本發(fā)明屬于中藥有效成分的高效制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種亞臨界水轉(zhuǎn)化結(jié)合區(qū)帶逆流色譜分離的丹酚酸A制備方法。

背景技術(shù)：

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰等功效。用于胸痹心痛，脘腹脅痛，癥瘕積聚，熱痹疼痛，心煩不眠，月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，瘡瘍腫痛等癥。近些年來，研究發(fā)現(xiàn)丹參具有擴(kuò)張冠脈，抗血小板聚集，改善血液循環(huán)，防止血栓形成及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，促進(jìn)病理變化恢復(fù)等功效，而被廣泛的應(yīng)用于質(zhì)量心腦血管等缺血性疾病。目前丹參已成為我國用量最大、銷售額最高、制劑生產(chǎn)廠家最多的中藥，臨床使用的丹參制劑主要包括：復(fù)方丹參滴丸、復(fù)方丹參注射液、復(fù)方丹參片、丹參多酚酸鹽注射劑等。丹參中化學(xué)成分主要分為兩大類：水溶性成分，即酚酸類化合物；脂溶性成分，即二萜醌類化合物。60年代末至今，研究人員對(duì)丹參水溶性成分進(jìn)行了深入研究，證明其主要有效成分是酚酸類化合物。最早報(bào)道的丹參水溶性成分為原兒茶醛，后來報(bào)道丹參素是各種丹酚酸化合物的基本結(jié)構(gòu)。之后分離得到一系列丹酚酸類化合物，如丹酚酸A～K、迷迭香酸、紫草酸等，它們都具有抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基作用，其中丹酚酸A(Salvianolic acid A)活性最強(qiáng)。

現(xiàn)有關(guān)于丹酚酸A的制備方法有直接制備法和間接轉(zhuǎn)化法。直接制備法分為兩種，一種為直接合成法(如專利CN201410216134.7)，采用丹酚酸A合成前體經(jīng)過脫甲基反應(yīng)制備丹酚酸A，再經(jīng)制備型HPLC純化，純度可提高到97％；一種為直接分離法，(如專利CN201010541651.3)，以丹參藥材為原料，經(jīng)提取、粗分、脫色、純化等方法，得到高純度丹酚酸A單體。間接轉(zhuǎn)化法(如專利CN201310487751.6)為將丹參或者丹酚酸B經(jīng)加熱，調(diào)酸堿反應(yīng)若干小時(shí)，將丹酚酸B轉(zhuǎn)化為丹酚酸A，再經(jīng)制備分離得到高純度丹酚酸A。直接制備法和間接轉(zhuǎn)化法都存在著制備效率低，轉(zhuǎn)化速度慢等缺點(diǎn)，同時(shí)得到富含丹酚酸A的組分需結(jié)合聚酰胺色譜、大孔樹脂、硅膠柱色譜及制備型液相色譜進(jìn)行分離，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境、樣品純度低，而且反復(fù)柱層析對(duì)樣品有不可逆性吸附作用，分離得到丹酚酸A單體制備效率低、成本較高，難以發(fā)展成為制備量大的分離技術(shù)。

將水加熱至沸點(diǎn)以上，臨界點(diǎn)以下，并控制系統(tǒng)壓力使水保持為液態(tài)，這種狀態(tài)的水被稱為亞臨界水。通常條件下，水是極性化合物，在505kPa壓力下，隨溫度升高(50～300℃)，其介電常數(shù)由70減小至1，也就是說其性質(zhì)由強(qiáng)極性漸變?yōu)榉菢O性，可將溶質(zhì)按極性由高到低萃取出來。在溫度和壓力都較高的條件下、水的極性降低，可以萃取非極性化合物；溫度和壓力都較低的條件下，水的極性提高，可以萃取極性化合物。由于是不使用酸、堿和催化劑的水在高熱高壓下的處理技術(shù)，因此亞臨界水的提取方法被稱之為“綠色的處理法”。此外，提取可以在數(shù)秒鐘到數(shù)分鐘的短時(shí)間內(nèi)完成，具有可以進(jìn)行連續(xù)處理的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)亞臨界水具有“強(qiáng)烈的溶解有機(jī)物在水中”和“強(qiáng)烈的分解力”等同普通水不同的性質(zhì)。利用這一性質(zhì)，亞臨界水被利用來提取有用成分(包括提取隨著分解反應(yīng)產(chǎn)生的分解物)。亞臨界水解技術(shù)是近年來天然產(chǎn)物提取和轉(zhuǎn)化研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。其用于天然產(chǎn)物提取轉(zhuǎn)化具有反應(yīng)速率快、無溶劑污染、前期和后處理步驟簡單、收率高、能耗低等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

