本發(fā)明涉及一種聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物及其制備方法，具體為一種可用于兩親性siRNA載體的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類進(jìn)入后基因組時(shí)代。RNA干擾(RNAi)技術(shù)作為一種具有革命性的基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的新技術(shù)，能快速、簡便、有效地以序列特異性方式使目的基因沉默，又由于其特有的高效性和特異性，不僅成為基因功能研究的有力工具，還為特異性基因治療提供了新的技術(shù)手段和應(yīng)用前景，并日益成為后基因組時(shí)代基因功能和調(diào)控分析的有力工具。近10年來，在腫瘤、感染和糖尿病等疾病的治療中RNAi就有可能成為一種新的治療策略。與其它藥物作用相比，基于RNAi治療策略的適用性更強(qiáng)。而siRNA(小干擾RNA)設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)RNAi的有效途徑，siRNA序列的優(yōu)劣將直接影響RNA干擾的效果。目前RNAi的作用原理已經(jīng)明晰，限制siRNA走向臨床應(yīng)用的關(guān)鍵因素是對siRNA的遞送。如何將siRNA高效遞送到特定細(xì)胞并發(fā)揮RNAi效應(yīng)，同時(shí)減少對其它細(xì)胞的影響，都是研究者們正在致力解決的重要問題。尋找或設(shè)計(jì)安全低毒的非病毒載體用于SiRNA的遞送成為RNAi治療研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種兩親性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備方法，包括，將聚乙二醇丙烯酸酯與多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺通過邁克爾加成反應(yīng)，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物；其中，所述多元胺選自下列物質(zhì)中的一種：根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，所述制備方法還包括待所述邁克爾加成反應(yīng)完成后，加入疏水的伯胺進(jìn)行端基修飾；所述疏水的伯胺選自C12～C18的脂肪胺、四苯基丁胺根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述疏水的伯胺選十二胺、十八胺或油胺。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺的摩爾比為0.1:1:2。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺、所述疏水的伯胺的摩爾比為0.1:1:2:4。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯、所述多元胺、所述N,N’-二(丙烯酰)胱胺、所述聚乙烯酰亞胺的摩爾比為0.1:1:1.2:2。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述聚乙二醇丙烯酸酯的數(shù)均分子量為250～20KDa。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述聚乙烯酰亞胺的重均分子量為600～1800。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，所述制備方法包括：55～65℃下，將N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯，以及三胺在二甲基亞砜溶劑中發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，向反應(yīng)體系加入所述疏水的伯胺或聚乙烯酰亞胺進(jìn)行端基修飾，然后在酸性溶液中透析，再用二次水透析，凍干得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。本發(fā)明還提供了一種聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，由上述任一項(xiàng)所述的方法制得。本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種兩親性siRNA載體，包括上述的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。本發(fā)明提供一種具有可降解、水溶性好和毒性低，且可用作siRNA載體的兩親性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其在作為核酸類藥物載體時(shí)，所帶的正電荷可以結(jié)合負(fù)電性siRNA。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征譜圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征譜圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征譜圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例4的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征譜圖；圖5為本發(fā)明實(shí)施例5的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的表征譜圖；圖6為本發(fā)明應(yīng)用例1的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物典型的緩沖能力測試圖；圖7為本發(fā)明應(yīng)用例2的復(fù)合物體外毒性的測試圖；圖8為本發(fā)明應(yīng)用例3的復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)解離的測試圖；圖9為本發(fā)明應(yīng)用例4的轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的共聚焦成像圖。具體實(shí)施方式體現(xiàn)本發(fā)明特征與優(yōu)點(diǎn)的典型實(shí)施方式將在以下的說明中詳細(xì)敘述。應(yīng)理解的是本發(fā)明能夠在不同的實(shí)施方式上具有各種的變化，其皆不脫離本發(fā)明的范圍，且其中的說明及圖示在本質(zhì)上是當(dāng)作說明之用，而非用以限制本發(fā)明。陽離子高分子材料在基因轉(zhuǎn)染研究領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，如殼聚糖、葡聚糖和聚普魯蘭等。這些物質(zhì)來自于自然界，因此生物相容性高；同時(shí)，它們具有的修飾位點(diǎn)多，易于功能化。本發(fā)明制備一種具有可降解、水溶液中可自組裝、水溶性好和毒性低，且可用作siRNA載體的兩親性聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其在作為核酸類藥物載體時(shí)，所帶的正電荷可以結(jié)合負(fù)電性siRNA。