專利名稱：：用于檢測血清淀粉狀蛋白a1(saa1)的基因型的核苷酸引物組和核苷酸探針的制作方法用于檢測血清淀粉狀蛋白A1(SAA1)的基因型的核苷酸引物組和核苷酸探針發(fā)明背景本發(fā)明涉及用于檢測血清淀粉狀蛋白A1(SAA1)基因中單核苷酸多態(tài)性的基因型的核苷酸引物組和檢測探針。淀粉狀蛋白病是涉及引起各個器官功能障礙的稱作淀粉狀蛋白的纖維狀異常蛋白在體內累積的疾病。這是一種高死亡率疾病，對其沒有已建立的基本療法。近來的研究表明有可能通過檢查血清淀粉狀蛋白A1(SAA1)基因上游區(qū)中C-13T的多態(tài)性以及外顯子3區(qū)中C2995T和T3010C的多態(tài)性而預測發(fā)生淀粉狀蛋白病的傾向。還有可能通過確定SAA1基因的基因型而實施對相應患者制定的藥物施用及治療。文獻"JainK.K,，AmplicipCYP450的應用，MolDiagn.9，119-27(2005)")。然而，PCR方法具有缺點，如包括核苷酸提取在內的復雜的預處理操作、需要復雜的溫度調節(jié)裝置如熱循環(huán)儀以及2小時或更多小時的較長反應時間。PCR方法的擴增產(chǎn)物是雙鏈，并且因此存在當互補鏈在檢測期間作為探針的竟爭物發(fā)揮作用時，互補鏈降低檢測敏感性的問題。已經(jīng)研究了將擴增產(chǎn)物轉化成單鏈的多種方法，例如通過使用酶或磁珠使互補鏈分解或分離，但這些方法也有操作復雜和昂貴的問題。發(fā)明簡述根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了用于LAMP擴增的核苷酸引物組，其用于檢測SAA1基因的單核苷酸多態(tài)性C-13T的基因型，其中當耙核苷F2區(qū)和F1區(qū)并且從3，端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時，并且當存在這樣的核苷酸引物時，其中所述的核苷酸引物包括具有在3，端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5，端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3'端側與B2c區(qū)互補的序列和在5，端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物，其中該引物組包含選自表2中所示引物組1-7中的FIP引物和BIP引物；與自革巴核苷酸的F2區(qū)5，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的F3引物；和與自耙核苷酸的B2c區(qū)3，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的B3引物。表2中所示的引物組l-7是下列引物組:引物組l:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.2的BIP引物，引物組2:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.3的BIP引物，引物組3:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.5的BIP引物，引物組4:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.6的BIP引物,引物組5:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.7的BIP引物，引物組6:SEQIDNo.l的FIP引物和SEQIDNo.10的BIP引物，和引物組7:SEQIDNo.13的FIP引物和SEQIDNo.3的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了用于LAMP擴增的核苷酸引物組，用于檢測SAA1基因的單核苷酸多態(tài)性C2995T和/或T3010C的基因型，其中該引物組包含選自表3中所示引物組l-4中的FIP引物和BIP引物；與自耙核苷酸的F2區(qū)5，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的F3引物；和與自耙核苷酸的B2c區(qū)3，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的B3引物。表3中所示的引物組l-4如下引物組1:SEQIDNo.19的FIP引物和SEQIDNo.20的BIP引物，引物組2:SEQIDNo.21的FIP引物和SEQIDNo.20的BIP引物，引物組3:SEQIDNo,22的FIP引物和SEQIDNo.20的BIP引物，和引物組4:SEQIDNo.23的FIP引物和SEQIDNo.20的BIP引物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T或T3010C的基因型的方法，包括步驟通過4吏用核苷酸引物組擴增靶核苷酸而得到擴增產(chǎn)物；并且測定和比較在擴增產(chǎn)物中含有的野生型擴增產(chǎn)物及變異型擴增產(chǎn)物的量。本發(fā)明的另一個方面提供了用于檢測由使用核苷酸引物組擴增靶核苷酸得到的擴增產(chǎn)物的核苷酸探針，其包含選自野生型核苷酸探針和變異型核苷酸探針的核苷酸探針。在一個方面，野生型核苷酸探針是與野生型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值63-77°C;變異型核苷酸探針是與變異型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值63-74°C;并且單核苷酸多態(tài)性C-13T位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。在另一個方面，野生型核苷酸探針具有Tm值63-74°C;變異型核苷酸探4f具有Tm值61-74°C;并且單核苷酸多態(tài)性C2995T位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。在又一個方面，野生型核苷酸探針具有Tm值55-70。C;變異型核苷酸4笨針具有Tm值55-71。C;并且單核苷酸多態(tài)性T3010C位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。本發(fā)明的另一個方面提供了用于同時檢測SAA1基因的單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的方法。本發(fā)明提供用于檢測SAA1基因的單核苷酸多態(tài)性的基因型的核苷酸引物和檢測探針。因此有可能容易地且有成本效率地檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性位點C-13T、C2995T和T3010C的基因型。對附圖的數(shù)個圖的簡要描述圖1是顯示LAMP方法的示意圖2是顯示LAMP方法的中間產(chǎn)物和內引物(FIP或BIP)的復性位點的示意性略圖3是顯示環(huán)引物位置的示意圖；圖4是顯示LAMP方法的中間產(chǎn)物和環(huán)引物(LFc或LBc)復性位點的示意性略圖5是顯示擴增產(chǎn)物的檢測位置的示意圖6是固定有探針的支持物的一個實施方案的示意性平面圖7是固定有探針的支持物的一個實施方案的示意性平面圖8是顯示BIP引物位置的示意圖9是通過使用引物組得到的擴增產(chǎn)物的電泳圖鐠；圖IO顯示包括非特異擴增產(chǎn)物在內的擴增產(chǎn)物的電泳圖語；圖11顯示了說明通過使用檢測C-13T的探針所得到試驗結果1的圖12顯示了說明通過使用檢測C-13T的探針所得到試驗結果2的圖13A顯示了說明通過使用檢測C-13T的探針所得到試驗結果3(野生型)的圖13B顯示了說明通過使用檢測C-13T的探針所得到試驗結果3(變異型)的圖13C顯示了說明通過使用檢測C-13T的探針所得到試驗結果3(雜合型)的圖14顯示了說明通過使用檢測C2995T的探針所得到試驗結果1的圖15顯示了說明通過使用檢測C2995T的探針所得到試驗結果2的圖16顯示了說明通過使用檢測T3010C的探針所得到試驗結果的和圖17顯示了說明同時檢測C-13T、C2995T和T3010C的結果的圖。發(fā)明詳述PCR方法已經(jīng)經(jīng)常用于單核苷酸多態(tài)性的檢測，但是PCR方法具有上文所述的缺點。因此在本發(fā)明中，單核苷酸多態(tài)性通過替代PCR方法的環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)方法進行檢測。