高速逆流色譜(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是近30年發(fā)展起來的一種連續(xù)的無需任何固體支持物的高效、快速的液液分配色譜分離技術(shù)，它避免了固態(tài)支持體或載體帶來的樣品易被死吸附、損耗和變性等各種問題。pH-區(qū)帶精制逆流色譜(pH-Zone-Refining Countercurrent Chromatography)則是在普通的高速逆流色譜儀器的基礎(chǔ)上，通過對(duì)分離樣品所用的溶劑系統(tǒng)的組成的調(diào)配，采用化學(xué)的手段，使樣品組分的色譜分離過程增添了按pH區(qū)帶聚集的特征，同時(shí)，使組分的洗脫過程表現(xiàn)為類似置換(頂替)色譜(Displacement Chromatography)的洗脫過程，因此，它的色譜圖不再是高斯分布的色譜峰形系列，而成為按pH值的大小排列的邊界陡削的矩形區(qū)帶系列，其結(jié)果是能把相同容積的逆流色譜儀器的分離制備量提高數(shù)倍乃至十倍。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種亞臨界水轉(zhuǎn)化結(jié)合區(qū)帶逆流色譜分離的丹酚酸A制備方法。

一種亞臨界水轉(zhuǎn)化結(jié)合區(qū)帶逆流色譜分離的丹酚酸A制備方法，步驟如下：

(1)丹酚酸粗提物的制備：取丹參藥材，粉碎(優(yōu)選：40-60目)，加入有機(jī)溶劑(優(yōu)選氯仿、四氯化碳或二氯甲烷，更優(yōu)選：二氯甲烷)，浸泡(優(yōu)選：過夜)，過濾，殘?jiān)栏?，?0-70(優(yōu)選65％)(V/V)乙醇萃取回流1-2(優(yōu)選1.5)小時(shí)，冷卻過濾，洗滌(優(yōu)選用60-70％的乙醇，更優(yōu)選用65％的乙醇)，合并洗滌液與濾液，去除乙醇(優(yōu)選：減壓旋蒸)，調(diào)節(jié)pH為2.05-2.10(優(yōu)選：以2M鹽酸調(diào)pH至2.0，目的除去酸不溶的成分，優(yōu)點(diǎn)可以提高目標(biāo)化合物的純度)，冷藏沉降過夜，取上清液過大孔樹脂富集，以水洗滌至洗出液變清，再以45-55％(優(yōu)選：50％)的乙醇洗脫，合并流出液，減壓旋蒸，冷凍干燥，得丹酚酸粗提物；

(2)丹酚酸A粗品制備：將丹酚酸粗提物用pH為3.5-4.5(優(yōu)選4.0)的NaOH或NaHCO₃(NaHCO₃堿性較弱，反應(yīng)較溫和)水配制成35-45mg/mL(優(yōu)選40mg/mL)的溶液，取調(diào)節(jié)pH值后的丹酚酸粗提物溶液置于亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達(dá)到170-190℃(優(yōu)選：180℃)并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，50min-70min(優(yōu)選：60min)后迅速取出反應(yīng)器并放入冰水浴或冷水沖涼(優(yōu)點(diǎn)快速降溫，防止在冷卻的過程中繼續(xù)反應(yīng))中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品；

(3)應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A：溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯：水＝1:1，上相加10mM三氟乙酸為固定相，下相為10mM NaOH為流動(dòng)相，高速逆流色譜儀柱體積為200-400(優(yōu)選300)mL，上樣量1.1-1.2g(優(yōu)選：1.1g)，轉(zhuǎn)速600-1000rpm(優(yōu)選：800rpm)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速1-4mL/min(優(yōu)選：2.0mL/min)，固定相保留率59％，檢測波長280nm。

一種具有擴(kuò)張冠脈、抗血小板聚集、改善血液循環(huán)、防止血栓形成、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成、促進(jìn)病理變化恢復(fù)的藥物的制備方法，具有上述亞臨界水轉(zhuǎn)化結(jié)合區(qū)帶逆流色譜分離的丹酚酸A制備方法的步驟。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明的方法包括協(xié)同配合的三步組成，首先從丹參中提取得到丹酚酸粗提物，然后利用超臨界水轉(zhuǎn)化制備丹酚酸A粗品，最后經(jīng)過高速逆流色譜分離純化丹酚酸A。本發(fā)明的制備方法，成本低于現(xiàn)有技術(shù)，操作簡便，效率高，可以較大批量將丹酚酸粗提物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，分離制備出純度大于98％的丹酚酸A單體化合物。