本發(fā)明的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(或月桂酸/聚酰胺胺共聚物)的制備方法包括，將聚乙二醇丙烯酸酯(或月桂酸丙烯酯)與多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺通過邁克爾加成反應(yīng)，制得所述聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物；所述多元胺的結(jié)構(gòu)可以為：其中，n＝2～6；R可以為下列結(jié)構(gòu)中的一種：優(yōu)選地，多元胺選自N-叔丁氧基羰基-2,2′-亞氨基二乙胺、N-(2-羥乙基)-二乙胺、或下列物質(zhì)中的一種：進(jìn)一步地，聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(或月桂酸/聚酰胺胺共聚物)的制備方法還可包括待邁克爾加成反應(yīng)完成后，加入疏水的伯胺以進(jìn)行端基修飾；疏水的伯胺R′-NH2可選自選自C12～C18的脂肪胺或四苯基丁胺優(yōu)選為十二胺(C12H25-NH2)、十八胺(C18H37-NH2)、或油胺。本發(fā)明中，聚乙二醇丙烯酸酯、多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺的摩爾比優(yōu)選為0.1:1:2；聚乙二醇丙烯酸酯、多元胺、N,N’-二(丙烯酰)胱胺及疏水的伯胺的摩爾比為0.1:1:2:4；聚乙二醇丙烯酸酯的數(shù)均分子量優(yōu)選為250～20kDa。本發(fā)明一實(shí)施方式的超支化兩親性siRNA載體聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備方法如下：以二甲基亞砜為溶劑，N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯(數(shù)均分子量為250～20kDa)在60℃下，與多元胺發(fā)生加成反應(yīng)。反應(yīng)72小時(shí)后，將溫度降至50℃，然后向反應(yīng)體系加入含過量的有疏水基團(tuán)的伯胺進(jìn)行端基修飾。然后在酸性溶液中透析3次，再用二次水透析1次，凍干得兩親性siRNA載體聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物。上述制備路線如下：第一步以N,N’-二(丙烯酰)胱胺、聚乙二醇丙烯酸酯(重均分子量為5000)和多元胺為原料，以二甲基亞砜為溶劑，在60℃溫度下攪拌聚合，歷時(shí)72小時(shí)；第二步，待停止攪拌將反應(yīng)溫度降到50℃，向反應(yīng)體系中加入十二胺或苯胺以修飾主干上的雙鍵。下面，結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備方法做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N,N-二甲基亞二丙基三胺(0.159g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反應(yīng)瓶中，加入6mL二甲基亞砜溶解，在60℃下加熱攪拌。攪拌72h后，向反應(yīng)體系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同時(shí)將反應(yīng)溫度降到50℃繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束后，用pH為1的鹽酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，凍干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁譜圖參見圖1，相關(guān)數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,24H,8CH3)；1.28(m,CH2)；2.15(s,42H,14CH2)；2.82-2.83(t)；3.50(m,CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2).Mw＝～10kDa,PDI＝1.22。實(shí)施例2聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N,N-二甲基亞二丙基三胺(0.159g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反應(yīng)瓶中，加入6mL二甲基亞砜溶解，在60℃下加熱攪拌。攪拌72h后，向反應(yīng)體系中加入4-苯基丁胺(0.596g，4mmol)，并同時(shí)將反應(yīng)溫度降到50℃繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束后，用pH為1的鹽酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，凍干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁譜圖參見圖2，相關(guān)數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(DMSO,ppm)δ＝1.28(t,8H,4CH3)；2.15(s,42H,14CH2)；2.82-2.83(t)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2)；7.15-7.25(t,20H,CH2).Mw＝～9kDa,PDI＝1.94。實(shí)施例3聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-(2-羥乙基)-乙二胺(0.118g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反應(yīng)瓶中，加入6mL二甲基亞砜溶解，在60℃下加熱攪拌。攪拌72h后，向反應(yīng)體系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同時(shí)將反應(yīng)溫度降到50℃繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束后，用pH為1的鹽酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，凍干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁譜圖參見圖3，相關(guān)數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,24H,8CH3)；1.24(m,CH2)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02ppm(t,2H,CH2).Mw＝～10kDa,PDI＝1.28。實(shí)施例4聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-(2-羥乙基)-乙二胺(0.118g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反應(yīng)瓶中，加入6mL二甲基亞砜溶解，在60℃下加熱攪拌。