在LAMP方法中，核苷酸在等溫條件下在60-65。C擴增。LAMP方法具備有可能在更短時間內得到比PCR方法量更多的擴增產(chǎn)物的優(yōu)點。還報道了該反應更少地受樣品中雜質影響。因此有可能通過LAMP方法容易地擴增粑核苷酸。在本發(fā)明的實施方案中，靶核苷酸通過LAMP方法擴增，并且分別確定野生型擴增產(chǎn)物和變異型擴增產(chǎn)物在所得擴增產(chǎn)物中的量。當存在許多野生型擴增產(chǎn)物時，可以判斷受檢測靶核苷酸的基因型是野生純合型的(wild-typehomo)。相反，當存在很多變異型擴增產(chǎn)物時，可以判斷該靶核香酸是變異純合型的(varianthomo)。備選地，當存在幾乎相同量的野生型擴增產(chǎn)物與變異型擴增產(chǎn)物時，可以判斷乾核苷酸是雜合型的。擴增產(chǎn)物的量可以例如通過使用核苷酸探針予以確定。核苷酸探針包括與野生型擴增產(chǎn)物互補的一種核苷酸探針和與變異型擴增產(chǎn)物互補的一種核苷酸纟笨4十。允許擴增產(chǎn)物與分別的核苷酸探針相互雜交，并且確定與分別的核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量。有可能通過比較與野生型核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量和與變異型核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量而確定乾核苷酸的基因型。〈LAMP方法概述〉下文將簡要描述LAMP方法。在本說明書中，接受單核苷酸多態(tài)性檢測的核苷酸(包括基因組DNA等)將稱作分析物核苷酸(analytenucleotide)。SAA1基因中由LAMP方法擴增的區(qū)域將稱作耙核苷酸。通過LAMP方法得到的產(chǎn)物將稱作擴增產(chǎn)物。含有人基因組DNA的溶液將稱作樣品溶液。在LAMP方法中，靶核苷酸設定為從5，端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)及從3，端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)。把核苷酸通過使用圖1中所示的四種引物擴增。Flc、F2c、F3c、Bl、B2和B3區(qū)是分別與Fl、F2、F3、Blc、B2c和B3c對應的互補鏈區(qū)域。在LAMP方法中用于擴增核苷酸的四種引物是(l)具有在3'端側與F2區(qū)相同的序列和在5'端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物；(2)具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物；(3)具有在3，端側與B2c區(qū)互補的序列和在5，端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物；和(4)具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物。通常，F(xiàn)IP和BIP引物叫做內引物，而F3和B3引物叫做外引物。使用四種引物的LAMP擴增產(chǎn)生具有圖2中所示啞鈴結構的中間產(chǎn)物。FIP和BIP引物與單鏈環(huán)中的F2c區(qū)和B2c區(qū)結合，并且延伸反應從每種引物的3，端和中間產(chǎn)物自身的3，端進行。詳見日本專利第3313358號。在LAMP方法中，任選地有可能通過使用叫做環(huán)引物的引物縮短擴增時間。在這種情況下，如圖3中所示，設定LF區(qū)處在F2區(qū)至F1區(qū)的區(qū)域中并且設定LBc區(qū)處在B2c區(qū)至Blc區(qū)的區(qū)域。這些區(qū)域叫做環(huán)引物區(qū)。除了四種引物外，使用具有與LF區(qū)互補的序列的環(huán)引物LFc和具有與LBc區(qū)相同的序列的環(huán)引物LBc。詳見WO2002/024902。這些環(huán)引物LFc和LBc可以同時使用，或備選地僅使用它們中的一種。環(huán)引物與這樣的環(huán)復性，其中所述的環(huán)不同于與FIT和BIP引物復性的環(huán)，如圖4中所示，產(chǎn)生額外的合成起點并且因此促進擴增。〈LAMP擴增產(chǎn)物的檢測；核苷酸探針>對于檢測單核苷酸多態(tài)性，待檢測的多態(tài)性位點位于圖5中所示的FP區(qū)或BPc區(qū)中。備選地，不同的多態(tài)性可以分別位于FP區(qū)和BPc區(qū)中。如圖5中所示，從F2區(qū)至F1區(qū)的區(qū)域是擴增產(chǎn)物中變成單鏈的部分。與此類似，從B2c區(qū)至Blc區(qū)的區(qū)域也是擴增產(chǎn)物中變成單鏈的部分。有可能通過使待檢測的多態(tài)性位點位于單鏈部分中而使得借助核苷酸探針的檢測更容易。設計核苷酸探針與含有多態(tài)性位點的FP區(qū)或BPc區(qū)結合。因此，核苷酸探針具有與在FP區(qū)或BPc區(qū)中的含有多態(tài)性位點的區(qū)域互補的序列。與FP區(qū)互補的FPc區(qū)和與BPc區(qū)互補的BP區(qū)也存在于擴增產(chǎn)物中，因此，有可能使用FPc區(qū)和BP區(qū)用于檢測。在本說明書中，含有與野生型擴增產(chǎn)物的序列互補的序列的核苷酸探針叫做野生型核苷酸探針，而含有與變異型擴增產(chǎn)物的序列互補的序列的核苷酸探針叫做變異型核苷酸探針。核苷酸探針可以由(但不限于)DNA、RNA、PNA、LNA、具有砩酸甲酯骨架的核苷酸或其它合成的核苷酸鏈組成。為了固定在支持物上，其末端可以用反應性官能團如氨基、羧基、羥基、巰基或磺酰基進行修飾?？梢栽诠倌軋F與核苷酸間導入間隔區(qū)。間隔區(qū)可以具有例如烷基骨架、乙二醇骨架等。<固定有核苷酸探針的支持物>核苷酸探針可以例如在其固定在支持物上時加以使用。固定有核苷酸探針的支持物可以在已知裝置如所謂DNA芯片和DNA微陣列中使用。固定有探針的支持物的實施方案在圖6中顯示。探針固定在支持物1的固定區(qū)2內。支持物1可以用硅基材制備，但是不限于此。探針可以通過任意的已知方法進行固定?？梢栽谥С治锷蟽H固定一種探針，或在支持物上固定不同種類的探針，探針的位置和數(shù)目可以根據(jù)需要由本領域技術人員調節(jié)。如下文描述，本實施方案的固定有探針的支持物可以用于探針的熒光檢測。另一個實施方案中的固定有探針的支持物的示意圖在圖7中顯示。在該實施方案中，電極12在支持物ll上形成。探針固定在電極12上。每個電極12與提取電信息的墊片13連接。支持物11可以例如從硅基材中制備，但是不限于此。電極的產(chǎn)生和探針的固定可以通過任意的已知方法進行。電極可以由任何材料制成，其中所述材料包括但不限于單種金屬如金、金合金、銀、鉑、汞、鎳、鈀、硅、鍺、鎵和鴒、其合金、碳如石墨和玻璃化炭黑及其氧化物或化合物。圖7中所示的固定支持物具有IO個電極，但是在單種支持物上所形成電極的數(shù)目不限于此并且可以任選地進行調整。電極的位置模式也不限于該圖中顯示的模式，并且可以根據(jù)需要由本領域技術人員調節(jié)。參考電極和對電極可以根據(jù)需要在支持物1上形成。如下文描述，根據(jù)該實施方案的固定有探針的支持物可以用于電化學檢測。<核苷酸探針與擴增產(chǎn)物的雜交>擴增產(chǎn)物在合適條件下與核苷酸探針雜交。合適條件根據(jù)擴增產(chǎn)物的種類和結構、具體而言，雜交在離子強度0.01-5以及pH5-10的緩沖液中進行。作為雜交促進劑的硫酸葡聚糖、鮭精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性劑等可以添加至反應液中。反應溫度是例如10-90'C，并且可以攪拌或振搖反應混合物以改善反應效率。在反應后，緩沖液，例如具有離子強度0.01-5和pH5-10的緩沖液，可以用于洗滌。<檢測方法>在固定在支持物上的探針與擴增產(chǎn)物間的雜交產(chǎn)生雙鏈核苷酸。雙鏈核苷酸可以以電化學方式或通過熒光加以檢測。(a)電流檢測系統(tǒng)雙鏈核苷酸的電化學檢測將描述如下。該方法使用特異性地識別雙鏈核苷酸的雙鏈識別性化合物。雙鏈識別性化合物的實例包括，但不限于Hoechst33258、吖咬橙、喹吖因、道諾霉素、金屬嵌入劑、雙嵌入劑如雙吖啶、三嵌入劑和聚嵌入劑。這些物質可以用電化學活性的金屬絡合物如二茂4失或viologen進行修飾。雙鏈識別性化合物的濃度可以根據(jù)該化合物種類變化，但通常它以1ng/mL-lmg/mL濃度使用。此時，優(yōu)選地使用離子強度0.001-5和pH5-10的緩沖液。