2、目前有使用亞臨界水提取中藥丹參中脂溶性成分的方法等，但是這些方法都是利用了亞臨界水在溫度和壓力都較高的條件下、水的極性降低，萃取非極性化合物的作用，而本發(fā)明充分利用亞臨界水對(duì)丹參中水溶性成分溶解度高，不僅可用于相關(guān)成分的提取，同時(shí)還可利用高溫高壓的特點(diǎn)，將丹酚酸粗提物中的丹酚酸B轉(zhuǎn)化為生物活性更高的丹酚酸A。本發(fā)明應(yīng)有亞臨界水轉(zhuǎn)化丹酚酸B為丹酚酸A。

3、丹酚酸粗提物的制備過程中，將去除丹參酮部分的殘?jiān)泽w積分?jǐn)?shù)為60-70％(優(yōu)選65％)乙醇萃取回流1-2(優(yōu)選1.5)小時(shí)，可得到不含丹參酮類成分的丹酚酸粗提物，提高了提取物中丹酚酸類物質(zhì)的含量，有利于在亞臨界水的條件下轉(zhuǎn)化為丹酚酸A，為區(qū)帶逆流色譜分離提供條件。

4、將丹酚酸粗提物用pH為4.0的NaHCO₃水配制成40mg/mL的溶液，目的：經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明，在丹酚酸粗提物中加入酸或堿，均可加速丹酚酸的轉(zhuǎn)化速率，但是只有在pH為4.0左右的時(shí)候，最有利于丹酚酸向丹酚酸A方向轉(zhuǎn)化，丹酚酸A的產(chǎn)量最高。優(yōu)點(diǎn)：既可以提高丹酚酸A的產(chǎn)量，又可加快丹酚酸轉(zhuǎn)化為丹酚酸A的速度。

5、加熱爐達(dá)到180℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，60min后的目的：加熱爐反應(yīng)前達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，有利于對(duì)整個(gè)反應(yīng)在時(shí)間和溫度上進(jìn)行把控，使反應(yīng)的重現(xiàn)性得到提高。優(yōu)點(diǎn)：節(jié)能高效、轉(zhuǎn)化完全。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的工藝流程圖；

圖2為實(shí)施例1富含丹酚酸A粗品分離的區(qū)帶逆流色譜圖，a：丹參素；b：丹酚酸D；c：丹酚酸A；d：原兒茶醛；

圖3為實(shí)施例1丹酚酸粗提物的高效液相色譜圖；

圖4為實(shí)施例1富含丹酚酸A粗品的高效液相色譜圖；

圖5為實(shí)施例1丹參素單體的高效液相色譜圖；

圖6為實(shí)施例1迷迭香酸單體的高效液相色譜圖；

圖7為實(shí)施例1丹酚酸A單體的高效液相色譜圖；

圖8為實(shí)施例1原兒茶醛單體的高效液相色譜圖；

圖9為對(duì)比例1的的區(qū)帶逆流色譜圖；

圖10為對(duì)比例2的的區(qū)帶逆流色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖與實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：

如圖1丹酚酸A單體制備流程圖所示。

取丹參藥材，粉碎至40-60目，加入二氯甲烷，浸泡過夜，過濾，去除丹參酮部分。殘?jiān)栏?。?5％(V/V)乙醇萃取回流1.5小時(shí)，冷卻過濾，以65％乙醇洗滌，合并洗滌液與濾液，減壓旋蒸去除乙醇，以2M鹽酸調(diào)pH至2.08，冷藏沉降過夜，取上清液過大孔樹脂D101，以純水洗滌至洗出液變清，再以50％的乙醇洗脫，以三氯化鐵溶液監(jiān)測，至丹酚酸流出，開始接受，至無丹酚酸流出。合并流出液，減壓旋蒸，冷凍干燥，得丹酚酸粗提物(圖3)。

將丹酚酸粗提物用pH為4.0的NaHCO₃水配制成40mg/mL的溶液，取40mL上述溶液置于50mL亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達(dá)到180℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，開始計(jì)時(shí)。60min后迅速取出反應(yīng)器并放入冰水浴中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品(圖4)。

