本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

已檢索的文獻(xiàn)中只有LKB1瞬時(shí)表達(dá)的研究，沒有穩(wěn)定表達(dá)LKB1研究文獻(xiàn)。

本發(fā)明應(yīng)用經(jīng)典分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)，主要有RT-PCR、分子克隆、酶切、基因重組、真核表達(dá)載體構(gòu)建、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選以及抗腫瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)。以下是檢索到的與本發(fā)明相關(guān)的研究。

解曉晨等在《hLKB1基因重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)和定位》(解剖科學(xué)進(jìn)展,2012，18(4):320～322)中構(gòu)建了pCDNA3.1/flag-hLKB 1真核表達(dá)載體，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到胃癌SGC-7901細(xì)胞中,分別利用Western blot和激光共聚焦掃描顯微技術(shù)檢測其表達(dá)和在胃癌細(xì)胞中的定位，沒有進(jìn)行LKB1對腫瘤細(xì)胞的功能檢測。張志強(qiáng)等在《LKB1對胰腺癌細(xì)胞遷移侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制研究》(實(shí)用癌癥雜志，2016，31(3):362-365)中將沈陽萬類公司購買的pCDNA3.1-LKB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1，檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后LKB1蛋白的表達(dá)水平，LKB1對人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1遷移、侵襲能力的影響，LKB1過表達(dá)對AMPKa、P-AMPKa及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)的影響。該研究主要研究了LKB1瞬時(shí)表達(dá)對人胰腺癌細(xì)胞ASPC-1的影響及作用機(jī)制，不能確定能否在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)及作用如何。唐喬喬等在《慢病毒介導(dǎo)的LKB1基因在子宮內(nèi)膜癌HEC.1A細(xì)胞中的表達(dá)》(中國癌癥防治雜志，2014，6(2)：133-136)中構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LKB1/pWP，用包裝成功后的病毒液感染子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞，以熒光定量PCR、Westem blot法檢測HEC-1A細(xì)胞中LKB1的相對表達(dá)量，沒有檢測其功能如何。包傳恩等在《LKB1協(xié)同二甲雙胍影響宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖與凋亡及其可能的機(jī)制》(中國腫瘤生物治療雜志，2014，21(2)153-159)中構(gòu)建含有LKB1基因的重組質(zhì)粒LKB1-pEGFP-nl并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，MTI檢測LKB1基因?qū)?jīng)二甲雙胍處理的HeLa細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞周期和凋亡的影響，相關(guān)蛋白AMPK、ACC和Rb磷酸化水平的影響，該研究也沒有對LKB1的功能進(jìn)行檢測。

以上都是在瞬時(shí)表達(dá)狀態(tài)下進(jìn)行的相關(guān)研究，瞬時(shí)表達(dá)主要是載體本身攜帶的啟動(dòng)子發(fā)揮作用，一般在48小時(shí)后即不表達(dá)，不能確定能否在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。而抗腫瘤要經(jīng)較長時(shí)間才能觀察到其作用效果，因此建立起LKB1的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，對進(jìn)行抗腫瘤的研究與應(yīng)用才具有臨床意義和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，旨在解決目前只有LKB1瞬時(shí)表達(dá)的研究，沒有有效的方法建立起LKB1的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體，所述抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體為pCMV-LKB1，基因序列為SEQ ID NO：NM_000455.4。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：

步驟一，通過提取293-T細(xì)胞的總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的片段和PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段獲取LKB1目的片段；