雙鏈識別性化合物在雜交反應期間或之后添加至反應液中。若雜交形成雙鏈核苷酸，則雙鏈識別性化合物與雙鏈核苷酸結合。例如，有可能通過施加這樣的電勢而測定源自雙鏈識別性化合物的反應電流，其中所述電勢比引起雙鏈識別性化合物的電化學反應的電勢高。此時可以恒定速率施加電勢，或以脈沖形狀或以恒定電壓施加。電流和電壓可以在測定期間通過使用一種設備如恒電位儀、數(shù)字式多量程測定儀表或函數(shù)發(fā)生器加以控制。例如，優(yōu)選使用在JP-A10-146183(KOKAI)中公開的已知電化學檢測方法。(b)熒光檢測方法通過熒光檢測雙鏈核普酸的方法將描述如下。引物事先用熒光活性物質標記。備選地，以經(jīng)熒光活性物質標記的第二探針進行檢測。可以使用帶多重標記的第二揮:針。熒光活性物質的實例包括，但不限于熒光色料如FITC、Cy3、Cy5和羅丹明。熒光材料例如用熒光檢測儀檢測。適用于標記物種類的檢測儀用來檢測標記的待檢測序列或第二探針。<核苷酸引物的選擇>圖8是顯示核苷酸引物的示意圖，此時單核苷酸多態(tài)性C-13T位于Blc與B2c之間的區(qū)域即BPc區(qū)域中。FIP引物具有如Blc區(qū)那樣的相同序列以及與F2區(qū)序列互補的序列?？梢栽O計多種引物，只要B2c區(qū)和Blc區(qū)處在它們之間包含C-13T的位置。然而，本發(fā)明人的研究已經(jīng)揭示LAMP方法的擴增效率根據(jù)引物的種類而變化。例如，擴增通過使用圖8中所示四種引物中的一種引物以及共有的3種引物(BIP、F3和B3引物)進行。作為結果，用引物l的樣品甚至在足夠長的時間后(例如2小時后)未得到擴增。用引物2的樣品在約1小時后得到擴增，但是引物的非特異擴增發(fā)生。用引物3的樣品未引起引物的非特異擴增，但是需要擴增時間1.5-2小時。用引物4的樣品沒有引起引物的非特異擴增并且在1小時內完成擴增。在這種情況下，優(yōu)選用于擴增的引物是引物3和4，并且最佳引物是引物4。正是極優(yōu)異引物在擴增效率上才較高，在短時間期間允許擴增，并且不引起非特異擴增。對于用核苷酸探針檢測擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物優(yōu)選地以高效率與核苷酸探針雜交。因此，擴增產(chǎn)物的雜交效率也在評價引物時進行考慮。此外，人SAA1基因是與人SAA2、SAA3和SAA4基因高度同源的。因此為了SAA1的特異性擴增，用于內引物的任何一個或多個區(qū)域即F2、Fl、Blc和B2c區(qū)應當設計位于其中SAA1基因序列與上述三種基因序列不同的區(qū)域中。此外，內引物、外引物和環(huán)引物優(yōu)選地不位于其中報道有突變的位點處。若引物不得不在突變位置中任選地進行設計，則優(yōu)選導入混合堿基或通用堿基如脫氧肌苷(dl)。內部無單核苷酸多態(tài)性的另一種內引物優(yōu)選地位于這樣的區(qū)域中，該區(qū)域具有從F2至B2的450bp或更少、更優(yōu)選350bp或更少的長度。此17外，優(yōu)選地設計兩種內引物以產(chǎn)生100bp或更少、更優(yōu)選70bp或更少的單鏈環(huán)長度。引物之間的非特異擴增是在LAMP反應中經(jīng)常存在的現(xiàn)象。含有Flc區(qū)和F2區(qū)的FIP引物經(jīng)常是長鏈核苷酸。類似地，含有Blc區(qū)和B2區(qū)的BIP引物經(jīng)常是長鏈核苷酸。因此，在FIP引物間、BIP引物間、或FIP引物與BIP引物可能相互絞纏，經(jīng)常導致其中引物作為才莫板的擴增。非特異性反應的可能性在LAMP反應中比在PCR反應中更高，因為反應液含有F3引物和B3引物并且在一些情況下還含有LFc引物和LBc引物。這種非特異性反應導致想要的LAMP產(chǎn)物的量減少，其中所述想要的LAMP產(chǎn)物通過4吏用分析物核苷酸作為模板得到。若非特異性反應在不含有添加的分析物核苷酸的陰性對照反應液中出現(xiàn)，則不可能確定隨擴增進行而釋放的焦磷酸與Mg的白色沉淀是否由非特異擴增或由污染引起。因此，重要的是消除可能引起非特異擴增的引物。因此，本發(fā)明人已經(jīng)實施試驗以選擇最優(yōu)選用于擴增SAA1基因的單核苷酸多態(tài)性C-13T的核苷酸引物，以及也最優(yōu)選用于擴增單核苷酸多態(tài)性C2995T和T3010C的核苷酸引物。試驗1:用于C-13T的引物]擴增反應通過使用含有在FP區(qū)中的SAA1C-13T多態(tài)性位點的12種核苷酸引物組在63'C進行1小時或2小時。反應液的組分在表l中顯示。所用模板DNA是人基因組。為檢驗污染及非特異擴增的存在或不存在，在全部引物組中制備含有替代人基因組的滅菌超純水的陰性對照。在擴增反應后，擴增產(chǎn)物通過3%瓊脂糖電泳鑒定。所用的核苷酸引物組在表2中顯示。表1LAMP反應組分BstDNA聚合酶2x緩沖液1|iL12.5jiLTris'HClpH8.040mMKC120mMMgS0416mM(NH4)2S0420mM吐溫200.2%甜菜堿1.6MdNTP2.8mMF3引物(10nM)0.5JlaLB3引物(IOjiM)0.5jliLFIP引物(40|iM)1|iLBIP引物(40nM)1LFc引物(20pM)1|jiL人基因組(30ng/nL)1jiL滅菌超純水6.5總計25表2將C-13T設計在位于BP或BPc區(qū)中的12種核普酸引物組<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>F3引物具有用于引物組1-6和8-10的SEQIDNo.14的序列，具有用于引物組11和12的SEQIDNo.15的序列，以及具有用于引物組7的SEQIDNo.l6的序列。B3引物具有用于引物組1-5、7、8、11和12的SEQIDNo.l7的序列，以及具有用于引物組6、9和10的SEQIDNo.18的序列。\0.32)產(chǎn)生強度相對較弱的信號。野生型核苷酸探4十(16C:SEQIDNo.28、17C:SEQIDNo.29、18C:SEQIDNo.30、和20C:SEQIDNo.31)和變異型核苷酸探針(17T:SEQIDNo.33、18T:SEQIDNo.34、19T:SEQIDNo.35、和20T:SEQIDNo.36)產(chǎn)生強度幾乎相同的信號。[試驗3-3:用于檢測C-13T的探針J隨后，雜交以與試驗3-1相似的方式在反應溫度55。C上進行20分鐘。隨后，將固定有核苷酸探針的支持物在40、45或50。C于0.2xSSC洗滌緩沖液中浸泡20分鐘。本試驗中用于擴增的分析物核苷酸是3種人基因組，其由PCR-RFLP分析確定分別是野生純合型、變異純合型和雜合型的。[試驗3-3:結果結果在圖13A-13C中總結，在DNA芯片未進行洗滌(僅用超純水溫和地洗滌)時，存在由變異型核苷酸探針檢測到的野生型擴增產(chǎn)物并且還存在由野生型核苷酸探針檢測到的變異型擴增產(chǎn)物，表明存在非特異性雜交。在洗滌溫度40°C時的結果幾乎與未洗滌的那些結果相同。在洗滌溫度45。C時，野生型擴增產(chǎn)物由野生型核苷酸探針(16C、17C和18C)以高信號強度檢測到，但是幾乎沒有信號由變異型核苷酸探針(17T、18T和19T)檢測到。類似地，變異型擴增產(chǎn)物由變異型核苷酸探針(17T、18T和19T)以高信號強度檢測到，但是野生型核苷酸探針(16C、17C和18C)幾乎沒有檢測到信號，表明由非特異性雜交形成的鍵通過在45。C洗滌受到破壞。備選地，雜合型擴增產(chǎn)物均由野生型核苷酸探針(16C、17C和18C)和變異型核苷酸探針(17T、18T和19T)以高信號強度檢測到。在洗滌溫度50'C時，檢測到的電流較低，表明擴增產(chǎn)物通過洗滌而與核苷酸探針分開。在洗滌溫度50'C時，若擴增產(chǎn)物是野生型，雖然由野生型核苷酸探針產(chǎn)生的信號下降，但是由變異型核苷酸探針(20T)產(chǎn)生的信號仍是高的。類似地，如果擴增產(chǎn)物是變異型，雖然由變異型核苷酸探針產(chǎn)生的信號下降，但由野生型核苷酸探針(20C)產(chǎn)生的信號仍是高的，表明盡管特異性信號減少，但是仍存在一些非特異性結合。結果顯示野生型核苷酸探針(16C、17C和18C)和變異型核苷酸探針(17T、18T和19T)產(chǎn)生了理想的檢測模式。因此，根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選使用的核苷酸探針是野生型核苷酸探針(16C:SEQIDNo.28、17C:SEQIDNo.29、和18C:SEQIDNo.30)和變異型核苷酸探針(17T:SEQIDNo.33、18T:SEQIDNo.34、和19T:SEQIDNo.35)。試驗中所用核苷酸探針的Tm值也在表4中總結。