攪拌72h后，向反應(yīng)體系中加入4-苯基丁胺(0.596g，4mmol)，并同時(shí)將反應(yīng)溫度降到50℃繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束后，用pH為1的鹽酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，凍干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁譜圖參見圖4，相關(guān)數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(DMSO,ppm)δ＝1.38(t,8H,4CH2)；2.36(t,10H,5CH2)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02(t,2H,CH2)；7.15-7.25(t,20H,CH2).Mw＝～9kDa,PDI＝2.01。實(shí)施例5聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備取N,N’-二(丙烯酰)胱胺(0.520g，2mmol)，N-叔丁氧羰基-二亞乙基三胺(0.203g，1mmol)和聚乙二醇丙烯酸酯(Mw＝2000)(0.200g，0.1mmol)于反應(yīng)瓶中，加入6mL二甲基亞砜溶解，在60℃下加熱攪拌。攪拌72h后，向反應(yīng)體系中加入十二胺(0.736g，4mmol)，并同時(shí)將反應(yīng)溫度降到50℃繼續(xù)攪拌24h。反應(yīng)結(jié)束后，用pH為1的鹽酸溶液透析3次，后再用二次水透析一次，凍干，制得聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物，其核磁譜圖參見圖5，相關(guān)數(shù)據(jù)如下所示：1HNMR(DMSO,ppm)δ＝0.87(t,3H,CH3)；1.24(m,20H,10CH2)；1.42(s,63H,21CH3)；3.50-3.60(m,2CH2)；4.02(t,2H,CH2).Mn＝8533。在以上實(shí)施例1-5中所用來檢測各聚合物結(jié)構(gòu)儀器為瑞士布魯克拜厄斯賓有限公司生產(chǎn)的布魯克超導(dǎo)傅里葉核磁共振譜儀。實(shí)施例6羅丹明B修飾的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的制備將羅丹明B-ITC與上述的伯氨基封端的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物進(jìn)行反應(yīng)，得到羅丹明B修飾的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(Rh-rHB)。應(yīng)用例1聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物緩沖能力的測定聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的緩沖能力通過酸-堿滴定來測定。具體方法為：取含氨基總量為10mM的實(shí)施例1所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(rHB)與實(shí)施例2所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(nHB)，溶解在各10mL的水中，并用1M的HCl溶液將其pH調(diào)節(jié)到4。然后用0.1M的NaOH溶液滴定該溶液并記錄相應(yīng)的pH值，每次的滴加體積為20μL，當(dāng)pH到9終止。共聚物緩沖能力的計(jì)算方程：B＝d[OH]/dpHd[OH]為NaOH的等分試樣后的濃度差，dpH是在pH值相應(yīng)地增加。圖6所示的測定結(jié)果表明，聚合物具有良好的緩沖能力，當(dāng)pH的變化范圍為5-7.4。這個(gè)范圍正好涵蓋了細(xì)胞外環(huán)境較高的pH值和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境較低的pH值。在此測定溶液pH值所使用的儀器為上海標(biāo)儀儀器有限公司生產(chǎn)的梅特勒pH計(jì)。應(yīng)用例2聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物在體外的毒性測定共聚物的細(xì)胞毒性是評價(jià)其作為基因載體的重要參數(shù)之一。通過噻唑藍(lán)(化學(xué)名：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，簡稱：MTT)實(shí)驗(yàn)研究聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物對BEAS-2B細(xì)胞的毒性，并且以聚乙烯亞氨(bPEI，25kDa)作為對照。制備siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的復(fù)合物：首先將實(shí)施例2所得的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(rHB)均勻分散到1×PBS緩沖液中，作為原液。以后使用前輕輕混合聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物原液。然后依據(jù)氮磷比為1:0、5:1、10:1、20:1，將實(shí)驗(yàn)所用的RNA(抗血管生成素的干擾RNA)分別加入到4組聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的溶液中并漩渦10秒使之完全混合，再在室溫下孵育25分鐘，備用。PEI(25KDa)/RNA的制備方法與之類似。(氮磷比：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的總氨基與siRNA的總磷酸基團(tuán)的比)將BEAS-2B細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。用新鮮的培養(yǎng)基換掉原培養(yǎng)基，并加入siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物復(fù)合物(w/w50)和TransIT-TKO以每孔20nMsiRNA的濃度，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后更換新鮮的培養(yǎng)基。經(jīng)過24h孵育，用含有MTT的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育3h，然后在490nm波長下，測定其吸收強(qiáng)度，并繪制圖表。如圖7所示，其中每組測試自左向右依次表示24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的狀態(tài)，圖7的結(jié)果顯示單純的共聚物與PEI均具有較高的細(xì)胞毒性，這是因?yàn)樗麄兙哂休^強(qiáng)的正電荷。然而當(dāng)共聚物與siRNA團(tuán)聚成復(fù)合物后，其毒性明顯下降，這是由于中和了正電荷并且形成了納米級的顆粒。正如預(yù)期的那樣，所有由還原的聚合物和siRNA形成的復(fù)合物顯示比bPEI與siRNA形成復(fù)合物較低的細(xì)胞毒性。隨著氮磷比從5增加到20，還原性復(fù)合物的細(xì)胞毒性顯得微不足道。