步驟二，pCMV-blank質(zhì)粒的擴(kuò)增和提??；

步驟三，克隆載體pMD18-LKB1；

步驟四，重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1。

進(jìn)一步，所述提取293-T細(xì)胞的總RNA的方法包括：

將培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞用PBS清洗；

按照每25cm²生長面積加入1ml的TRizol，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面；

用無RNA酶的槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞，使之裂解充分；

將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，室溫靜置5min，使RNA從核蛋白中分離出來；

向裂解液中加入1/5所用TRizol體積的氯仿，反復(fù)顛倒混勻，使溶液呈乳白色，室溫靜置5min；

12000r/min 4℃離心15min，將裂解液分為明顯的三層，吸取上層清液轉(zhuǎn)移至另外一只新的不含RNA酶的EP管中；

向新管中加入0.5倍TRizol體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻室溫靜置10分鐘；

12000r/min 4℃離心10分鐘后，試管底部會(huì)出現(xiàn)少許白色RNA沉淀；

棄去上清液，加入1ml75％的乙醇，使RNA漂浮起來，7500r/min離心5min，棄上清；

打開離心管蓋，室溫干燥沉淀幾分鐘，加入RNase-free水溶解RNA沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，所述PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段方法包括：

制膠，稱取瓊脂粉倒入錐形瓶中，按照0.5％w/v的比例加入1×TAE溶液；微波爐高火加熱溶解瓊脂粉，每次1min，重復(fù)3次，直至完全溶解；取出錐形瓶室溫冷卻至50℃左右，向瓊脂糖凝膠中滴入溴化乙錠溶液，終濃度為0.5ug/ml；將制膠梳子插于制膠模板中，使梳子底部與模板有2mm間隙，將溶解充分的膠緩慢均勻倒入模板中，室溫冷卻30min，使瓊脂糖凝膠冷卻成型，取下凝膠切割成適當(dāng)大小，保存于TAE溶液中；

電泳，制好的膠放入電泳槽中，將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按比例混和均勻后點(diǎn)入加樣孔，并將5ul DNA Marker加于膠最左邊的孔；設(shè)置電壓為120V，電泳20min；取出凝膠于紫外線投射儀下切取目的片段。

進(jìn)一步，所述膠回收目的片段方法包括：

將切取的含目的片段的凝膠放于一只潔凈EP管中，稱取凝膠質(zhì)量并換算成凝膠體積，100mg＝100ul，加入3倍于凝膠體積的Buffer DE-A溶液；

將含有凝膠的溶液放于75℃水浴鍋中加熱融化，加熱過程中每隔2-3min顛倒混勻EP管，使受熱均勻，加快溶解速度；

加入0.5Buffer DE-A體積的Buffer DE-B溶液，反復(fù)顛倒使二者充分混勻；

將混合液分批次加入制備管中，12000g離心1min，棄濾液；

將制備管放回離心管，加500ul Buffer W1，12000g離心30s，棄濾液；

將制備管放回離心管，加700ul Buffer W2，12000g離心30s，棄濾液。重復(fù)一次；

⑦將制備管放回離心管，12000g離心1min；

將制備管置于新的潔凈的EP管中，在膜上滴加20ul去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min洗脫DNA目的片段。

進(jìn)一步，所述pCMV-blank質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取具體包括：

擴(kuò)增質(zhì)粒：將凍存的含真核表達(dá)載體pCMV-blank的菌株由冰箱取出，室溫溶解；取200ul凍存菌液，加入Kana的LB溶液中；37℃振蕩培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)16h；

提取質(zhì)粒：向吸附柱CP4中加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱重新放回收集管中；取15ml培養(yǎng)16h的菌液進(jìn)行離心，12000rpm離心1min，棄上清并用槍頭小心吸干上清液，獲細(xì)菌沉淀；加500μl溶液P1至有菌體沉淀的離心管中，并將細(xì)菌沉淀用移液槍徹底懸??；加入500μl溶液P2至上述離心管中，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；加入700μl溶液P3至上述離心管中，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀；12000rpm離心10min，此時(shí)在離心管底部會(huì)形成沉淀；將收集的上清液分次加入吸附柱CP4中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱CP4放入收集管中；加入0.6ml漂洗液PW至吸附柱CP4中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱CP4放入收集管中；吸附柱CP4放入收集管中，再次12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，排除對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響；將吸附柱CP4放于一干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫液，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中；測定質(zhì)粒濃度后，將質(zhì)粒濃度標(biāo)記在EP管上，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，所述克隆載體pMD18-LKB1的方法包括：

