本發(fā)明涉及快速方便的檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針及方法。

背景技術：

人體內大多數(shù)天然蛋白質通常會進行正常折疊以發(fā)揮其正常生理功能。某些蛋白在一定的病理條件下會變性發(fā)生錯誤折疊，在體內以交叉的β片層高度有序的聚集形成不溶性蛋白纖維，最終在組織和器官內形成不溶性淀粉沉積，這種蛋白叫做淀粉樣蛋白，這一過程叫做淀粉樣變性。淀粉樣的形成過程產生的細胞毒性正是一些淀粉樣疾病發(fā)病的主要機制之一，如阿爾茲海默癥中的β-淀粉樣蛋白、帕金森癥中的α-突觸核蛋白、2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽和腎功能衰竭中的溶菌酶等^[1][2]。由于淀粉樣變性以及其過程中產生的細胞毒性與很多疾病相關，淀粉樣蛋白逐漸成為研究熱點之一，包括其聚集過程與機制、細胞毒性機制、聚集抑制劑的開發(fā)和聚集影響因素的研究，在生物納米技術中的應用潛力^[3]。

據報道，淀粉樣蛋白聚集過程一般會形成6-12nm寬而且很長的無支鏈的纖維，不同蛋白質形成的纖維狀聚集體都具有非常相似的結構，即最終形態(tài)都為富含大量“cross-β-sheet”結構的成熟纖維^[3]。β-sheet是折疊蛋白中普遍存在和重復出現(xiàn)的二級結構，主要是序列中的肽鍵通過氫鍵作用連接成多肽鏈后，打褶交叉折疊而成的^[4]。β-sheet結構可以由相同蛋白的不同區(qū)域形成，也可以來自于不同的蛋白，在蛋白形成多聚體或纖維后趨于穩(wěn)定^[5]。淀粉樣蛋白在聚集過程中發(fā)生這些形態(tài)變化的同時，也伴隨著構象變化，在大多數(shù)淀粉樣蛋白中，多聚體形態(tài)中的α螺旋結構與單體相比所占比例呈上升趨勢，而在淀粉樣蛋白形成的最終產物，成熟纖維中則以“cross-β-sheet”結構為主。

雖然淀粉樣蛋白錯誤折疊的確切機制尚不清楚，但根據文獻報道淀粉樣蛋白的聚集模式通常分為兩種，具有以下兩種途徑中的一種或兩種共存，在第一種模式下，淀粉樣蛋白單體先形成多聚物中間體，多聚物中間體進一步和單體結合形成最終的成熟纖維；第二種是淀粉樣蛋白單體一開始也是先形成多聚物中間體，但接著多聚物中間體相互識別在體內組裝成纖維前體，最終轉化為成熟纖維^[6]。在淀粉樣纖維形成的過程中，多聚物中間體是瞬時形成的，也是形成系統(tǒng)性淀粉樣變性和產生細胞毒性的關鍵所在^[7]。

研究報道，淀粉樣蛋白的自我組裝是通過蛋白之間的相互作用完成的。而這種相互作用方式主要分為兩種模式。第一種模式是π-π之間的相互作用，淀粉樣蛋白序列片段中的芳香族氨基酸殘基通過π-π共軛作用相互識別，互相結合聚集形成成熟纖維^[8]。研究發(fā)現(xiàn)，位于疏水核心中芳香族殘基之間的π-π共軛相互作用能夠穩(wěn)定蛋白的三維結構^[9]，這種芳香殘基的π-π共軛相互作用也是促進多肽組裝成淀粉樣蛋白結構的關鍵功能，也被作為研究各種芳香族化合物抑制淀粉樣蛋白聚集的基礎^[10]。另一種模式是淀粉樣蛋白疏水氨基酸表面的相互作用^[11]。淀粉樣蛋白形成的中間體在水溶液環(huán)境中是不穩(wěn)定的，這是由于暴露的疏水性區(qū)域相互作用進一步增長成含β-sheet結構的多聚體，最后形成纖維^[12]。

