn)，由此將酶925封閉在SHPNP945 內(nèi)。
[0103]例如，在二氧化硅HPNP的情況下，HPNP911的表面由于SiO -基而帶負(fù)電荷?？梢蕴砑又T如PLL的帶正電荷的聚合物以吸附至顆粒的表面并且將表面電荷改變?yōu)檎?。隨后，可以添加TMOS以在表面上生長(zhǎng)新的二氧化硅層，例如，閉合HPNP911的孔(例如介孔)。該示例性反應(yīng)可以發(fā)生在接近中性的緩沖液環(huán)境中并且不會(huì)損害酶負(fù)荷。例如，一旦將介孔閉合，則負(fù)荷被封裝在SHPNP945內(nèi)而不能逃離。然而，負(fù)荷仍可以經(jīng)由擴(kuò)散穿過納米孔與周圍環(huán)境中的小分子相互作用。
[0104]該示例性能力可以用于提供多種益處。例如，示例性酶負(fù)荷避開免疫系統(tǒng)，例如，因?yàn)榭贵w過大而不能穿過納米孔以觸及酶。例如，使示例性酶負(fù)荷免于免疫系統(tǒng)且免于消化性酶，例如蛋白酶，而仍為完全活性的。例如，可以用鈍化和靶向配體覆蓋示例性SHPNP，而無需任何有效負(fù)荷、例如酶負(fù)載的化學(xué)修飾，從而為體內(nèi)應(yīng)用提供了有效的策略。
[0105]進(jìn)行示例性實(shí)施以表征酶活性和所公開的SHPNP的保護(hù)能力。例如，來自蠟樣芽孢桿菌的青霉素酶為催化P -內(nèi)酰胺環(huán)水解的P -內(nèi)酰胺酶家族的成員之一。在SHPNP的示例性表征實(shí)施中利用蠟樣芽孢桿菌青霉素酶，例如，因?yàn)閷?duì)基于酶-前藥的治療，它可以被認(rèn)為是優(yōu)選的(6-內(nèi)酰胺酶，并且靈敏的顯色和熒光測(cè)定是可用的。例如，后者使用底物CCF2，其包含經(jīng)由頭孢菌素基團(tuán)而與熒光素連接的香豆素。例如在被青霉素酶分裂之前，409nm處香豆素的激發(fā)引起向熒光素的有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，產(chǎn)生約520nm的綠色發(fā)射峰。例如，青霉素酶分裂頭孢菌素基團(tuán)，將熒光素與香豆素分離并且干擾FRET，以至于相同的香豆素激發(fā)產(chǎn)生藍(lán)色的447nm發(fā)射。CCF2通常以乙酰氧基甲基(AM)酯形式使用，其在嚙齒類動(dòng)物血漿和血清以及細(xì)胞內(nèi)部中，當(dāng)暴露于酯酶時(shí)迅速復(fù)原為CCF2。
[0106]圖1OA和IOB為示出所公開的技術(shù)的密封中空多孔納米顆粒的酶活性的示例性數(shù)據(jù)圖。圖1OA示出了在正常血清中帶有封裝的青霉素酶SHPNP與作為底物的CCF2-AM的活性比較的數(shù)據(jù)圖1010。例如，表征4個(gè)示例性樣品，其包括為中空納米殼的樣品1，為HPNP的樣品2，為密封中空納米殼的樣品3以及為SHPNP的樣品4。所有4個(gè)示例性樣品都與酶孵育，隨后用IX PBS連續(xù)洗滌并且在用IX PBS連續(xù)洗滌后再用蛋白酶-K洗滌。在酶孵育后，洗滌前，進(jìn)行示例性樣品3和4的示例性密封反應(yīng)。數(shù)據(jù)圖1010所示的數(shù)據(jù)例示了封裝在示例性SHPNP內(nèi)的青霉素酶(例如MW=28kDa)的活性。所有示例性樣品都暴露于蛋白酶-K，例如，其可以消化蛋白。因此，例如，暴露于蛋白酶-K后的封裝的酶的持續(xù)不變的活性證明了通過封裝在SHPNP中而使所封裝的酶抗蛋白水解的保護(hù)作用(如稍后圖12和13所示)。
[0107]例如,如圖1OA所示,數(shù)據(jù)圖1010示出，示例性樣品I和示例性樣品2沒有表現(xiàn)出活性或表現(xiàn)出很少的活性，這在暴露于蛋白酶-K之后是可預(yù)期的。例如，數(shù)據(jù)圖1010示出了示例性樣品3與示例性樣品I相比在活性方面有2倍增加，例如，這可以歸因于在粘于表面的酶之上由二氧化硅的第二層提供的保護(hù)，確認(rèn)了額外的二氧化硅層的保護(hù)效應(yīng)。然而，為SHPNP的示例性樣品4示出了活性顯著的增加。例如，數(shù)據(jù)圖1010示出了 SHPNP與示例性樣品3相比在活性方面有10倍的增加，例如，證明了增加并不歸因于覆蓋表面的酶而是歸因于填滿中空內(nèi)部的酶分子。示例性HPNP(樣品2)和示例性SHPNP(樣品4)之間所示的顯著差異進(jìn)一步確認(rèn)了這一發(fā)現(xiàn)，例如，因?yàn)檫@兩個(gè)樣品經(jīng)歷了相同的裝配技術(shù)，除了示例性樣品4的額外的密封過程。
[0108]圖1OB示出了針對(duì)所封裝的青霉素酶的多克隆抗體結(jié)合的活性比較的數(shù)據(jù)圖1020。數(shù)據(jù)圖1020包括示例性紅條1021，表示來自具有可使抗體分子與生物素連接的鏈霉親和素的Alexa488的熒光。數(shù)據(jù)圖1020包括示例性藍(lán)條1022，表示來自Cy5標(biāo)記的青霉素酶的熒光。例如，表征3個(gè)示例性樣品，其包括為空SHPNP的樣品1，為中空二氧化硅殼的樣品2 (其中青霉素酶被吸附在表面上)，為具有所封裝的青霉素酶的SHPNP的樣品3。例如，示例性樣品I和3都與蛋白酶-K孵育以移除任何可能粘于表面的酶。洗滌所有3個(gè)示例性樣品幾次以除去未結(jié)合的酶。