(1)連接反應(yīng)，在微量離心管中配置下列連接反應(yīng)體系，用于T-Vector和目的片段的連接，反應(yīng)液配置好后，添加與總體積一樣的Solution I；16℃反應(yīng)3h后放入4℃冰箱過夜，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)；

(2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，取連接反應(yīng)液，輕柔緩慢地加入提前準(zhǔn)備好的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁使連接反應(yīng)液與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰上冷卻30min；將感受態(tài)細(xì)胞放入42℃恒溫水浴鍋，熱擊90s；將其插入冰中進(jìn)行冷卻，5min；向感受態(tài)細(xì)胞中加入900ul的新鮮LB溶液，蓋緊管蓋于37℃孵箱扶壯2h；取200ul扶壯后菌液涂布于含x-Gal、IPTG、AMP的LB瓊脂平板上，菌液晾干后于37℃倒置過夜；24小時(shí)，觀察菌落的長出情況，挑取理想菌落進(jìn)行鑒定；

(3)菌落鑒定，從平板上挑取幾株單個(gè)菌落，接種于LB溶液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，挑選出含有目的條帶的樣品；把含目的條帶的質(zhì)粒進(jìn)行序列測定并明確目的片段插入方向。

進(jìn)一步，所述重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1具體包括：

(1)根據(jù)真核表達(dá)載體pCMV-Blank和含目的片段的pMD18-T的酶切位點(diǎn)分布圖及LKB1基因三者所不包含的酶切位點(diǎn)的情況匯總，分別將真核表達(dá)載體pCMV-Blank和pMD18-T-LKB1行雙酶切反應(yīng)，選取酶切位點(diǎn)為Sal I和EcoR I

(2)將酶切得到的反應(yīng)液行瓊脂糖凝膠電泳，分離出目的條帶；在紫外線投射儀下切取目的片段，進(jìn)行膠回收，獲得目的片段；將雙酶切完成的pCMV-Blank和兩端帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的LKB1片段在T4連接酶作用下，16℃連接過夜，16h；轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)培養(yǎng)；挑取單個(gè)菌落在LB溶液中擴(kuò)增；PCR后將可擴(kuò)增出目的片段的質(zhì)粒進(jìn)行測序；將重組質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI公布的LKB1基因的核酸序列進(jìn)行比對，顯示目的片段與NCBI公布的完全一致，提示真核表達(dá)載體pCMV-LKB1構(gòu)建成功。

本發(fā)明提供的抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，構(gòu)建抑癌基因絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體pCMV-LKB1，其表達(dá)產(chǎn)物可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲；能穩(wěn)定表達(dá)抑癌基因LKB1產(chǎn)物，用于腫瘤的輔助治療。與兩對照組相比，PGCL3-LKB1組中LKB1表達(dá)顯著增加，空質(zhì)粒組與空白對照組相比，LKB1表達(dá)基本不變，提示LKB1在PGCL3細(xì)胞中成功高表達(dá)。如圖2。用Transwell小室檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示與對照組相比，PGCL3-LKB1組細(xì)胞遷移能力顯著下降；而空白對照組和陰性對照組細(xì)胞遷移力無變化，如圖3所示，提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的遷移力。轉(zhuǎn)染LKB1后用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-LKB1組細(xì)胞的侵襲能力顯著下降；而空白對照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲力無顯著性差異，如圖4所示，提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的侵襲力。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的LKB1在PGCL3細(xì)胞中成功高表達(dá)示意圖；

圖中：A為Western blotting檢測轉(zhuǎn)染的PGCL3細(xì)胞中LKB1蛋白的表達(dá)圖；B為統(tǒng)計(jì)分析后的柱狀圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的遷移力示意圖；

圖中；a為Transwell法檢測LKB1轉(zhuǎn)染PGCL3細(xì)胞后細(xì)胞的遷移圖；b為PGCL3細(xì)胞遷移數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的侵襲力示意圖；