如從表4中顯而易見，本發(fā)明中優(yōu)選使用的核苷酸探針是具有Tm值63-77。C、優(yōu)選70-74。C的野生型核苷酸探針和具有Tm值63-74'C、優(yōu)選68-74X:的變異型核苷酸探針。試驗4-1:用于檢測C2995T的探針JLAMP擴增通過使用人基因組作為才莫板以及還使用用于檢測C2995T和T3010C的引物組3在6:TC進行1小時，其中所述的人基因組由PCR-RFLP分析確定是雜合型。用于檢測C2995T和T3010C的引物組3是在以上試驗2中確定為最佳的引物組。所得的擴增產(chǎn)物在電流檢測DNA芯片上進行檢測。核苷酸探針測試的核苷酸探針的核苷酸序列總結在表5中。所用的核普酸探針是正鏈。核苷酸探針的3，端受巰基修飾以固定在電極上。陰性對照探針是具有與SAA1基因序列完全不相關的序列的核苷酸。表5用于檢測使用C-2995T和T3010C檢測用引物組3擴增的產(chǎn)物的C-2995T檢測用核苷酸探針<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>固定有核苷酸探針的支持物固定有核苷酸探針的支持物以與試驗3-1相似的方式進行制備。核苷酸探針分別固定在下列電極上電極l-2:陰性探針(SEQIDNo.26)，電極3-4:野生型核苷酸探針13mer(SEQIDNo.37),電極5-6:野生型核苷酸探針14mer(SEQIDNo.38)，電極7-8:野生型核苷酸探針15mer(SEQIDNo.39)，電極9-10:野生型核苷酸探針16mer(SEQIDNo.40)，電極11-12:野生型核苷酸探針17mer(SEQIDNo.41)，電極13-14:變異型核苷酸探針14mer(SEQIDNo.42)，電極15-16:變異型核苷酸探針16mer(SEQIDNo.43),電極17-18:變異型核苷酸探針17mer(SEQIDNo.44)，電極19-20:變異型核苷酸探針18mer(SEQIDNo.45)，和電極21-22:變異型核苷酸探針20mer(SEQIDNo.46)。擴增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及對雜交的檢測向通過擴增得到的擴增產(chǎn)物添加鹽，終濃度是2xSSC,并且使混合物與固定在電極上的核苷酸探針雜交。反應溫度是35、45、50、55和60。C,并且反應時間是20分鐘。隨后，DNA芯片溫和地用超純水洗滌。DNA芯片在含有50nM嵌入劑Hoechst33258的磷酸鹽緩沖液中浸泡10分鐘并進行洗滌，并且隨后測定Hoechst33258分子的氧化性電流應答。[試驗4-l:結果I結果在圖14中總結。信號隨反應溫度增加而增加，表明反應溫度的增加引起雜交效率的增加。在反應溫度55。C和60。C的試驗產(chǎn)生幾乎相同的結果。[試驗4-2:用于檢測C2995T的探針l隨后，使用用引物組3擴增的產(chǎn)物進行雜交，雜交以與試驗3-3相似的方式在反應溫度55。C進行20分鐘。隨后，將固定有核苷酸探針的支持物在45'C于0.2xSSC洗滌緩沖液中浸泡20分鐘洗滌。本試驗中用于擴增的分析物核苷酸是3種人基因組，其由PCR-RFLP分析確定分別是野生純合型、變異純合型和雜合型。本試驗中所用的核苷酸探針和檢測方法與用于試驗4-l的那些核苷酸探針和檢測方法是相同的。[試驗4-2:結果l結果在圖15中總結。野生型擴增產(chǎn)物由野生型核苷酸探針(14C、15C和16C)以高信號強度檢測到，而幾乎沒有信號由變異型核苷酸探針(16T、17T和18T)檢測到。類似地，變異型擴增產(chǎn)物由變異型核苷酸探針(16T、17T和18T)以高信號強度檢測到，而野生型核苷酸探針(14C、15C和16C)幾乎沒有檢測到信號。此外，雜合型擴增產(chǎn)物均由野生型核苷酸探針(14C、15C和16C)和變異型核苷酸探針(16T、17T和18T)以高信號強度檢測到。結果顯示野生型核苷酸探針(14C、15C和16C)和變異型核苷酸探針(16T、17T和18T)產(chǎn)生了理想的檢測模式。因此，根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選使用的核苷酸探針是野生型核苷酸探針(14C:SEQIDNo.38、15C:SEQIDNo.39、和16C:SEQIDNo.40)和變異型核苷酸探針(16T:SEQIDNo.43、17T:SEQIDNo.44、和18T:SEQIDNo.45)。試驗中所用核苷酸探針的Tm值也在表5中總結。如從表5中顯而易見，本發(fā)明中優(yōu)選使用的核苷酸探針是具有Tm值63-74。C、優(yōu)選67-71'C的野生型核苷酸探針和具有Tm值61-74°C、優(yōu)選66-70匸的變異型核苷酸探針。[試驗5:用于檢測T3010C的探針LAMP擴增通過使用人基因組作為模板以及還使用用于檢測C2995T和T3010C的引物組3在63。C進行1小時，其中所述的人基因組由PCR-RFLP分析確定是野生純合型、變異純合型和雜合型。用于檢測C2995T和T3010C的引物組3是在以上試驗2中確定為最佳的引物組。所得的擴增產(chǎn)物在電流檢測DNA芯片上進行檢測。核苷酸探針測試的核苷酸探針的核苷酸序列在表6中總結。所用的核苷酸探針是正鏈。核苷酸探針的3，端受巰基修飾以固定在電極上。陰性對照探針是具表6用于檢測使用C-2995T和T3010C檢測用引物組3擴增的產(chǎn)物的T3010C檢測用核苷酸探針<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>固定有核苷酸探針的支持物固定有核苷酸探針的支持物以與試驗3-1相似的方式進行制備。核苷酸探針分別固定在下列電極上電極1-2:陰性探針(SEQIDNo.26),電極3-4:野生型核苷酸探針19mer(SEQIDNo.47),電極5-6:野生型核苷酸探針21mer(SEQIDNo.48)，電極7-8:野生型核苷酸探針22mer(SEQIDNo.49),電極9-10:野生型核苷酸探針23mer(SEQIDNo.50)，電極11-12:野生型核苷酸探針26mer(SEQIDNo.51)，電極13-14:變異型核苷酸探針17mer(SEQIDNo.52)，電極15-16:變異型核苷酸探針19mer(SEQIDNo.53),電極17-18:變異型核苷酸探針20mer(SEQIDNo.54)，電極19-20:變異型核苷酸探針21mer(SEQIDNo.55)，電極21-22:變異型核苷酸探針22mer(SEQIDNo.56)，和電極23-24:變異型核苷酸探針25mer(SEQIDNo.57)。擴增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及對雜交的檢測向通過擴增得到的擴增產(chǎn)物添加鹽，終濃度是2xSSC，并且使混合物與固定在電極上的核苷酸探針雜交。反應溫度是55。C，并且反應時間是20分鐘。隨后，該芯片在45°C洗滌20分鐘。電極在含有50|uM嵌入劑Hoechst33258的磷酸鹽緩沖液中浸泡10分鐘并進行洗滌，并且隨后測定Hoechst33258分子的氧化性電流應答。[試^驗5:結果結果在圖16中總結。用于檢測野生型的核苷酸探針(21T、22T和23T)和用于檢測變異型的核苷酸探針(19C、20C、21C和22C)顯示理想的檢測模式。野生型擴增產(chǎn)物由野生型核苷酸探針(21T、22T和23T)以高的信號增加而檢測到，在變異型核苷酸探針(19C、20C、21C和22C)的情況下，由于非特異性雜交受到;皮壞，幾乎沒有檢測到信號增加。類似地，變異型擴增產(chǎn)物由變異型核苦酸探針(19C、20C、21C和22C)以高的信號增加被檢測到，在野生型核苷酸探針(21T、22T和23T)的情況下，由于非特異性雜交受到破壞，幾乎沒有檢測到信號增加。此外，雜合型擴增產(chǎn)物均由野生型核苷酸探針(21T、22T和23T)和變異型核苷酸探針(19C、20C、21C和22C)以高的信號增加被檢測到。結果顯示根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選使用的核苷酸探針是野生型核苷酸探針s(21T:SEQIDNo.48、22T:SEQIDNo.49、和23T:SEQIDNo.50)以及變異型核苷酸探針(19C:SEQIDNo.53、20C:SEQIDNo.54、21C:SEQIDNo.55、和22C:SEQIDNo.56)。試驗中所用核苷酸探針的Tm值也在表6中總結。如從表6中的結果顯而易見，本發(fā)明中優(yōu)選使用的核苷酸探針是具有Tm值55-70°C、優(yōu)選59-64°C的野生型核苷酸探針和具有Tm值55-71。C、優(yōu)選60-67'C的變異型核苷酸探針。<分析物樣品>對接受本發(fā)明處理的分析物樣品不作具體限制，并且可以例如是人血液、血清、白細胞、發(fā)根或口粘膜。