[0109]圖1OB所示的示例性數(shù)據(jù)圖1020可以用于評(píng)估示例性SHPNP中所封裝的酶的抗體通路。例如，用Cy5熒光標(biāo)記青霉素酶并且用針對(duì)青霉素酶的兔多克隆生物素化抗體探測(cè)它的可及性， 例如通過Alexa488標(biāo)記的鏈霉親和素檢測(cè)。數(shù)據(jù)圖1020示出了示例性樣品I和3所測(cè)量的強(qiáng)度為相當(dāng)?shù)?例如，在標(biāo)準(zhǔn)誤差區(qū)間內(nèi))，例如，表示來自于示例性樣品3的輕微的熒光與抗體無關(guān)，而是來自Alexa488-鏈霉親和素的非特異性吸附。例如，示例性樣品2示出了高約5倍的強(qiáng)度，例如，例示了與二氧化硅表面上的酶分子的顯著抗體結(jié)合。例如，數(shù)據(jù)圖1020示出了沒有來自于示例性樣品I的熒光，例如，由于缺少青霉素酶而是可預(yù)期的。例如，數(shù)據(jù)圖1020示出沒有與示例性樣品3的抗體結(jié)合，例如，盡管其具有最高的青霉素酶含量，但這產(chǎn)生了對(duì)SHPNP內(nèi)所封裝的酶的抗體通路的防止。
[0110]圖10C-10E為示出示例性納米顆粒的電子顯微圖。圖1OC示出了示例性200nm中空無介孔納米殼的圖1030。圖1OD示出了由200nm模板和40nm納米掩模所形成的示例性HPNP的圖1040。圖1OE示出了通過密封HPNP所形成的示例性SHPNP (通過利用200nm模板和40nm納米掩模的裝配方法所產(chǎn)生的)的圖1050。圖1030、1040和1050中示例性比例尺代表lOOnm。
[0111]圖11示出了展示BALB/c小鼠中海腎熒光素酶(RenLuc)的體內(nèi)活性的圖1100。例如，以在先前實(shí)施中與青霉素酶相似的方式將示例性RenLuc酶封裝在200nm SHPNP中，例如包括用蛋白酶-K修整以除去任何表面暴露的RenLuc。圖1100中照亮的和發(fā)光的圖片是重疊的。例如，用100 u L的濃度為5.68X IO12個(gè)顆粒/mL的RenLuc酶封裝的SHPNP溶液肌內(nèi)注射示例性BALB/c小鼠1101(圖1100左側(cè)所示)，隨后,5分鐘后,側(cè)面尾靜脈注射IOiig節(jié)基-腔腸素。作為對(duì)照,用100 ii L的濃度為8 ii g/mK的游離RenLuc酶肌內(nèi)注射示例性小鼠1102(圖1100的右側(cè)所示)。這兩種示例性注射都展示了相似的體外活性(如稍后圖16和17所示)。例如，圖1100中所獲得的數(shù)據(jù)包括示例性程序，其中肌內(nèi)注射后5分鐘，在側(cè)面尾靜脈中靜脈給予IOu g芐基-腔腸素。靜脈注射后5分鐘測(cè)量來自每只小鼠的發(fā)光強(qiáng)度。來自于用RenLuc封裝的SHPNP注射的小鼠的發(fā)光強(qiáng)度測(cè)量為2.6X 105p/sec/cm2/sr,這表示SHPNP內(nèi)封裝的酶的局部活性,而來自于用游離RenLuc注射的小鼠的強(qiáng)度低于檢測(cè)極限。例如，來自于后者的發(fā)光的缺失主要?dú)w因于游離酶擴(kuò)散出注射位點(diǎn)。
[0112]圖12示出了數(shù)據(jù)圖1200，其示出在37°C下、于IX正常小鼠血清中，與蛋白酶-K孵育12小時(shí)或不與蛋白酶-K孵育12小時(shí)的游離蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的活性圖。例如，
5u M CCF2-AM被用作底物，并且通過409nm激發(fā)，在100%正常小鼠血清中測(cè)量活性，作為藍(lán)色熒光(447nm)與綠色熒光(520nm)之比的初始增加速率。數(shù)據(jù)圖1200包括不與蛋白酶-K孵育的游離蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的繪圖數(shù)據(jù)1201和與蛋白酶-K孵育的游離蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的繪圖數(shù)據(jù)1202。
[0113]圖13示出了數(shù)據(jù)圖1300，其示出在37°C下、于IX正常的小鼠血清中，與蛋白酶-K孵育12小時(shí)或不與蛋白酶-K孵育12小時(shí)的游離海腎熒光素酶的活性圖。例如，每一反應(yīng)為100 u L，總計(jì)含有10 u g/mL芐基-腔腸素作為底物。數(shù)據(jù)圖1300包括與蛋白酶-K孵育的游離海腎熒光素酶的繪圖數(shù)據(jù)1301和不與蛋白酶-K孵育的游離海腎熒光素酶的繪圖數(shù)據(jù) 1302。
[0114]圖14示出了數(shù)據(jù)圖1400，其示出蠟樣芽胞桿菌青霉素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，頭孢硝噻測(cè)定中吸光度的初始增加速率代表數(shù)據(jù)圖1400的縱軸。
[0115]圖15示出了數(shù)據(jù)圖1500，其示出與以1.42 X IO12個(gè)顆粒/mL濃度而封裝在密封中空多孔納米顆粒內(nèi)的蠟樣芽胞桿菌青霉素酶相比，不同濃度的游離蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的活性繪圖。例如，每一反應(yīng)為100 u L，總計(jì)含有250 u g/mL頭孢硝噻作為底物，并且在486nm處測(cè)量吸光度。例如，數(shù)據(jù)圖1500示出包括Omg/mL(曲線1501),0.lmg/mL(曲線1502)、0.02mg/mL (曲線 1503)、0.004mg/mL (曲線 1504)和 0.0008mg/mL (曲線 1505)的濃度的青霉素酶活性，并且示出1.42X1012fSHPNP/mL(曲線1506)。