而在蛋白質分子中，能發(fā)射熒光的氨基酸殘基有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)。個別蛋白質分子含有黃素腺嗓吟二核苷酸,也能發(fā)射熒光。大多數(shù)氨基酸在紫外線照射下雖不發(fā)生熒光,但可以將它們與特定試劑反應后,生成的產物會發(fā)射熒光^[13]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的最大發(fā)射波長分別是348、303以及282nm。苯丙氨酸的熒光強度很小,且其激發(fā)波長小于280nm，這使苯丙氨酸在很多實驗條件下不能被激發(fā)。因此，蛋白質的內源性熒光主要來自色氨酸和酪氨酸殘基。

酪氨酸的酚輕基具有中度疏水；而色氨酸則重度疏水。一旦蛋白質分子的構象發(fā)生轉變，酪氨酸和色氨酸所處的微環(huán)境也會隨之發(fā)生變化，從而可能引起各熒光參數(shù)的改變。分別用酪氨酸和色氨酸作為親水探針和疏水探針進行熒光測定，通過對熒光強度和最大發(fā)射波長變化的分析，可推測熒光探針所處微環(huán)境發(fā)生的變化，并進一步研究蛋白質二級結構的轉變^[14]。許多的多肽和蛋白質如糊精和阿爾茲海默癥中的β蛋白都是由疏水締合作用形成的^[15]。在疏水殘基，芳香族殘基是最傾向于形成淀粉樣沉淀的^[8]。這說明在淀粉樣核心中的芳香族殘基會產生巨大的結構變化，從而反映出殘基周圍的微環(huán)境變化^[16～18]。

目前，最常用于檢測和描述淀粉樣形成的方法主要包括淀粉樣蛋白色素染色、共軛發(fā)光電解質探針(LCPS)、X射線衍射法、動靜態(tài)光散射法、圓二色譜法(CD)以及紅外光譜、核磁共振等光譜技術^[19]。此外，一些其他方法如原子力顯微技術(AFM)和電子顯微鏡(EM)也經常被用于檢測多肽的聚合^[20][21]。

迄今為止，特定的染色方法，硫磺素T和剛果紅染色是兩種臨床上最常用的熒光染色方法，方法中熒光的強度的變化只能體現(xiàn)多肽的聚集程度。然而，方法的靈敏度以及溶劑化效應對檢測動態(tài)的淀粉樣多肽的形成存在局限性，特別是在對疾病的診療起著至關重要作用的淀粉樣形成的早期^[22]。雖然理論和計算研究能對淀粉樣形成的區(qū)域進行預測，但是使用傳統(tǒng)的實驗工具難以獲得這些數(shù)據^[23][24]。

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技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述存在的問題，本發(fā)明提供了一種更為靈敏簡便的能動態(tài)檢測淀粉樣形成的熒光探針及方法。

本發(fā)明的目的在于提供一種快速方便地檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針及方法。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針，所述探針為含有色氨酸殘基的多肽，所述多肽由3～15個氨基酸殘基組成。

進一步的，所述探針的多肽序列選自SEQ ID NO：1～53中的至少一種；

進一步的，所述探針的多肽序列選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：41中的至少一種。

一種檢測淀粉樣蛋白形成的方法，將待測蛋白溶液中加入上述所述的熒光探針，振蕩，測定溶液在不同振蕩時間點的熒光強度，根據熒光強度的變化即可判斷待測蛋白形成淀粉樣的情況。

進一步的，所述待測蛋白溶液為未形成淀粉樣的蛋白溶液。

進一步的，上述測定熒光強度時的激發(fā)波長為320nm，發(fā)射波上為340～620nm。

進一步的，所述探針和蛋白的質量比為1：(2.5～3.5)。

上述所述熒光探針在研究淀粉樣蛋白形成機制中的應用。

上述熒光探針用于研究蛋白形成淀粉樣過程中的結構變化。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明利用色氨酸等能體現(xiàn)蛋白質周圍微環(huán)境變化的內在性質用作熒光探針指示淀粉樣蛋白聚集過程，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了能夠快速方便地檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針及方法，其不僅能用于監(jiān)測淀粉樣的早期形成，還能用于檢測多肽的共聚?？紤]到多肽或者蛋白質的聚集在某些神經退行性疾病中的關鍵作用，本發(fā)明將提供一種有效的能檢測早期淀粉樣形成的方法。