核苷酸成分從分析物樣品提取，以便制備用于進行檢測乾核苷酸試驗的樣品溶液。對提取方法不作具體限制，并且例如可商業(yè)獲得的核苷酸提取工具如QIAamp(由QIAGEN制造)或Sumai試驗(SumitomoMetalIndustries,Ltd.)可以4吏用。<試劑盒>本發(fā)明的另一方面提供了試劑盒，包括上文對LAMP方法所述的在本發(fā)明檢測方法中使用的引物組。試劑盒可以任選地含有例如鏈置換性DNA聚合酶、合成底物和緩沖液。在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測以本發(fā)明引物組所擴增的擴增產(chǎn)物的核苷酸探針。本發(fā)明還提供了固定有核苷酸探針的支持物，其中本發(fā)明的核苷酸探針在所述支持物上固定。優(yōu)選地將DNA芯片或DNA微陣列提供作為固定有探針的支持物。本發(fā)明的試劑盒也可以額外地包括核苷酸探針或固定有核苷酸探針的支持物。34在本發(fā)明的另一個方面，提供了同時檢測SAA1的單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T和T3010C的方法。在這個方面，C-13T、C2995T和T3010C如上所述分別進行擴增，并且隨后混合擴增產(chǎn)物以制備液體混合物。液體混合物如上文所述進行檢測。在這個方面，有可能同時檢測到C-13T、C2995T和T3010C的基因型。實施例[C-13T、C2995T和T3010C的同時檢測l進行了用于同時檢測C-13T、C2995T和T3010C的試驗。人基因組通過使用用于檢測C-13T的核苷酸引物組2(試驗l)和用于檢測C2995T和T3010C的核苷酸引物組3(試驗2)在63X:持續(xù)1小時分別進行擴增。所用的人基因組是由PCR-RFLP分析確定分別是野生純合型、變異純合型和雜合型這3種人基因組。在擴增反應后，混合兩種擴增產(chǎn)物以制備混合的反應液。<通過導入環(huán)引物而縮短擴增時間>向用于在25|al反應液中檢測C-13T的核苷酸引物組2添加40pmolSEQIDNo.58的LFc環(huán)引物。向用于在25pl反應液中檢測C2995T和T3010C的核苷酸引物組3添加40pmolSEQIDNo.59的LBc環(huán)引物。隨后，分別擴增混合物。作為結果，達到飽和所需要的擴增時間在這兩種情況下從60分鐘縮短至約30分鐘。將用于C-13T檢測的LAMP擴增產(chǎn)物和用于檢測C2995T和T3010C的LAMP擴增產(chǎn)物混合，并且對混合物開展C-13T、C2995T和T3010C的同時檢測。核苷酸探針將混合的反應液用C-13T的核苷酸探針、C2995的核苷酸探針和T3010C的核苷酸探針進行檢測。核普酸探針如下C-13T野生型核苷酸探針(SEQIDNo.28),變異型核苷酸探針SEQIDNo.33);C2995T野生型核普酸探針(SEQIDNo.38)，變異型核苷酸纟笨針(SEQIDNo.43);和T3010C野生型核苷酸探針(SEQIDNo.50),變異型核苷酸探針(SEQIDNo.55)。用于C-13T和C2995T的核苷酸探針是正鏈探針，而用于T3010C的核苷酸探針是負鏈探針。全部核苷酸探針的3'端是經(jīng)巰基修飾的。固定有探針核苷酸的電極的制備固定有探針核苷酸的電極以與上文試驗3-l相似的方法進行制備。核苷酸探針分別固定在下列電極上電極1-2:陰性探針(SEQIDNo.26),電極3-4:C-13T野生型核苷酸探針16mer(SEQIDNo.28),電極5-6:C-13T變異型核苷酸探針17mer(SEQIDNo.33)，電極7-8:C2995T野生型核苷酸探針14mer(SEQIDNo.38)，電極9-10:C2995T變異型核苷酸探針16mer(SEQIDNo.43)，電極11-12:T3010C變異型核苷酸探針23mer(SEQIDNo.50),和電極13-14:T3010C變異型核苷酸探針21mer(SEQIDNo.55)。擴增產(chǎn)物與核苷酸探針間的雜交及對雜交的檢測雜交以類似于試驗3的方式在55。C進行20分鐘并45。C清洗20分鐘，并且隨后，將DNA芯片用超純水溫和地清洗。電極在含有50nM的Hoechst33258作為嵌入劑的磷酸鹽緩沖液中浸泡10分鐘并且隨后測定Hoechst33258分子的氧化性電流應答。[結果l結果在圖17中總結。對C-13T、C2995T和T3010C觀察到理想的檢測模式。結果顯示有可能使用DNA芯片同時檢測C-13T、C2995T和T3010C。其它的優(yōu)點和修改對本領域技術人員而言是易于產(chǎn)生的。因此，本發(fā)案。因此，可以做出多種修改而不脫離如由所附加權利要求書及其等效物定義的一般發(fā)明性概念的精神和范圍。序列表<110>株式會社東芝<120>用于檢測血清淀粉狀蛋白A1(SAA1)的基因型的核苷酸引物組和核苷酸探針<130>07S1161<140><141><150>JP2007.117346<151>2007-04-26<160>59<170>Patentln版本3.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-1引物<400>1cagtggtttcttcatcccgcaggcacatcttgttccctc39<210>2<211>42<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-1引物<400>2ggaaggctcagtataaatagcatagctgagctgcgggtccct42<210>3<211>42<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-2引物<400>3ggaaggctcagtataaatagcagtgctgtagctgagctgcgg42<210>4<211>43<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-3引物<400>4ggaaggctcagtataaatagcaacctgatctgtgctgtagctg43<210>5<211>38<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-4引物<400>5ggaaggctcagtataaattgtagctgagctgcgggtcc38<210>6<211>38<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-5引物<400>6ggaaggctcagtataaatgtgctgtagctgagctgcgg38<210>7<211>39<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-6引物<400>7ggaaggctcagtataaatacctgatctgtgctgtagctg39<210>8<211>41<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-7引物<400>8ggaaggctcagtataaatagcactcctcacctgatctgtgc41<210>9<211>40<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-8引物<400>9ggaaggctcagtataaatagcacttggtgtgctcctcacc40<210>10<211>42<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-9引物<400>10ggaaggctcagtataaatagcaaaaatcactccttggtgtgc42<210>11<211>32<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-2弓I物<400>11ctgtcagggcaggagacctccgcagcctcagc32<210>12<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-3引物<400>12gctgtcagggcaggagaccccgcagcctcagcc33<210>13<211>44<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-4弓I物<400>13ctgcaggtcatttcccctacatccaggaacttgtcttagaccgt44<210>14<211>18<212>DNA<213>人工的<220><223>F3-1引物<400>14gtctcctgccctgacagc18<210>15