[0116]例如，與封裝在SHPNP內(nèi)的蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的所測(cè)量的活性相比，游離蠟樣芽胞桿菌青霉素酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線(數(shù)據(jù)圖1400所示)對(duì)應(yīng)于來自于單一 200nm SHPNP的4.58X IO-14個(gè)國(guó)際單位(IU)，例如基于HPNP合成產(chǎn)率為100%時(shí)約50個(gè)酶分子/顆粒。例如，酶負(fù)荷期間，最初用26.4 ii M孵育HPNP。例如，單一 SHPNP內(nèi)的酶的測(cè)定濃度可以對(duì)應(yīng)于19.5 u M，例如，產(chǎn)生74%的表觀負(fù)荷效率?？赡苡绊懺摪俜直鹊氖纠砸蛩匕ㄒ韵聨讉€(gè)方面。例如，HPNP合成的產(chǎn)率可小于100%，產(chǎn)生了不能被密封但仍被計(jì)為SHPNP的破碎的HPNP。例如，在用于二氧化硅縮聚反應(yīng)的稀釋期間，可能有一些酶從顆粒泄漏出去。例如，底物向酶的通路可能受限于底物穿過多孔殼的擴(kuò)散。例如，通過密封反應(yīng)期間酶溶液的濃度，顆粒內(nèi)的酶濃度可為可調(diào)節(jié)的。
[0117]圖16示出了數(shù)據(jù)圖1600，其示出海腎熒光素酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于與芐基-腸腔素相互作用所產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度代表數(shù)據(jù)圖1600的縱軸。
[0118]圖17示出了數(shù)據(jù)圖1700，其示出與以1.42 X IO12個(gè)顆粒/mL濃度封裝在密封的中空多孔納米顆粒內(nèi)的海腎熒光素酶相比，不同濃度的海腎熒光素酶的活性圖。例如，每一反應(yīng)為IOOiiL,總計(jì)含有IOii g/mL芐基-腸腔素作為底物。數(shù)據(jù)圖1700示出了包括0.0008mg/mL (曲線 1701)、0.0004mg/mL (曲線 1702)、0.0002mg/mL (曲線 1703)、0.0OOlmg/mL (曲線1704)和0mg/mL(曲線1705)的濃度的海腎熒光素酶活性，并且示出了 1.42 X IO12個(gè) SHPNP/mL(曲線 I7O6)。
[0119]所公開的SHPNP例示了用于封裝諸如酶的功能性生物分子的平臺(tái)，所述平臺(tái)作用于可以穿過SHPNP的小尺寸孔隙而自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)出的小分子底物。可以大規(guī)模的制造具有嚴(yán)格控制的尺寸和特性的所公開的SHPNP，并且酶可以保存在免受來自其他生物分子的任何特異性或非特異性干擾的受控環(huán)境中。所公開的SHPNP的示例性實(shí)施例示了所封裝的酶維持它們的活性并有效地被庇護(hù)以免于抗體或蛋白酶，例如，因?yàn)闅さ目紫侗瓤贵w、蛋白酶或此類分子更小。而且，例如，SHPNP的表面修飾可以增強(qiáng)體內(nèi)循環(huán)和靶向，例如，在所封裝的有效負(fù)荷上不需要任何修飾。所公開的技術(shù)提供了具有顆粒大小控制和滲透性的所述SHPNP的靈活的裝配技術(shù)，并且對(duì)特定負(fù)荷和底物，可以修整和優(yōu)化所公開的SHPNP。
[0120]在另一方面，所公開的技術(shù)可以包括用于裝配具有空芯、多孔表面和可密封孔的金屬納米顆粒的裝配方案。圖18A和18B示出了例示一示例性金屬納米顆粒合成方案的示意圖。
[0121]圖18A示出了例如通過靜電吸引將具有功能化表面1816(例如，羧化表面)的掩蔽顆粒1815與模板芯顆粒1811的功能化表面1812(例如，胺化表面)結(jié)合的過程1820。例如，因?yàn)槭纠贼然w粒1815具有帶負(fù)電荷的表面，所以它們排斥負(fù)離子并且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應(yīng)，例如，封閉示例性胺化模板顆粒1811的外表面的某些帶正電荷的區(qū)域。
[0122]圖18A示出了將膠體金屬層1831 (例如，膠體金)添加至掩蔽顆粒1815—模板芯顆粒1811復(fù)合體的過程1830。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒結(jié)合的掩蔽顆粒的溶液。示例性溶膠凝膠反應(yīng)可以發(fā)生在沿著模板芯顆粒1811的表面1812的帶正電荷的區(qū)域中，例如，未被掩蔽顆粒1815覆蓋或封閉的區(qū)域，形成示例性膠體金層1831。
[0123]圖18A示出了使初始層1831增厚成厚層1841的過程1840。例如，初始層1831可以由膠體金形成，所述膠體金通過過程1830中的溶膠凝膠反應(yīng)而產(chǎn)生。示例性膠體金層1831可以用作進(jìn)一步生長(zhǎng)金的成核位點(diǎn)，例如，形成厚層1841。例如，過程1840可以包括添加金酸和甲醛作為還原劑以用于形成示例性厚金層1841。
[0124]圖18A示出了過程1850，其示出形成中空多孔納米顆粒，例如，通過移除模板顆粒1811和掩蔽顆粒1815。例如，一旦形成具有所需厚度的層1841，則將模板和掩蔽顆粒移除，例如，通過各種方法，包括通過溶劑將它們?nèi)芙?、煅燒、熔融或燃燒，或這些或其他相似方法的組合。例如，過程1850的實(shí)施產(chǎn)生了金屬HPNP (例如金HPNP)，其包括具有孔1855的空的或中空的多孔殼1841和空的或中空的內(nèi)部1852。