附圖說明

圖1為EP2在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜，即EP2在280nm、320nm、350nm激發(fā)波長下的分別在290nm-500nm、340nm-620nm和370nm-680nm范圍內的發(fā)射波長的熒光光譜；

圖2為不同樣品在不同時間點的熒光發(fā)射光譜，A為EP2溶液，B為SEVI溶液，C為EP2和SEVI的混合溶液，D為溶菌酶溶液，E為EP2和溶菌酶的混合溶液，F(xiàn)為牛血清白蛋白(BSA)溶液，G為EP2和BSA的混合溶液；

圖3為SEVI與溶菌酶對HIV-1病毒感染的影響。SEVI溶解在PBS中振搖48h，溶菌酶溶解在溶液A(2M NaCl,pH＝6.0)中振搖48h。SEVI和溶菌酶溶液樣品與HIV X4-tropicNL4-3病毒混合，再加入TZM-b1細胞中，37℃共孵3h，移去未吸附的病毒，48h后用熒光素酶檢測病毒感染結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1：快速方便地檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針

本發(fā)明通過前期大量的實驗篩選和驗證，發(fā)現(xiàn)EP2多肽的熒光特征可以開發(fā)成一種靈敏的能動態(tài)檢測淀粉樣形成的熒光探針。EP2多肽是HIV病毒包膜蛋白中的一個環(huán)節(jié)gp120中的一段含有15個氨基酸的多肽：QCKIKQIINMWQEVG(SEQ ID NO：1)，含有色氨酸的EP2多肽在320～360nm發(fā)射波長處能發(fā)出強烈的熒光。

基于上述發(fā)現(xiàn)，申請人做了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)含有色氨酸殘基的3肽～15肽都可作為檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針。尤其是SEQ ID NO：1～53所示的多肽。

實施例2：快速方便地檢測淀粉樣蛋白形成的方法

本發(fā)明偶然發(fā)現(xiàn)EP2多肽溶液加入淀粉樣蛋白形成溶液中后，EP2熒光強度隨著時間的延長不斷增強，推測EP2多肽能隨蛋白的淀粉樣化形成淀粉樣聚集。為了驗證這一推測，本發(fā)明使用EP2溶液分別與能形成淀粉樣聚集的蛋白SEVI、淀粉狀蛋白溶菌酶、不形成淀粉樣聚集的牛血清蛋白BSA混合，并測定其在不同時間點下的熒光強度。

樣品熒光光譜的測定：用超純水配制EP2溶液(1.5mg/mL)、SEVI溶液(4.5mg/mL)、BSA溶液(4.5mg/mL)、溶菌酶溶液(4.5mg/mL)、含EP2(1.5mg/mL)與SEVI(4.5mg/mL)的混合溶液、含EP2(1.5mg/mL)與雞卵清溶菌酶(4.5mg/mL)的混合溶液、含EP2(1.5mg/mL)與BSA(4.5mg/mL)的混合溶液。振蕩儀Eppendorf Mixmate混勻將所有樣品溶液在37℃、1200rpm下振搖24h。分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h取上述樣品適量，RF-5301型熒光分光光度計測定熒光光譜。