<211>19<212>DNA<213>人工的<220><223>F3-2弓l物<400>15tcaggagctggcttcaaag19<210>16<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>F3-3弓i物<400>16caggcacatcttgttccctc20<210>17<211>19<212>DNA<213>人工的<220><223>B3-l引物<400>17actccttggtgtgctcctc19<210>18<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>B3-2弓l物<400>18aatgataatcttgttgggaaagag24<210>19<211>32<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-1引物<400>19cgtcccaggagctctgctcgggggaactatga32<210>20<211>39<212>DNA<213>人工的<220><223>BIP-1引物<400>20ctgttc3tccagcctagggggatgaaaacactgggcacc39<210>21<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-2弓I物<400>21cgtcccaggagctcctgctcgggggaactatga33<210>22<211>28<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-3引物<400>22cgtcccaggagctcagggg3cctggggg28<210>23<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>FIP-4弓j物<400>23cgtcccaggagctccaggggacctggggg29<210>24<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>F3弓l物<400>24ccaattacatcggctcagac20<210>25<211>17<212>簡A<213>人工的<220><223>B3弓|物<400>25tgagcaatagcccaccc17<210>26<211>14<212>DNA<213>人工的<220〉<223>陰性對照探針<400>26gtgCtgCElggtgcg14<210>27<211>14<212>DNA<213>人工的<220><223>C-13T野生型探針<400>27caccgctccctggc14<210>28<211>16<212>DNA<213>人工的<220><223>C-13T野生型探針<400>28ccaccgctccctggca16<210>29<211>17<212>DNA<213>人工的<220><223>C-13T野生型探針<400>29gccaccgctccctggca17<210>30<211>18<212>酒A<213>人工的<220><223>C-13T野生型探針<400>30agccaccgctccctggca18<210>31<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223〉C.13T野生型探針<400>31cagccaccgctccctggcag20<210>32<211>15<212>DNA<213>人工的<220><223>013T變異型探針<400>32caccgttccctggca15<210>33<211>17<212>DNA<213>人工的<220><223>C-13T變異型探針<400>33ccaccgttccctggcag17<210>34<211>18<212>DNA<213>人工的<220><223>013T變異型探針<400>34agccaccgttccctggca18<210>35<211>19<212>菌A<213>人工的<220><223>C-13T變異型探針<400>35cagccaccgttccctggca19<210>36<211>201.<212>DNA<213>人工的<220><223>C-13T變異型探針<400>36cagccaccgttccctggcag20<210>37<211〉13<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T野生型探針<400>37ggggtgcctgggc13<210>38<211>14<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T野生型探針<400>38gggggtgcctgggc14<210>39<211>15<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T野生型探針<400>39tgggggtgcctgggc15<210>40<211>16<212>DNA1.<213>人工的<220><223〉C2995T野生型探針<400>40ctgggggtgcctgggc16<210>41<211>17<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T野生型探針<400>41cctgggggtgcctgggc17<210>42<211>14<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T變異型探針<400>42gggggtgtctgggc14<210>43<211>16<212>DNA<213>人工的<220><223>C2995T變異型探針<400>43ctgggggtgtctgggc16<210>44<211>17<212>DNA<213>人工的48<formula>formulaseeoriginaldocumentpage49</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage50</formula><223>T3010C變異型探針<400>52ttacctgatcgcttctg17<210>53<211>19<212>DNA<213>人工的<220><223>T3010C變異型探針<400>53gttacctgatcgcttctgc19<210>54<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>T3010C變異型探針<400〉54agttacctgatcgcttctgc20<210>55<211>21<212>DNA<213>人工的<220><223>T3010C變異型探針<400>55cagttacctgatcgcttctgc21<210>56<211>22<212>DNA<213>人工的<220><223>T3010C變異型探針<■>56ccagttacctgatcgcttctgc22<210>57<211>25<212>DNA<213>人工的<220><223>T3010C變異型探針<400>57tccagttacctgatcgcttctgcrg25<210>58<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>LFc弓l物<400>58gtcatttatcccagttgtgcaacc24<210>59<211>16<212>DNA<213>人工的<220><223>LBc弓l物<400>59agcctggctgaatggg1權利要求1.用于LAMP擴增的核苷酸引物組，其用于檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T的基因型，其特征在于當靶核苷酸從5’端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)及從3’端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和B1c區(qū)時，并且當存在這樣的核苷酸引物時，其中所述的核苷酸引物包括具有在3’端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5’端側與F1區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3’端側與B2c區(qū)互補的序列和在5’端側與B1c區(qū)序列相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物，引物組包含選自表2中所示引物組1-7中的FIP引物和BIP引物；與自靶核酸的F2區(qū)5’端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的F3引物；和與自靶核酸的B2c區(qū)3’端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的B3引物。