應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A

溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯：水＝1:1，上相加10Mm三氟乙酸為固定相，下相為10Mm NaOH為流動(dòng)相，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量1.1g，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0mL/min，固定相保留率59％，檢測波長280nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開，上相加10Mm三氟乙酸為固定相，下相為10Mm NaOH為流動(dòng)相，取1.1g富含丹酚酸A粗品，溶解于5mL加10Mm三氟乙酸的上相和5mL不加NaOH的下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800rpm時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為2.0mL/min，開始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖(圖2)接收目標(biāo)成分，得丹參素(23.3mg，圖5)，迷迭香酸(16.4mg，圖6)，丹酚酸A(177.1mg，圖7)和原兒茶醛(19.8mg，圖8)，HPLC分析純度均為98％以上。

利用高效液相色譜分析分離物，液相條件：Kromasil 100-5C₁₈柱(4.6×250mm)，紫外檢測波長286nm，柱溫：25℃，流速：1.0mL/min，進(jìn)樣量：10μL，流動(dòng)相采用乙腈(A)和0.2％甲酸水溶液(B)梯度洗脫，梯度條件如下：0-9min，10％-22％A；9-19min，22％-24％A；19-35min，24％A；35-43min，24％-36％A；43-48min，36％-100％A；48-50min，100％A。

結(jié)構(gòu)鑒定：對(duì)分離得到的生物堿應(yīng)用Agilent 5973N質(zhì)譜儀和Varian 600MHz核磁共振波譜儀分別進(jìn)行MS，¹HNMR譜的測定，所得數(shù)據(jù)如下：

丹參素：ESI-MS,m/z197[M-H]^-,395[2M-H]^-,135[M-H-H₂O-CO₂]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:2.51(1H,dd,J＝5.6,9.2Hz,H-7),2.85(1H,dd,J＝2.4,9.2Hz,H-7),3.90(1H,dd,J＝2.5,5.6Hz,H-8),6.45(1H,dd,J＝1.3,5.3Hz,H-6),6.61(1H,d,J＝5.3Hz,H-5),6.65(1H,s,H-2).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:49.1(C-7),72.6(C-8),115.7(C-5),117.5(C-2),120.5(C-6),130.5(C-1),143.9(C-3),145.2(C-4),177.1(C-9).

迷迭香酸：ESI-MS,m/z 361[M+H]⁺.¹H-NMR(CD₃OD,600MHz)δ:6.30(1H,d,J＝15.6Hz,H-8),6.89(1H,dd,J＝1.8,8.7Hz,H-5),7.09(1H,d,J＝1.8Hz,H-2),7.66(1H,d,J＝15.6Hz,H-7),2.93～3.09(2H,m,H-7′),5.12(1H,s,H-8′),6.60(1H,d,J＝8.1Hz,H-6′),6.69(1H,d,J＝7.9Hz,H-5′),6.77～6.89(2H,m,H-6,H-2′).

丹酚酸A：ESI-MS,m/z494[M-H]^-,295[M-H-C₉H₁₀O₅]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:2.75(1H,dd,J＝14.3,8.5Hz,H-7′),2.98(1H,dd,J＝14.4/4.5Hz,H-7′),4.90(1H,dd,J＝8.5,6.0Hz,H-8′),6.26(1H,d,J＝16.0Hz,H-8),6.45(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6″),6.54(1H,d,J＝8.5Hz,H-5′),6.53(1H,d,J＝16.0Hz,H-7″),6.63(1H,d,J＝2.0Hz,H-2′),6.72(1H,d,J＝8.7Hz,H-5),7.12(1H,d,J＝8.6Hz,H-6),6.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-5″),6.86(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6″),7.04(1H,d,J＝2.0Hz,H-2″),7.13(1H,d,J＝16.0Hz,H-8″).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:36.8(C-7′),75.0(C-8′),112.8(C-2″),114.3(C-5),115.3(C-8),115.7(C-5′),116.4(C-5″),118.6(C-2′),119.0(C-8″),119.1(C-6),119.8(C-6″),123.7(C-6′),126.5(C-1),129.0(C-2),134.2(C-1′),135.3(C-3),143.6(C-7″),144.8(C-1″),145.6(C-4′),145.6(C-3′),145.6(C-3″),145.7(C-4″),147.1(C-7),148.4(C-4),166.2(C-9),171.8(C-9′)..

原兒茶醛：ESI-MS,m/z137[M-H]^-,109[M-H-CO]^-.¹H-NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ:9.69(1H,s,H-7),7.27(1H,dd,J＝1.3/5.4Hz,H-6),7.23(1H,d,J＝1.2Hz,H-2),6.89(1H,d,J＝5.4Hz,H-5).¹³C-NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ:114.7(C-5),115.9(C-2),125.1(C-6),129.1(C-1),146.4(C-3),153.0(C-4),191.3(-CHO).