圖中；a為Transwell法檢測LKB1轉(zhuǎn)染PGCL3細(xì)胞后細(xì)胞的侵襲圖；b為PGCL3細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析柱狀圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)的描述。

本發(fā)明實(shí)施例的抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體的基因序列為SEQ ID NO：1。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的抑癌絲氨酸－蘇氨酸激酶11真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法包括以下步驟：

S101：通過提取293-T細(xì)胞的總RNA、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的片段和PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段獲取LKB1目的片段；

S102：pCMV-blank質(zhì)粒的擴(kuò)增和提??；

S103：克隆載體pMD18-LKB1；

S104:重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

一、構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1

1.LKB1目的片段的獲得

(1)提取293-T細(xì)胞的總RNA

①將培養(yǎng)好的貼壁細(xì)胞用PBS清洗；

②按照每25cm²生長面積加入1ml的TRizol，輕輕晃動(dòng)，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面；

③用無RNA酶的槍頭反復(fù)吹打細(xì)胞，使之裂解充分；

④將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，室溫靜置5min，使RNA從核蛋白中分離出來；

⑤向上述裂解液中加入1/5所用TRizol體積的氯仿，反復(fù)顛倒混勻，使溶液呈乳白色，室溫靜置5min；

⑥12000r/min 4℃離心15min，將裂解液分為明顯的三層，小心吸取上層清液轉(zhuǎn)移至另外一只新的不含RNA酶的EP管中；

⑦向新管中加入0.5倍TRizol體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻室溫靜置10分鐘；

⑧12000r/min 4℃離心10分鐘后，試管底部會(huì)出現(xiàn)少許白色RNA沉淀；

⑨小心棄去上清液，加入1ml75％的乙醇，輕彈管壁使RNA漂浮起來，7500r/min離心5min，棄上清；

⑩打開離心管蓋，室溫干燥沉淀幾分鐘，加入適量的RNase-free水溶解RNA沉淀。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)反轉(zhuǎn)錄成cDNA

第一鏈cDNA合成反應(yīng)步驟

①按照下表配置反應(yīng)液

cDNA合成反應(yīng)體系

②65℃保溫5min后，冰上迅速冷卻。

③按下表配制20μl反應(yīng)液

cDNA合成反應(yīng)液的配置

④將上述20ul反應(yīng)液按照如下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

42℃ 60min

70℃ 15min

使酶滅火，冰上放置，之后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增目的片段

根據(jù)基因文庫中登錄號設(shè)計(jì)引物如下表，引物送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

引物

擴(kuò)增LKB1目的片段的PCR反應(yīng)體系及條件分別如下表

PCR擴(kuò)增LKB1長片段反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增LKB1長片段反應(yīng)條件

(4)PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段

1.制膠

①稱取一定質(zhì)量的瓊脂粉倒入錐形瓶中，按照0.5％(w/v)的比例加入1×TAE溶液；

②微波爐高火加熱溶解瓊脂粉，每次1min，重復(fù)3次，直至完全溶解；

③取出錐形瓶室溫冷卻至50℃左右，向瓊脂糖凝膠中滴入溴化乙錠溶液(使終濃度為0.5ug/ml)；

④將制膠梳子插于制膠模板中，使梳子底部與模板有2mm間隙，將溶解充分的膠緩慢均勻倒入模板中，室溫冷卻30min，使瓊脂糖凝膠冷卻成型，取下凝膠切割成適當(dāng)大小，保存于TAE溶液中。

2.電泳

①點(diǎn)樣：制好的膠放入電泳槽中，將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液按比例混和均勻后點(diǎn)入加樣孔，并將5ul DNA Marker加于膠最左邊的孔；