2.根據(jù)權利要求1所述的核苷酸引物組，其特征在于FIP和BIP引物選自表2中所示的引物組l、2、3、4和6。3.根據(jù)權利要求1所述的核苷酸引物組，其特征在于FIP和BIP引物是表2中所示引物組2的引物。4.檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權利要求1所述的核苷酸引物組擴增乾核酸而獲得擴增產(chǎn)物；和5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于通過固定在支持物(l，ll)上的核苷酸探針與擴增產(chǎn)物的雜交及隨后確定與核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量來測定擴增產(chǎn)物，并且核苷酸探針包括與野生型擴增產(chǎn)物互補的野生型核苷酸探針和與變異型擴增產(chǎn)物互補的變異型核苷酸探針。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值63-77'C，變異型核苷酸探針具有Tm值63-74'C，并且單核苷酸多態(tài)性C-13T位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值70-74。C并且變異型核苷酸探針具有Tm值68-74。C。8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.28、29或30的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.33、34或35的序列或與其互補的序列。9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.28的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.33的序列或與其互補的序列。10.用于從擴增產(chǎn)物中檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T的基因型的核苷酸探針，所述的擴增產(chǎn)物通過使用核苷酸引物組擴增耙核苷酸而得到，所述核苷酸探針的特征在于包含選自野生型核苷酸探針和變異型核苷酸探針的核苷酸探針，其中野生型核苷酸探針是與野生型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值63-77°C，以及單核苷酸多態(tài)性C-13T位點位于自該野生型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且變異型核苷酸探針是與變異型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值63-74°C，以及單核苷酸多態(tài)性C-13T位點位于自該變異型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且其中當靼核苷酸從5，端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)及從3'端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時，當核苷酸引物組包括具有在3'端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5，端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3，端側與B2c區(qū)互補的序列和在5，端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物時，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表2中所示的引物組1-7;F3引物與自耙核酸的F2區(qū)5，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合；以及B3引物與自靶核酸的B2c區(qū)3，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合。11.根據(jù)權利要求10所述的核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.28、29或30的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.33、34或35的序列或與其互補的序列。12.根據(jù)權利要求10所述的核苷酸探針，其特征在于探針固定在支持物(l,ll)上。13.用于LAMP擴增的核苷酸引物組，其用于檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C2995T和/或T3010C的基因型，其特征在于當輩巴核苷酸從5，端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)及從3，端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時，并且當存在這樣的核苷酸引物時，其中所述的核苷酸引物包括具有在3，端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5，端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3，端側與B2c區(qū)互補的序列和在5'端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物、和具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物，引物組包含選自表3中所示引物組l-4中的FIP引物和BIP引物；與自靶核酸的F2區(qū)5，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的F3引物；和與自靶核酸的B2c區(qū)3'端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合的B3引物。14.根據(jù)權利要求13所述的核苷酸引物組，其特征在于FIP和BIP引物是表3中所示引物組3的引物。15.檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C2995T或T3010C的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用根據(jù)權利要求13所述的核苷酸引物組擴增靶核酸而得到擴增產(chǎn)物；和測定并比較在擴增產(chǎn)物中含有的野生型擴增產(chǎn)物和變異型擴增產(chǎn)物的16.根據(jù)權利要求15所迷的方法，其特征在于通過固定在支持物(l,ll)上的核苷酸探針與擴增產(chǎn)物的雜交及隨后確定與核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量來測定擴增產(chǎn)物，并且核苷酸探針包括與野生型擴增產(chǎn)物互補的野生型核苷酸探針以及與變異型擴增產(chǎn)物互補的變異型核苷酸探針。17.根據(jù)權利要求16所述的用于檢測單核苷酸多態(tài)性C2995T的基因型的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值63-74。C，變異型核苷酸探針具有Tm值61-74。C，并且單核苷酸多態(tài)性C2995T位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。18.根據(jù)權利要求17所迷的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值67-71°C，并且變異型核苷酸探針具有Tm值66-70。C。19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.38、39或40的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸4笨針具有SEQIDNo.43、44或45的序列或與其互補的序列。20.