[0125]一旦創(chuàng)建了示例性金屬HPNP，則它們可以裝載有其他物質(zhì)，并且被密封以封裝所述其他物質(zhì)，例如，通過實(shí)施以前所述的和圖1B和IC中例示的方法。例如，圖18B示出了將負(fù)荷顆粒1861裝載入金屬HPNP1841的中空內(nèi)部區(qū)域1852的過程1860。例如，通過將負(fù)荷物質(zhì)的高濃度溶液添加至金屬HPNP的溶液，可以使金屬HPNP的溶液裝載有負(fù)荷物質(zhì)。通過幾個(gè)方法之一可以實(shí)施過程I860。在一實(shí)例中，負(fù)荷顆粒1861可以通過孔1855擴(kuò)散入金屬HPNP1841。在其他實(shí)例中，負(fù)荷顆粒1861可以通過包括例如電泳力在內(nèi)的非擴(kuò)散方式穿過它們的孔1855而進(jìn)入金屬HPNP1841的內(nèi)部區(qū)域1852。將各種類型的材料用作負(fù)荷，可以實(shí)施過程I860以用于各種應(yīng)用，例如，所述材料包括但不限于藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶和/或其他蛋白、脂質(zhì)、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。例如，繼過程1860的實(shí)施之后，可以密封金屬HPNP1841以形成密封的金屬HPNP (金屬SHPNP)，例如，通過實(shí)施以前所述的和圖1C中所示的過程170。圖18C示出了圖1890，其示出在500nm脂肪族-胺聚苯乙烯芯萃取之前的示例性金HPNP。
[0126]在另一方面，所公開的技術(shù)可以包括用于裝配具有空芯內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部顆粒、多孔表面和可密封孔的納米顆粒的裝配方案。圖19示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0127]圖19示出了將具有功能化表面1916(例如羧化表面)的掩蔽顆粒1915與模板芯顆粒1911的功能化表面1912(例如胺化表面)結(jié)合的過程1920，所述模板顆粒1911具有至少一個(gè)內(nèi)部顆粒1913。例如，模板顆粒1911可以為至少一個(gè)內(nèi)部顆粒1913的外覆蓋層，或模板顆粒1911可以為中空顆粒，所述空芯顆粒在其中空內(nèi)部之內(nèi)封閉至少一個(gè)內(nèi)部顆粒1913。例如，過程1920可以包括將掩蔽顆粒1915與模板顆粒1911的表面1912結(jié)合，通過靜電相互作用或通過例如包括但不限于氫鍵、共價(jià)鍵、磁性吸引、疏水性相互作用等的方式。例如，因?yàn)槭纠贼然w粒1915具有帶負(fù)電荷的表面，它們排斥負(fù)離子并且阻止在它們表面上的溶膠凝膠反應(yīng)，例如封閉示例性胺化模板顆粒1911的外表面的某些帶正電荷的區(qū)域。
[0128]圖19示出了將層1931(例如二氧化硅)添加至掩蔽顆粒1915—模板芯顆粒1911復(fù)合體的過程1930。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒結(jié)合的掩蔽顆粒的溶液。示例性溶膠凝膠反應(yīng)可以發(fā)生在沿著模板芯顆粒1911的表面1912的帶正電荷的區(qū)域中，例如，未被掩蔽顆粒1915覆蓋或封閉的區(qū)域，形成示例性層1931。
[0129]圖19示出了例如通過移除模板顆粒1911和掩蔽顆粒1915形成在內(nèi)部區(qū)域1942內(nèi)包括內(nèi)部顆粒1913的中空多孔納米顆粒的過程1940。例如，一旦形成具有所需厚度的層1931，則將模板和掩蔽顆粒移除，例如，通過各種方法，包括通過溶劑將它們?nèi)芙?、煅燒、熔融或燃燒，或這些或其他相似方法的組合。例如，過程1940的實(shí)施產(chǎn)生了包括多孔殼1941和的孔1945的HPNP，所述多孔殼1941包括在其中空內(nèi)部區(qū)域1942中的內(nèi)部顆粒1913，所述孔1945遍及多孔殼1941而分布，例如基于掩蔽顆粒1915與模板顆粒1911結(jié)合的最初位置。
[0130]一旦創(chuàng)建了包括至少一個(gè)內(nèi)部顆粒的示例性HPNP，則可以使它們裝載有其他物質(zhì)并被密封以封裝所述其他物質(zhì)，例如，通過實(shí)施以前所述的和圖1B和IC中例示的方法。例如，圖19示出了將負(fù)荷顆粒1951裝載入HPNP1941的中空內(nèi)部區(qū)域1942的過程1950。例如，通過將負(fù)荷物質(zhì)的高濃度溶液添加至示例性HPNP的溶液，可以用負(fù)荷物質(zhì)裝載包括所封閉的內(nèi)部顆粒的示例性HPNP的溶液。通過幾個(gè)方法之一可以實(shí)施過程1950。在一實(shí)例中，負(fù)荷顆粒1951可以通過孔1945擴(kuò)散入HPNP1941。在其他實(shí)例中，負(fù)荷顆粒1951可以通過包括例如電泳力在內(nèi)非擴(kuò)散方式穿過它們的孔1945而進(jìn)入HPNP1941的內(nèi)部區(qū)域1942。將各種類型的材料用作負(fù)荷，可以實(shí)施過程1950以用于各種應(yīng)用，例如，所述材料包括但不限于藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶和/或其他蛋白、脂質(zhì)、金屬、聚合物以及陶瓷顆粒。例如，在HPNP1941的內(nèi)部區(qū)域1942內(nèi)，示例性負(fù)荷顆粒1951可以與內(nèi)部顆粒1913相互作用，例如，形成修飾的內(nèi)部顆粒1955。例如，示例性負(fù)荷顆粒1951可以結(jié)合于內(nèi)部顆粒1913的外表面，或在其他實(shí)例中，示例性負(fù)荷顆粒1951可以化學(xué)地與內(nèi)部顆粒1913相互作用。例如，修飾的內(nèi)部顆粒1955可以展示出在內(nèi)部顆粒1913上的新的性質(zhì)，這以其他方式則不能得到。