②電泳：設(shè)置電壓為120V，電泳20min；

③取出凝膠于紫外線投射儀下切取目的片段。

(5)膠回收目的片段

①將切取的含目的片段的凝膠放于一只潔凈EP管中，稱取凝膠質(zhì)量并換算成凝膠體積，100mg＝100ul，加入3倍于凝膠體積的Buffer DE-A溶液；

②將含有凝膠的溶液放于75℃水浴鍋中加熱融化，加熱過程中每隔2-3min顛倒混勻EP管，使受熱均勻，加快溶解速度；

③加入0.5Buffer DE-A體積的Buffer DE-B溶液，反復(fù)顛倒使二者充分混勻；

④將混合液分批次加入制備管中，12000g離心1min，棄濾液；

⑤將制備管放回離心管，加500ul Buffer W1，12000g離心30s，棄濾液；

⑥將制備管放回離心管，加700ul Buffer W2，12000g離心30s，棄濾液。重復(fù)一次；

⑦將制備管放回離心管，12000g離心1min；

⑧將制備管置于新的潔凈的EP管中，在膜上滴加20ul去離子水，室溫靜置1min，12000g離心1min洗脫DNA目的片段。

2.pCMV-blank質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取

擴(kuò)增質(zhì)粒：

①將凍存的含真核表達(dá)載體pCMV-blank的菌株由冰箱取出，室溫溶解；

②取200ul凍存菌液，加入Kana的LB溶液中；

③37℃振蕩培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)16h。

提取質(zhì)粒：使用天根的小提中量試劑盒

①柱平衡：向吸附柱CP4中加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱重新放回收集管中；

②取15ml培養(yǎng)16h的菌液進(jìn)行離心，12000rpm離心1min，棄上清并用槍頭小心吸干上清液，獲細(xì)菌沉淀；

③加500μl溶液P1至有菌體沉淀的離心管中，并將細(xì)菌沉淀用移液槍徹底懸??；

④加入500μl溶液P2至上述離心管中，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：此步一定要溫和而充分地混合溶液，且停留時(shí)間不能超過5min；

⑤加入700μl溶液P3至上述離心管中，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，此時(shí)在離心管底部會(huì)形成沉淀；

⑥將上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管)，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱CP4放入收集管中；

⑦加入0.6ml漂洗液PW至吸附柱CP4中，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱CP4放入收集管中；

⑧吸附柱CP4放入收集管中，再次12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，排除對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響；

⑨將吸附柱CP4放于一干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫液，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中；

⑩測定質(zhì)粒濃度后，將質(zhì)粒濃度標(biāo)記在EP管上，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.克隆載體pMD18-LKB1

(1)連接反應(yīng)

①在微量離心管中配置下列連接反應(yīng)體系，用于T-Vector和目的片段的連接，如下表。

載體與目的片段連接反應(yīng)體系

②上述反應(yīng)液配置好后，添加與上述總體積一樣的Solution I；

③16℃反應(yīng)3h后放入4℃冰箱過夜，次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

(2)轉(zhuǎn)化反應(yīng)

①取上述連接反應(yīng)液，輕柔緩慢地加入提前準(zhǔn)備好的感受態(tài)細(xì)胞(約100ul)中，輕彈管壁使連接反應(yīng)液與感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，冰上冷卻30min；

②熱擊：將感受態(tài)細(xì)胞放入42℃恒溫水浴鍋，熱擊90s；

③迅速將其插入冰中進(jìn)行冷卻，約5min左右；

④扶壯：向感受態(tài)細(xì)胞中加入900ul的新鮮LB溶液，蓋緊管蓋于37℃孵箱扶壯2h；

⑤涂板：取200ul扶壯后菌液涂布于含x-Gal、IPTG、AMP的LB瓊脂平板上，菌液晾干后于37℃倒置過夜；

⑥約24小時(shí)，觀察菌落的長出情況，挑取理想菌落進(jìn)行鑒定。

(3)菌落鑒定

①從上述平板上挑取幾株單個(gè)菌落，接種于LB(AMP⁺)溶液中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；