根據(jù)權利要求19所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.38的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.43的序列或與其互補的序列。21.根據(jù)權利要求16所述的用于檢測單核苷酸多態(tài)性T3010C的基因型的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值55-70°C，變異型核苷酸探針具有Tm值55-71°C，并且單核苷酸多態(tài)性T3010C位點位于自分別的核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側。22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有Tm值59-64°C,并且變異型核苷酸探針具有Tm值60-67°C。23.根據(jù)權利要求22所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.48、49或50的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.53、54、55或56的序列或與其互補的序列。24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.50的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探^l十具有SEQIDNo.55的序列或與其互補的序列。25.用于從擴增產(chǎn)物中檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C2995T的基因型的核苷酸探針，所述的擴增產(chǎn)物通過使用核苷酸引物組擴增靶核苷酸而得到，所述核苷酸探針的特征在于包含選自野生型核苷酸探針和變異型核苷酸探針的核苷酸探針，其中野生型核苷酸探針是與野生型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值63-74°C，且單核苷酸多態(tài)性C2995T位點位于自該野生型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且變異型核苷酸探針是與變異型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值61-74°C,且單核苷酸多態(tài)性C2995T位點位于自該變異型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且其中當靶核苷酸從5，端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和F1區(qū)及從3，端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時，當核苷酸引物組包括具有在3，端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5，端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3'端側與B2c區(qū)互補的序列和在5，端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物時，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表3中所示的引物組l-4;F3引物與自靶核酸的F2區(qū)5'端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合；以及B3引物與自靼核酸的B2c區(qū)3'端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合。26.根據(jù)權利要求25所述的核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.38、39或40的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.43、44或45的序列或與其互補的序列。27.根據(jù)權利要求25所述的核苷酸探針，其特征在于探針固定在支持物(l，ll)上。28.用于從擴增產(chǎn)物中檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性T3010C的基因型的核苷酸探針，所述的擴增產(chǎn)物通過使用核苷酸引物組擴增乾核苷酸而得到，所述核苷酸探針的特征在于包含選自野生型核苷酸探針和變異型核苷酸探針的核苦酸探針，其中野生型核苷酸探針是與野生型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值55-70。C，且單核苷酸多態(tài)性C3010T位點位于自該野生型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且變異型核苷酸探針是與變異型擴增產(chǎn)物互補的并具有Tm值55-71°C,且單核苷酸多態(tài)性C3010T位點位于自該變異型核苷酸探針的末端起3個或多個堿基的內側；并且其中當耙核苷酸從5，端依次具有F3區(qū)、F2區(qū)和Fl區(qū)且從3，端依次具有B3c區(qū)、B2c區(qū)和Blc區(qū)時，當核苷酸引物組包括具有在3，端側與F2區(qū)序列相同的序列和在5，端側與Fl區(qū)互補的序列的FIP引物、具有與F3區(qū)序列相同的序列的F3引物、具有在3，端側與B2c區(qū)互補的序列和在5'端側與Blc區(qū)序列相同的序列的BIP引物、以及具有與B3c區(qū)互補的序列的B3引物時，F(xiàn)IP引物和BIP引物選自表3中所示的引物組1-4;F3引物與自耙核酸的F2區(qū)5，端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合；以及B3引物與自靶核酸的B2c區(qū)3'端起60個堿基范圍內的區(qū)域結合。29.根據(jù)權利要求28所述的核苷酸探針，其特征在于野生型核苷酸探針具有SEQIDNo.48、49或50的序列或與其互補的序列，并且變異型核苷酸探針具有SEQIDNo.53、54、55或56的序列或與其互補的序列。30.根據(jù)權利要求28所述的核苷酸探針，其特征在于探針固定在支持物(l，ll)上。31.同時檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的方法，其特征在于包括步驟通過使用表2中所示的引物組2擴增靶核酸而得到擴增產(chǎn)物；通過^f吏用表3中所示的引物組3擴增耙核酸而得到擴增產(chǎn)物；將擴增產(chǎn)物混合以制備液體混合物；核苷酸探針雜交，其中所述支持物攜帶下列核苷酸探針用于C-13T的野生型核苷酸探針，其具有SEQIDNo,28的序列或與該序列互補的序列；用于C-13T的變異型核苷酸探針，其具有SEQIDNo.33的序列或與該序列互補的序列；用于C2995T的野生型核苷酸探4十，其具有SEQIDNo.38的序列或與該序列互補的序列；用于C2995T的變異型核苷酸探針，其具有SEQIDNo.43的序列或與該序列互補的序列；用于T3010C的野生型核苷酸探針，其具有SEQIDNo.50的序列或與該序列互補的序列；用于T3010C的變異型核苷酸纟笨針，其具有SEQIDNo.55的序列或與該序列互補的序列；測定與分別的核苷酸探針結合的擴增產(chǎn)物的量；酸探針分別結合的擴增產(chǎn)物的量；比較與用于C2995T的野生型核苷酸探針及與用于C2995T的變異型核苷酸探針分別結合的擴增產(chǎn)物的量；以及比較與用于T3010C的野生型核苷酸探針及與用于T3010C的變異型核苷酸探針分別結合的擴增產(chǎn)物的量。全文摘要本發(fā)明提供了用于檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的LAMP-擴增核苷酸引物組。還提供了用于檢測以本發(fā)明的引物組所擴增的擴增產(chǎn)物的核苷酸探針。還提供了通過使用本發(fā)明的引物組而檢測SAA1基因單核苷酸多態(tài)性C-13T、C2995T和T3010C的基因型的方法。文檔編號C12N15/11GK101294222SQ200810091278公開日2008年10月29日申請日期2008年4月28日優(yōu)先權日2007年4月26日發(fā)明者中村奈緒子,伊藤桂子,橋本幸二,源間信弘,高橋匡慶申請人:株式會社東芝