[0131]在另一方面，所公開的技術(shù)可以包括用于裝配具有帶有空芯的一個(gè)孔的納米顆粒的裝配方案，例如，其中孔可以為可密封的。圖20示出了例示一示例性納米顆粒合成方案的示意圖。
[0132]圖20示出了過程2010的實(shí)例，其中大的掩蔽顆粒2015與芯模板顆粒2011混合在一起。例如，大的掩蔽顆粒2015可以是配置為具有表面電荷、例如負(fù)表面電荷的納米顆粒。例如，大的掩蔽顆粒2015還可以包括帶有功能化外表面2016、例如具有表面電荷的顆粒。例如，示例性掩蔽顆粒2015可為聚苯乙烯納米顆粒，并且示例性功能化表面2016可為羧化功能化層。例如，模板顆粒2011可以是配置為具有與掩蔽顆粒2015的表面電荷的極性相反的表面電荷、例如正表面電荷的納米顆粒。例如，模板顆粒2011還可以包括帶有功能化外表面2012的顆粒。例如,示例性模板顆粒2011可以為聚苯乙烯納米顆粒，并且示例性功能化表面2012可為胺功能化層。例如，一旦將示例性羧化掩蔽顆粒2015與胺化模板顆粒2011混合，則羧化顆粒2015可以與胺化模板顆粒2011結(jié)合。
[0133]圖20也示出了例如通過靜電相互作用將具有羧化功能化表面2016的大的掩蔽顆粒2015與模板顆粒2011的胺化功能化表面2012結(jié)合的過程2020的實(shí)例。在其他實(shí)例中，過程2020可以包括通過其他顆粒吸引方式將大的掩蔽顆粒2015與模板顆粒2011的表面2012結(jié)合，所述顆粒吸引方式例如包括但不限于氫鍵、共價(jià)鍵、磁吸引、疏水性相互作用等。
[0134]圖20還示出了將層2031添加至模板顆粒2011的過程2030的實(shí)例。例如，可以將溶膠凝膠試劑添加至含有與模板顆粒2011結(jié)合的掩蔽顆粒2015的溶液。示例性溶膠凝膠反應(yīng)可以發(fā)生在沿著模板顆粒2011的表面2012的帶正電荷的區(qū)域中，例如，未被掩蔽顆粒2015覆蓋或封閉的區(qū)域。例如，過程2030可以用覆蓋層2031覆蓋模板顆粒2011的暴露的表面，而不覆蓋存在掩蔽顆粒2015的位置。例如，覆蓋層2031可為多孔材料。例如，層2031可為一種材料(例如二氧化硅)以使過程2030可以產(chǎn)生在模板顆粒2011的表面上形成的多孔層。例如，過程2030中的溶膠凝膠的添加可以啟動(dòng)二氧化硅生長(zhǎng)，例如根植于示例性胺化功能化表面2012的氨基。例如，覆蓋層2031還可以為無孔材料。在某些實(shí)例中，過程2030可以包括通過其他方式將層2031添加至模板顆粒2011，例如所述其他方式包括但不限于基于材料的排他性、或氧化還原化學(xué)過程，以及其他技術(shù)，所述氧化還原化學(xué)過程僅在一顆粒(例如模板顆粒2011)的表面上而不在其他顆粒(例如掩蔽顆粒2015)的表面上形成層2031。用作覆蓋層的示例性材料可以包括多孔的或無孔的材料，或可降解的材料(例如，其在某些環(huán)境中或在特定條件下或通過示例性觸發(fā)而可以溶解或降解，例如條件和/或觸發(fā)包括pH、溫度、壓力、分子相互作用、或其他條件和/或觸發(fā))。
[0135]另外，圖20示出了例如通過移除模板顆粒2011和掩蔽顆粒2015而形成中空納米顆粒的過程2040的實(shí)例。例如，一旦形成了具有所需厚度的層2031，則例如通過各種方法，包括通過溶劑將它們?nèi)芙?、煅燒、熔融、或燃燒、或這些方法或其他相似方法的組合，移除模板顆粒2011和掩蔽顆粒2015。例如，過程2040的實(shí)施產(chǎn)生了中空納米顆粒，其包括帶有孔2045的空的或中空的多孔殼2041和中空內(nèi)部2042。在某些實(shí)例中，可以實(shí)施過程2040以形成中空無孔納米顆粒，例如，當(dāng)層2031為多孔材料時(shí)。在其他實(shí)例中，可以實(shí)施過程2040以形成中空無孔納米顆粒，例如，當(dāng)層2031為無孔材料時(shí)。一旦形成了示例性中空殼結(jié)構(gòu)，則其可以裝載有其他物質(zhì)并被密封以封裝所述其他物質(zhì)，例如，通過實(shí)施以前所述的和圖1B和IC中所例示的方法。