所有的還原性復(fù)合物表現(xiàn)出的具有極小的毒性在預(yù)定的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在此測定MTT熒光強(qiáng)度所使用的儀器為美國PerkinElmer公司生產(chǎn)的多功能酶標(biāo)儀。應(yīng)用例3聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物與siRNA復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)解離的測定為進(jìn)一步研究復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的降解，我們選用羅丹明B與CFP分別標(biāo)記的聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物與siRNA，然后通過共聚焦顯微鏡觀察。將BEAS-2B細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的密度接種于12孔板，然后在37℃下培養(yǎng)過夜。隨后用含有siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物復(fù)合物的完全培養(yǎng)基替換12孔板中的原有培養(yǎng)基，隨后在37℃下分別孵育1小時(shí)和24小時(shí)。孵育完成后將12孔板中的培養(yǎng)基棄掉，用PBS洗滌細(xì)胞，再用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色，然后用PBS洗滌細(xì)胞，立刻用共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。如圖8所示，在1小時(shí)和24小時(shí)的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在復(fù)合圖片中均可以清楚的觀察到分布在BEAS-2B細(xì)胞內(nèi)外的黃色的熒光點(diǎn)，這是由紅色熒光與綠色熒光重合引起的。相比于經(jīng)復(fù)合物處理1小時(shí)細(xì)胞，經(jīng)復(fù)合物處理過24小時(shí)的細(xì)胞有更多的紅色熒光點(diǎn)聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這說明更多的siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物復(fù)合物被細(xì)胞攝取。經(jīng)過復(fù)合物處理過24小時(shí)的細(xì)胞，可以看到更多的紅色熒光散射點(diǎn)后細(xì)胞內(nèi)的，這是因?yàn)榫酆衔锏慕到獠⒘_丹明片段釋放所引起的。與此同時(shí)，綠色熒光的強(qiáng)度顯著放大，可能還原觸發(fā)誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)siRNA的釋放。因此，釋放出siRNA分布到整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。此外，細(xì)胞的形態(tài)保持完全類似的在治療全過程，這進(jìn)一步驗(yàn)證了siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物復(fù)合物具有較低的毒性對于BEAS-2B細(xì)胞。此處用于測定各物質(zhì)熒光信號的儀器為激光共聚焦(confocal)顯微鏡細(xì)胞實(shí)時(shí)成像系統(tǒng),(尼康熒光顯微鏡+UltraVIEWVoX共聚焦單元)。應(yīng)用例4siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的復(fù)合物對CEM細(xì)胞的轉(zhuǎn)染的測定制備siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物復(fù)合物：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物(實(shí)施例1所得)被重新分散到1×PBS的PBS緩沖液中作為轉(zhuǎn)染原液。使用前輕輕混合聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物原液，后將聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物與OptiMEM混合10秒鐘為一個(gè)旋渦，并且在室溫下孵育10分鐘。然后將Cy3標(biāo)記的siRNA(Cy3+siRNA)加到聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的混合溶液中并漩渦10秒使之混合均勻，再在室溫下孵育25分鐘。然后將siRNA/聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的復(fù)合物(100uL)加到每一孔中含有300uL細(xì)胞完全培養(yǎng)基。然后通過前后輕輕的搖晃瓶中混合。(氮磷比：聚乙二醇/聚酰胺胺共聚物的總氨基與siRNA的總磷酸基團(tuán)的比；Cy3：一種橙紅色的熒光染料)將CEM細(xì)胞以每孔4×105的密度種于24孔板中，加300uL完全培養(yǎng)基。隨后分別向每孔加入100uL復(fù)合物溶液，在不需要更換培養(yǎng)基的情況下于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。然后收集細(xì)胞，并用1×PBS緩沖液清洗。然后將細(xì)胞重新分散到PBS緩沖液中，用FACS分析。轉(zhuǎn)染效率細(xì)胞活性Cy3(+)(％)DAPI(-)(％)僅CEM細(xì)胞0.096.61僅Cy3-siRNA(50nM)14.098.42僅共聚物(氮磷比為20)0.099.13共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比為5)34.898.80共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比為10)17.998.20共聚物+Cy3-siRNA(氮磷比為20)68.499.14經(jīng)過48小時(shí)的轉(zhuǎn)染，我們清楚的觀察到復(fù)合物(氮磷比為20)表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效率(＞60％)，且此條件下觀察不到明顯的細(xì)胞毒性。(<2％死細(xì)胞)。此處用測定各物質(zhì)熒光信號的儀器為激光共聚焦(confocal)顯微鏡細(xì)胞實(shí)時(shí)成像系統(tǒng),(尼康熒光顯微鏡+UltraVIEWVoX共聚焦單元)。除非特別限定，本發(fā)明所用術(shù)語均為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。本發(fā)明所描述的實(shí)施方式僅出于示例性目的，并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明的范圍內(nèi)作出各種其他替換、改變和改進(jìn)，因而，本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，而僅由權(quán)利要求限定。當(dāng)前第1頁1 2 3