一、激發(fā)波長的選擇

為了檢測多肽探針是否能快速方便的檢測淀粉樣形成，首先確定EP2多肽在聚集狀態(tài)下的熒光光譜特征。EP2是含有15個氨基酸的多肽序列QCKIKQIINMWQEVG。來自于HIV病毒包膜蛋白gp120(aa 417-431)的一段多肽。在Tan等人的研究工作中發(fā)現(xiàn)，EP2是能夠形成淀粉樣的一段多肽，而且具有增強病毒感染的生理活性(Tan S,Li L,Lu L,Pan C,Lu H,Oksov Y,et al.Peptides derived from HIV-1 gp120 co-receptor binding domain form amyloid fibrils and enhance HIV-1 infection.FEBS letters.2014；588(9):1515-22)。EP2序列的第11位含有色氨酸，而色氨酸熒光光譜是可用于檢測周圍微環(huán)境變化的。因此我們用280nm激發(fā)波長掃描EP2多肽，觀察其在290nm～500nm范圍的發(fā)射熒光光譜。另外，為了確定EP2最敏感的發(fā)射波長，實驗以最大發(fā)射波長確定EP2在280nm到320nm范圍內的最大激發(fā)波長。

方法：吸取1.5mg/mL EP2溶液適量，分別在280、320以及350nm激發(fā)波長下，測定其在290-680nm發(fā)射波長下的熒光強度，狹縫帶寬為3nm,5nm(掃描熒光光譜參數(shù))，作圖并選擇最佳激發(fā)波長。

實驗結果如圖1和表1所示，從中可以看出，EP2在280nm、320nm、350nm激發(fā)波長下的分別在290nm-500nm、340nm-620nm和370nm-680nm范圍內有明顯的熒光光譜，其中最強熒光對應的發(fā)射波長為377nm、激發(fā)波長為320nm，說明EP2的最優(yōu)激發(fā)波長為320nm，而在350nm激發(fā)波長下EP2發(fā)射的熒光強度非常弱。實驗結果與Smith等人的實驗結果一致，Smith等人發(fā)現(xiàn)用色氨酸光譜可用于進行白內障早期診斷，通過色氨酸在317nm處的發(fā)射波長通過了房水和角膜而被檢測到眼球內蛋白的變化(Gakamsky DM,Dhillon B,Babraj J,Shelton M,Smith SD.Exploring the possibility of early cataract diagnostics based on tryptophan fluorescence.J R Soc Interface.2011；8:1616-1621)。

表1確定EP2的最優(yōu)激發(fā)波長

注：λex和λem分別為激發(fā)波長和發(fā)射波長；I為EP2的發(fā)射波長強度；a.u.為arbitrary units。

二、淀粉樣蛋白對EP2熒光強度的影響

方法：

1)EP2樣品溶液的測定

取1.5mg/mL的EP2溶液，將其至于混勻振蕩儀上。分別取振搖0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后的樣品溶液，在320nm激發(fā)波長下，測定其在290-680nm下的熒光強度，狹縫帶寬為3nm,5nm。

SEVI、溶菌酶、BSA用去離子水溶解到4.5mg/mL(其中溶菌酶溶液中還含有2M NaCl,pH＝6.0)，處理方法與EP2相似，在不同時間點，取出樣品用Shimadzu RF-5301(Japan)熒光可見分光光度儀檢測熒光光譜。

2)EP2與SEVI的混合溶液的測定

取含EP2(1.5mg/mL)與SEVI(4.5mg/mL)的混合溶液，所有樣品在37℃條件下1200rpm振搖，分別取振搖0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后的樣品溶液，使用熒光分光光度計，在320nm激發(fā)波長下，測定其在340～620nm下的熒光強度，狹縫帶寬為3nm，5nm。

3)EP2與溶菌酶的混合溶液的測定

取含EP2(1.5mg/mL)與雞卵清溶菌酶(4.5mg/mL)的混合溶液，所有樣品在37℃條件下1200rpm振搖，分別取振搖0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后的樣品溶液，使用熒光分光光度計，在320nm激發(fā)波長下，測定其在340～620nm下的熒光強度，狹縫帶寬為3nm，5nm。

4)EP2與牛血清蛋白的混合溶液的測定

取含EP2(1.5mg/mL)與BSA(4.5mg/mL)的混合溶液，所有樣品在37℃條件下1200rpm振搖，分別取振搖0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后的樣品溶液，使用熒光分光光度計中，在320nm激發(fā)波長下，測定其在340～620nm下的熒光強度，狹縫帶寬為3nm，5nm。