[0136]所述納米顆粒平臺(tái)的應(yīng)用可以至少包括以下方面。例如，比孔隙更大的大分子可以穿過表面上的孔而擴(kuò)散到納米顆粒內(nèi)，并稍后可以被逐漸地釋放。例如，一旦大分子穿過孔而擴(kuò)散到納米顆粒內(nèi)部，則可以將孔密封。因?yàn)轭w粒表面為多孔的，因此小的分子可以擴(kuò)散進(jìn)出，從而提供了大分子與外部環(huán)境的連通且同時(shí)保護(hù)環(huán)境免于大分子或保護(hù)大分子免于環(huán)境。例如，顆粒內(nèi)部的大分子可以用作報(bào)告環(huán)境中某些事件的傳感器而不被暴露于環(huán)境。例如，一旦大分子擴(kuò)散到顆粒內(nèi)，則可以用具有特定性質(zhì)(例如降解性質(zhì))的分子密封孔。例如，可以利用特定性質(zhì)，并且可以釋放封裝在顆粒內(nèi)的大分子。例如，密封在HPNP內(nèi)的大分子可以包括特定性質(zhì)，諸如與足夠小到穿過孔隙的分子反應(yīng)。例如，大分子可以為用于激活小的藥物分子的酶分子。因?yàn)槭纠悦阜肿颖环庋b在顆粒內(nèi)，所以它避免了免疫系統(tǒng)。例如，HPNP的表面可以由靶向劑功能化，例如，用于有效的布置和遞送到靶區(qū)域。例如，可以分別將失活的藥物引入循環(huán)。因?yàn)槭纠运幬锊粸榧せ畹?，所以藥物不?huì)有劑量限制。例如，一旦示例性未激活的藥物與酶負(fù)荷的HPNP在體內(nèi)的靶區(qū)域中相遇，則藥物可以擴(kuò)散到HPNP內(nèi)并且通過酶而變成激活的；并且激活的藥物可以擴(kuò)散出HPNP達(dá)到靶區(qū)域，例如，由此只影響靶區(qū)域。
[0137]雖然本專利文件包含許多細(xì)節(jié)，但這些不應(yīng)該被解釋為對(duì)任何發(fā)明范圍的或所要求的范圍的限制，而是解釋為對(duì)特定發(fā)明的特定實(shí)施方案的具體特征的描述。也可以在單個(gè)實(shí)施方案中組合地實(shí)施本專利文獻(xiàn)的單獨(dú)實(shí)施方案中所述的某些特征。相反地，也可以在多個(gè)實(shí)施方案中分別地或以任何適合的亞組合來實(shí)施單個(gè)實(shí)施方案中所述的各種特性。而且，盡管以上所述的特性為在某些實(shí)施方案中發(fā)揮作用，甚至一開始就要求如此，但來自所要求的組合的一個(gè)或多個(gè)特性可以在某些情況下從組合中被剔除，并且所要求的組合可涉及亞組合或亞組合變體。
[0138]相似地，雖然在附圖中以特定順序描述了操作，但這不應(yīng)該理解為必須以所示特定順序或先后次序進(jìn)行此類操作，或必須進(jìn)行所有例示的操作來獲得所需的結(jié)果。而且，以上所述實(shí)施方案中的各種系統(tǒng)組件的分離不應(yīng)該理解為在所有實(shí)施方案中必須此類分離。
[0139]只描述了很少的實(shí)施和實(shí)例，并且基于本專利文件所描述的和所例示的內(nèi)容可以進(jìn)行其他實(shí)施、改善和變化。
【權(quán)利要求】
1.裝配顆粒的方法，其包括: 將芯顆粒與一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒組合以形成模板，其中所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒與所述芯顆粒結(jié)合并且覆蓋所述芯顆粒的表面的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中每一個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于在所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒中每一個(gè)掩蔽顆粒與所述芯顆粒之間形成的表面區(qū)域； 在所述模板之上形成多孔材料層，其中所述層形成在除已覆蓋的所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之外的所述芯顆粒的表面之上；以及 移除所述模板以產(chǎn)生由多孔材料形成的顆粒，所述顆粒具有一個(gè)或多個(gè)在中空的內(nèi)部區(qū)域與所述顆粒的外表面之間延伸的孔，所述一個(gè)或多個(gè)孔在所述外表面上具有基本為所述表面區(qū)域尺寸的尺寸，并且分布在所述顆粒的所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域上。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其還包括功能化所述芯顆粒的表面和所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒的外表面，其中所述功能化產(chǎn)生了在所述芯顆粒的表面上的正電荷和在所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒的外表面上的負(fù)電荷。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒通過靜電相互作用與所述芯顆粒結(jié)合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述形成層包括在所述模板的表面上進(jìn)行膠體溶膠凝膠反應(yīng)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多孔材料包括二氧化硅或膠體金屬中的至少一種。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述膠體金屬包括金，并且所述方法還包括由用作成核位點(diǎn)的膠體金層增厚所述多孔材料層以用于金的進(jìn)一步生長(zhǎng)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述移除包括利用所述芯顆粒和所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒的煅燒、溶解、熔融、或燃燒中的至少一種。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括基于所述芯顆粒的尺寸配置所述顆粒的總尺寸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括基于所述掩蔽顆粒的尺寸配置所述顆粒的一個(gè)或多個(gè)孔的開口尺寸。