實(shí)施例2

取丹參藥材，粉碎至40-60目，加入氯仿，浸泡過夜，過濾，去除丹參酮部分。殘?jiān)栏?。?5％(V/V)乙醇萃取回流1.5小時(shí)，冷卻過濾，以65％乙醇洗滌，合并洗滌液與濾液，減壓旋蒸去除乙醇，以2M鹽酸調(diào)pH至2.0，冷藏沉降過夜，取上清液過大孔樹脂D101，以純水洗滌至洗出液變清，再以50％的乙醇洗脫，以三氯化鐵溶液監(jiān)測，至丹酚酸流出，開始接受，至無丹酚酸流出。合并流出液，減壓旋蒸，冷凍干燥，得丹酚酸粗提物。

將丹酚酸粗提物用pH為4.0的NaHCO₃水配制成43mg/mL的溶液，取40mL上述溶液置于50mL亞臨界水不銹鋼反應(yīng)釜中，加熱爐達(dá)到185℃并穩(wěn)定后，將反應(yīng)釜放入加熱爐，開始計(jì)時(shí)。56min后迅速取出反應(yīng)器并放入冰水浴中冷卻，將液體取出，冷凍干燥，得富含丹酚酸A粗品。

應(yīng)用高速逆流色譜分離純化丹酚酸A

溶劑系統(tǒng)為乙酸乙酯：水＝1:1，上相加10Mm三氟乙酸為固定相，下相為10Mm NaOH為流動(dòng)相，高速逆流色譜儀柱體積為300mL，上樣量1.1g，轉(zhuǎn)速820rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0mL/min，固定相保留率57％，檢測波長280nm。

具體的操作步驟是：按上述溶劑比例配制溶劑系統(tǒng)，置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層，待平衡一段時(shí)間后將上下兩相分開，上相加10Mm三氟乙酸為固定相，下相為10Mm NaOH為流動(dòng)相，取1.1g富含丹酚酸A粗品，溶解于5mL加10Mm三氟乙酸的上相和5mL不加NaOH的下相中待用。采用上海同田公司研制的半制備型高速逆流色譜儀，它是由柱塞泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測儀、記錄儀和色譜分離柱(由聚四氟乙烯管多層纏繞形成的螺旋管柱，容量為300mL)等組成，首先使進(jìn)樣閥處于進(jìn)樣狀態(tài)，將固定相用泵以一定流速灌滿色譜分離柱，停泵。開啟速度控制器，使高速流色譜儀的色譜分離柱正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速達(dá)800rpm時(shí)，將溶解好的樣品用注射器注入逆流色譜儀進(jìn)樣閥的貯液管中，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣閥為接柱狀態(tài)，使樣品進(jìn)入色譜分離柱。設(shè)置流動(dòng)相流速為2.0mL/min，開始泵流動(dòng)相，然后根據(jù)檢測器紫外光譜圖接收目標(biāo)成分，得丹參素(22.0mg)，迷迭香酸(15.5mg)，丹酚酸A(176.1mg)和原兒茶醛(17.6mg)，HPLC分析純度均為98％以上。

對(duì)比例1

條件：石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-水(5:5:0.8:9.2)，上相10mM三氟乙酸，下相10mM氨水，流速：2mL.min^-1，進(jìn)樣量：950mg，固定相保留：53％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：洗脫太快，化合物未得到分離，如附圖9。

對(duì)比例2

條件：乙酸乙酯-水(1:1)，上相10mM三氟乙酸，下相10mM氨水，流速：2mL.min^-1，進(jìn)樣量：1.2mg，固定相保留：49％，轉(zhuǎn)速：800rpm，其他條件與操作都與實(shí)施例1中的一樣。分離結(jié)果：化合物得到了分離，但是分離時(shí)間太慢，洗脫時(shí)間太長，分離效率過低，如附圖10。

由圖9和圖10可以看出，對(duì)比例1與實(shí)施例1相比溶劑系統(tǒng)不同，導(dǎo)致洗脫太快，化合物未得到分離，對(duì)比例2僅僅將下相為10Mm NaOH為流動(dòng)相換成下相10mM氨水，雖然化合物得到了分離，但是分離時(shí)間太慢，洗脫時(shí)間太長，分離效率過低。

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。