結果：

1)EP2溶液在聚集過程中的熒光光譜

EP2溶液在激發(fā)波長為320nm處檢測340～620nm范圍內每2h EP2發(fā)射熒光光譜的變化(見圖2A)。實驗結果表明，在24h后EP2的發(fā)射光譜熒光強度達到最大值，而與0h相比熒光強度增強3倍。EP2的熒光發(fā)射光譜的變化現(xiàn)象可以用于后續(xù)的檢測實驗。

2)SEVI(圖2B)、溶菌酶(圖2D)、BSA(圖2F)在激發(fā)波長為320nm處檢測340nm-620nm范圍發(fā)射熒光光譜，結果顯示這3種蛋白在激發(fā)波長為320nm時幾乎都不能發(fā)出明顯的熒光。

3)EP2與SEVI蛋白混合時，熒光強度不僅隨著時間延長而增強，而且溶液的熒光強度與單一的EP2溶液相比有成倍的增強(圖2C)。而EP2與溶菌酶混合時，熒光強度雖然隨著時間延長而增強，但與單一的EP2溶液相比，溶液的熒光強度無明顯變化，合仍能檢測到強烈的熒光(圖2E)。最后，EP2與BSA混合時，熒光強度隨著時間延長有小幅度增強，但溶液的熒光強度與單一的EP2溶液相比明顯下降，幾乎檢測不到明顯的熒光(圖2G)。

綜上所述，EP2單獨振動時具能夠產生越來越強烈的熒光，可能因為EP2單獨振動時也能形成淀粉樣的聚集，從而發(fā)出的熒光越來越強；而當EP2與不能形成淀粉樣的蛋白(如BSA)混合后，其熒光強度非常弱，最大熒光強度也只有80左右，說明與EP2與不能形成淀粉樣的蛋白發(fā)生作用，且EP2自身也不能形成淀粉樣蛋白；當EP2與能形成淀粉樣的蛋白混合后，卻可以檢測到越來越強的熒光，如EP2和SEVI混合振動24h后，熒光強度可達700左右；EP2和溶菌酶混合振動24h后，熒光強度可達400左右；此時EP2自身也沒有形成淀粉樣，而是在混合溶液中EP2與能形成淀粉樣的蛋白發(fā)生了相互作用，從而引起了熒光光譜的改變。

上述結果說明含色氨酸EP2序列QCKIKQIINMWQEVG(SEQ ID NO：1)是一種可作為檢測淀粉樣多肽形成的一種熒光探針。

為了進一步研究，其他含色氨酸的多肽序列是否也具有上述具類似的檢測效果，在生物公司人工合成了別外52種含色氨酸的多肽，如SEQ IDNO：2～53所示，這些多肽有長度在3～15個氨基酸之間。對這些多肽也進行上述與EP2相同的實驗，且實驗結果與EP2的相似，故不再在此一一贅述。上述這些實驗結果進一步說明含色氨酸的短肽可作為淀粉樣蛋白形成的熒光探針。

三、SEVI與溶菌酶對HIV-1病毒感染的影響

SEVI、溶菌酶加入EP2后的熒光光譜中熒光強度的不同(見圖2)，可能與兩者不同多肽聚集程度有關。為了進一步證明這一推論，設計HIV-1病毒感染實驗，分別測定淀粉樣SEVI和溶菌酶溶液對HIV-1病毒感染的影響。

方法：將SEVI溶解于PBS中振搖48小時后用于HIV(HIV-1 X4-tropic NL4-3病毒)感染實驗；溶菌酶溶解于溶液A(2M NaCl,pH＝6.0)振搖48h。用溶解于蒸餾水未振搖的溶菌酶做為陰性對照組。HIV-1病毒分別與30μg/mL,15μg/mL和7.5μg/mL的SEVI、溶菌酶樣品混合，37℃孵育10min。取100μL病毒混合樣品加入1×10⁴TZM-b1細胞中，共孵3h后洗去未吸附的病毒顆粒加入DMEM(含10％FBS)。熒光素酶試劑盒檢測病毒感染3天后細胞的病毒滴度(Tan S,Lu L,Li L,Liu J,Oksov Y,Lu H,et al.Polyanionic candidate microbicides accelerate the formation of semen-derived amyloid fibrils to enhance HIV-1 infection.PloS one.2013；8(3):e59777)。