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括通過控制所述芯顆粒和一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒的相對(duì)摩爾濃度來確定所述顆粒的一個(gè)或多個(gè)的孔的數(shù)量。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括: 將物質(zhì)通過所述一個(gè)或多個(gè)孔裝載入所述顆粒的內(nèi)部區(qū)域，所述物質(zhì)不能穿過所述多孔材料；以及 在所述顆粒上形成允許所選顆粒穿過的外多孔層，其中所述外多孔層密封所述顆粒的一個(gè)或多個(gè)的孔，由此將所述物質(zhì)封閉在所述顆粒內(nèi)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述將物質(zhì)裝載入所述內(nèi)部區(qū)域是通過擴(kuò)散或電泳力中的至少一種而發(fā)生的。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述物質(zhì)包括藥物、生物可降解大分子、pH敏感分子、酶、蛋白、激素、糖蛋白、糖脂、核酸、適配子、脂質(zhì)、或金屬納米顆粒、聚合物納米顆?；蛱沾杉{米顆粒中的至少一種。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述形成外層包括在所述顆粒上進(jìn)行膠體溶膠凝膠反應(yīng)。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其還包括: 在所述顆粒的外表面上形成覆蓋層，其中所形成的覆蓋層具有促進(jìn)形成所述外多孔層的膠體溶膠凝膠反應(yīng)的電荷。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述電荷為正電荷并且所形成的覆蓋層包括創(chuàng)建的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所形成的覆蓋層為聚-L-賴氨酸。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，其還包括將配體分子與所述顆粒的外表面結(jié)合，所述配體分子對(duì)靶結(jié)構(gòu)上的受體分子具有親和性，從而將所述顆粒吸引并結(jié)合至所述靶結(jié)構(gòu)。
19.用于運(yùn)載負(fù)荷的納米顆粒裝置，其包括: 包括至少兩層的殼結(jié)構(gòu)，所述至少兩層包括內(nèi)層和外層，所述內(nèi)層被構(gòu)造為封閉中空內(nèi)部區(qū)域并且包括一個(gè)或多個(gè)貫穿所述內(nèi)層的孔，所述外層在所述內(nèi)層周圍形成， 其中所述殼結(jié)構(gòu)包括在所述中空內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的物質(zhì)，所述物質(zhì)通過所述一個(gè)或多個(gè)孔進(jìn)入所述殼結(jié)構(gòu)并且不能穿過所述外層。
20.如權(quán)利要求19所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結(jié)構(gòu)具有包括二氧化硅、金、磷酸鈣中至少一種的材料，或者具有鈣外覆蓋層的材料。
21.如權(quán)利要求19所述的納米顆粒裝置，其中所述物質(zhì)包括藥物、生物可降解大分子、PH敏感分子、酶、蛋白、激素`、糖蛋白、糖脂、核酸、適配子、脂質(zhì)、或金屬納米顆粒、聚合物納米顆粒或陶瓷納米顆粒中的至少一種。
22.如權(quán)利要求19所述的納米顆粒裝置，其還包括結(jié)合于所述殼結(jié)構(gòu)的配體分子，所述配體分子對(duì)靶結(jié)構(gòu)上的受體分子具有親和性，從而將所述殼結(jié)構(gòu)吸引并結(jié)合至所述靶結(jié)構(gòu)上。
23.如權(quán)利要求22所述的納米顆粒裝置，其中所述靶結(jié)構(gòu)為有機(jī)體內(nèi)的活組織，所述殼結(jié)構(gòu)與所述活組織結(jié)合。
24.如權(quán)利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述活組織為腫瘤。
25.如權(quán)利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結(jié)構(gòu)使所述物質(zhì)免于免疫反應(yīng)。
26.如權(quán)利要求23所述的納米顆粒裝置，其中所述外層具有多孔材料，所述物質(zhì)不能穿過所述多孔材料。
27.如權(quán)利要求26所述的納米顆粒裝置，其中所述有機(jī)體內(nèi)的未激活的分子通過穿過所述外層的孔隙而進(jìn)入所述殼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域并且與所述物質(zhì)相互作用，其中所述未激活的分子與所述物質(zhì)的相互作用形成激活的分子。
28.如權(quán)利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述激活的分子通過穿過所述外層的孔隙而離開所述殼結(jié)構(gòu)。