②提取質(zhì)粒(詳細(xì)方法見上)，以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR；

③質(zhì)粒PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件分別如下表。

質(zhì)粒PCR反應(yīng)體系

質(zhì)粒PCR反應(yīng)條件

④電泳：將以上幾管PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，挑選出含有目的條帶的樣品。

⑤送樣檢測：把含目的條帶的質(zhì)粒送北京金維智科學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定并明確目的片段插入方向。

4.重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1

雙酶切反應(yīng)：

根據(jù)真核表達(dá)載體pCMV-Blank和含目的片段的pMD18-T的酶切位點(diǎn)分布圖及LKB1基因三者所不包含的酶切位點(diǎn)的情況匯總，分別將真核表達(dá)載體pCMV-Blank和pMD18-T-LKB1行雙酶切反應(yīng)，選取酶切位點(diǎn)為Sal I和EcoR I，酶切反應(yīng)體系如下表。

重組質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系及條件

(5)電泳、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化和菌株鑒定

①電泳：將以上酶切得到的反應(yīng)液行瓊脂糖凝膠電泳，分離出目的條帶。

②膠回收：在紫外線投射儀下切取目的片段，進(jìn)行膠回收，獲得目的片段。

③連接：將雙酶切完成的pCMV-Blank和兩端帶相應(yīng)酶切位點(diǎn)的LKB1片段在T4連接酶作用下，16℃連接過夜，16h。

④轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)培養(yǎng)。

⑤挑取單個(gè)菌落在LB溶液中擴(kuò)增。

⑥PCR后將可擴(kuò)增出目的片段的質(zhì)粒送往北京金維智公司進(jìn)行測序。

⑦將重組質(zhì)粒測序結(jié)果與NCBI公布的LKB1基因的核酸序列進(jìn)行比對，顯示目的片段與NCBI公布的完全一致，提示真核表達(dá)載體pCMV-LKB1構(gòu)建成功。

下面結(jié)合重組真核表達(dá)載體pCMV-LKB1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及對腫瘤細(xì)胞的作用對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細(xì)的描述。

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)LKB1細(xì)胞株的篩選

用含10％胎牛血清的RPMI/1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PGCL3細(xì)胞于37℃、含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，每2-3天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長至90％匯合度時(shí)用0.25％胰酶消化，傳代至新培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期且匯合度達(dá)80％時(shí)，將真核表達(dá)載體pCMV-LKB1與轉(zhuǎn)染試劑Lipofect2000以2:1比例混合轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h將細(xì)胞消化平鋪至六孔板行G418壓力篩選，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)LKB1的細(xì)胞株，擴(kuò)增培養(yǎng)后做細(xì)胞遷移、侵襲以及提取細(xì)胞總蛋白等實(shí)驗(yàn)。

2.免疫印跡法(Western Blotting，WB)檢測細(xì)胞中各蛋白表達(dá)水平

A.免疫印跡細(xì)胞樣品制備

①待處理的25cm²培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，棄去生長培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，放于冰上。

②按0.75ml/瓶RIPA加入細(xì)胞裂解液，裂解液使用前按10ul/ml的比例加入PMSF，用槍反復(fù)吹打細(xì)胞后收集到1.5mlEP管中，放于冰上繼續(xù)裂解30min，在此期間，補(bǔ)加一次PMSF。

③14000r/min離心5min后收集上清，將上清煮沸5min。

④測定蛋白濃度后，按比例加入4×SDS上樣緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

B.免疫印跡步驟

配膠

按照下表配方配置分離膠和濃縮膠，濃度分別為12％和3.9％。

①加6.5ml配置好的分離膠至膠槽；

②加滿異丙醇使分離膠與空氣隔絕，并使膠平面壓平；

③室溫25min左右，膠完全凝固后傾去異丙醇，用雙蒸水沖洗膠槽濾紙吸干水分；

④加入2.5ml濃縮膠灌滿膠槽，插入1.5mm厚的梳子，待膠完全凝固后拔去；

⑤加滿電泳緩沖液，并反復(fù)沖洗泳道；

12％的聚丙烯酰胺分離膠和3.9％的聚丙烯酰胺濃縮膠配方

根據(jù)每種蛋白在細(xì)胞中含量的不同，加入不同量蛋白樣品，并加5ul的蛋白預(yù)染Marker，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