實驗結果如圖3所示，從中可以看出與陰性對照組(即未振搖的溶菌酶的實驗，因為該樣品在蒸餾水溶解的條件下未形成淀粉樣而對病毒的感染無影響，未展示數(shù)據)相比，能形成淀粉樣的SEVI和溶菌酶均能增強病毒感染，SEVI增強的倍數(shù)比溶菌酶高(見圖3)，可能因為SEVI的淀粉樣自聚集程度比溶菌酶強。EP2，SEVI和溶菌酶的纖維沉淀均能增強HIV-1病毒的感染，這與可能與它們自身形成β-sheet二級結構的能力有關。據Nilsson等人的報道，簡單的自我聚集的多肽具有高度的β-sheet結構，這與增強病毒感染有關(Easterhoff D,DiMaio JT,Doran TM,Dewhurst S,Nilsson BL.Enhancement of HIV-1 infectivity by simple,self-assembling modular peptides.Biophysical journal.2011；100(5):1325-34)。SEVI與溶菌酶因自身的聚集程度不同而產生不同的增強病毒感染的能力，這一實驗現(xiàn)象可用EP2作為熒光探針觀察熒光光譜的變化進行檢測。

上述增強HIV感染的實驗結果與前文“二”中熒光光譜實驗結果一致，即，EP2檢測SEVI的熒光強度比溶菌酶的強，SEVI增強HIV感染的能力也比溶菌酶的強。這此結果進一步說明了含色氨酸的短肽(如EP2多肽)可作為檢測淀粉樣多肽形成的一種熒光探針。

實施例3：一種檢測淀粉樣蛋白形成的方法，

將未形成淀粉樣的待測蛋白溶液中加入含色氨酸的短肽作為熒光探針，振蕩處理，測定溶液在不同振蕩時間點的熒光強度，根據熒光強度的變化即可判斷待測蛋白形成淀粉樣的情況。

上述測定熒光強度時的激發(fā)波長為320nm，發(fā)射波上為340～620nm。

所述探針和蛋白的質量比為1：(2.5～3.5)。

上述含色氨酸的短肽可以選自SEQ ID NO：1～53中所述的多肽。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

<110> 南方醫(yī)科大學

<120> 快速方便地檢測淀粉樣蛋白形成的熒光探針及方法

<130>

<160> 53

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Asn Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Trp Gln Glu Val Gly

1 5

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Trp Gln Glu Val Gly

1 5

<210> 12

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5 10

<210> 13

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5 10

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Ile Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Asn Met Trp Gln Glu Val

1 5

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Met Trp Gln Glu Val

1 5

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 22

Trp Gln Glu Val

1

<210> 23

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 23

Gln Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5 10

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 24

Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5 10

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 25

Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 26

Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5 10

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 27

Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 28

Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 29

Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5

<210> 30

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 30

Ile Asn Met Trp Gln Glu

1 5

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 31

Asn Met Trp Gln Glu

1 5

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 32

Met Trp Gln Glu

1

<210> 33

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 33

Trp Gln Glu

1

<210> 34

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 34

Gln Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 35

Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5 10

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 36

Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5 10

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 37

Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 38

Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 39

Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Ile Ile Asn Met Trp Gln

1 5

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 41

Ile Asn Met Trp Gln

1 5

<210> 42

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 42

Asn Met Trp Gln

1

<210> 43

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 43

Met Trp Gln

1

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 44

Gln Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5 10

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 45

Cys Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5 10

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 46

Lys Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 47

Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 48

Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 49

Gln Ile Ile Asn Met Trp

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 50

Ile Ile Asn Met Trp

1 5

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 51

Ile Asn Met Trp

1

<210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 52

Asn Met Trp

1

<210> 53

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 53

Ile Asn Met Trp Gln Gly

1 5