29.如權(quán)利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質(zhì)為酶并且所述未激活的分子是構(gòu)造成與所述酶相互作用的底物。
30.如權(quán)利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質(zhì)為酶并且所述未激活的分子為前藥，其中所述前藥與所述酶的相互作用形成活性藥物。
31.如權(quán)利要求27所述的納米顆粒裝置，其中所述物質(zhì)為對(duì)pH變化敏感的大分子并且所述未激活的分子為離子，其中所述離子與所述大分子的相互作用檢測(cè)PH變化。
32.如權(quán)利要求19所述的納米顆粒裝置，其中將所述顆粒布置在具有一種或多種廢棄分子的環(huán)境中，所述廢棄分子通過多個(gè)孔隙進(jìn)入所述殼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域并與所述物質(zhì)相互作用。
33.如權(quán)利要求32所述的納米顆粒裝置，其中所述一個(gè)或多個(gè)廢棄分子與所述物質(zhì)的相互作用包括所述一個(gè)或多個(gè)廢棄分子與所述物質(zhì)結(jié)合，由此從所述環(huán)境中移除所述一個(gè)或多個(gè)廢棄分子。
34.納米顆粒裝置，其包括: 殼結(jié)構(gòu)，其被構(gòu)造為包括一個(gè)或多個(gè)在中空的內(nèi)部區(qū)域與所述殼結(jié)構(gòu)的外表面之間延伸的孔；以及 至少一個(gè)中心顆粒，其包含于所述內(nèi)部區(qū)域內(nèi)并具有比所述一個(gè)或多個(gè)孔中每一個(gè)孔的尺寸更大的尺寸， 其中所述一個(gè)或多個(gè)孔被構(gòu)造為接收進(jìn)入所述內(nèi)部區(qū)域的物質(zhì)，并且所述物質(zhì)與至少一個(gè)中心顆粒結(jié)合。
35.如權(quán)利要求34所述的納米顆粒裝置，其中所述殼結(jié)構(gòu)還包括多個(gè)從所述內(nèi)部區(qū)域貫穿到所述外表面的孔隙，所述多個(gè)孔隙具有尺寸比所述一個(gè)或多個(gè)孔的開口的尺寸更小的開口。
36.裝配顆粒的方法，其包括: 將芯顆粒與一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒組合以形成模板，其中所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒與所述芯顆粒結(jié)合并且覆蓋所述芯顆粒的表面的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域中的每一個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于所述一個(gè)或多個(gè)掩蔽顆粒中每一個(gè)掩蔽顆粒與所述芯顆粒之間形成的表面區(qū)域； 在所述模板之上形成層，其中所述層形成在除已覆蓋的所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域之外的所述芯顆粒的表面之上；以及 移除所述模板以產(chǎn)生殼結(jié)構(gòu)，所述殼結(jié)構(gòu)具有一個(gè)或多個(gè)在中空的內(nèi)部區(qū)域與外表面之間延伸的孔，所述一個(gè)或多個(gè)孔在所述外表面上具有基本為所述表面區(qū)域尺寸的尺寸，并且分布在所述殼結(jié)構(gòu)的所述一個(gè)或多個(gè)區(qū)域上。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述層具有多孔材料。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其還包括: 將物質(zhì)通過所述一個(gè)或多個(gè)孔裝載入所述殼結(jié)構(gòu)的內(nèi)部區(qū)域；以及 在所述殼結(jié)構(gòu)之上形成外層，其中所述外層密封所述殼結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)孔并且將所述物質(zhì)封閉在所述內(nèi)部區(qū)域內(nèi)。
39.如權(quán)利要求 38所述的方法，其中所述外層具有允許所選顆粒穿過的多孔材料。
40.納米顆粒裝置，其包括: 包括至少兩層的殼結(jié)構(gòu)，所述至少兩層包括內(nèi)層和外層，所述內(nèi)層被構(gòu)造為封閉中空內(nèi)部區(qū)域并且包括一個(gè)或多個(gè)貫穿所述內(nèi)層的孔，所述外層具有多孔材料且在所述內(nèi)層周圍形成且密封所述一個(gè)或多個(gè)孔，以及 在所述中空內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包含的物質(zhì)，所述物質(zhì)不能穿過所述外層。
【文檔編號(hào)】B82B3/00GK103608285SQ201280029189
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2012年4月16日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月14日
【發(fā)明者】埃南柯·奧泰克, 薩迪科·C·伊賽納, 楊堅(jiān), 威廉·特羅格勒 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)