電泳濃縮膠膠段，電壓40V、50min，進(jìn)行蛋白樣品的濃縮，使溴芬藍(lán)指示劑電泳到濃縮膠與分離膠的交界處，改為恒壓80V進(jìn)行電泳，開始分離蛋白樣品，直到溴芬藍(lán)電泳至凝膠底部。

轉(zhuǎn)膜將分離膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上：從膠槽中卸下凝膠，切去濃縮膠后將SDS-PAGE凝膠與PVDF膜貼一起，順序分別為負(fù)極(黑色)→海綿→濾紙→凝膠→PVDF膜→濾紙→凝膠→海綿→正極(紅色)，PVDF膜在使用前需要用甲醇活化5-10min。恒流220mA，轉(zhuǎn)膜1h 45min。

封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，放于用5％TBST配置的脫脂奶粉中室溫封閉1h。

孵育一抗封閉結(jié)束后，取出PVDF膜，加入適量比例稀釋的一抗(羊抗兔)，于4℃過夜。

洗膜取出PVDF膜，用TBST洗膜3次、每次15min。

孵育二抗加入適量已經(jīng)稀釋的二抗(山羊抗兔)(稀釋比例為1:5000)，室溫孵育2h。

洗膜取出PVDF膜，用TBST洗膜3次、每次15min。

曝光、顯影取出PVDF膜放于保鮮膜上，滴加發(fā)光液，觀察是否有熒光出現(xiàn)，并及時(shí)對膠片進(jìn)行曝光。取出曝光完成的膠片，先后放于顯定影液中進(jìn)行顯影和定影并用清水沖洗顯定影完成的膠片。

C.LKB1蛋白表達(dá)結(jié)果：

與兩對照組相比，PGCL3-LKB1組中LKB1表達(dá)顯著增加，空質(zhì)粒組與空白對照組相比，LKB1表達(dá)基本不變，提示LKB1在PGCL3細(xì)胞中成功高表達(dá)。如圖2。

3.Transwell小室法檢測細(xì)胞的遷移侵襲能力

1.對細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理

實(shí)驗(yàn)前12h，饑餓處理細(xì)胞，更換成無血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)開始。使細(xì)胞具備感知營養(yǎng)的能力，更有動(dòng)力穿過Transwell小室膜。饑餓處理后的細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，制成相同濃度的細(xì)胞懸液備用。

2.Martigen基質(zhì)膠的準(zhǔn)備及侵襲實(shí)驗(yàn)鋪膠

①取出凍存于-20℃的Martigen人工基質(zhì)膠，放于4℃冰箱充分凍融。

②將需使用的槍頭、Transwell小室、1.5mlEP管提前放于-20℃冰箱預(yù)冷。

③將Martigen人工基質(zhì)膠和RPMI/1640溶液按照1:8的比例進(jìn)行混合，此操作步驟在冰上進(jìn)行。

④按照100ul/孔混合液垂直滴加到Transwell小室上室，放于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱、1h，使膠凝固。

⑤取出Transwell小室，吸取上層培養(yǎng)液，放于24孔板中備用。

3.LKB1對PGCL3遷移的影響

用Transwell小室檢測各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力，結(jié)果顯示與對照組相比，PGCL3-LKB1組細(xì)胞遷移能力顯著下降；而空白對照組和陰性對照組細(xì)胞遷移力無變化，如圖3所示，提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的遷移力。

4.LKB1對PGCL3侵襲的影響

轉(zhuǎn)染LKB1后用Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示與對照組相比，轉(zhuǎn)染pCMV-LKB1組細(xì)胞的侵襲能力顯著下降；而空白對照組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組細(xì)胞侵襲力無顯著性差異，如圖4所示，提示LKB1可顯著抑制PGCL3細(xì)胞的侵襲力。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。