本發(fā)明涉及卡那霉素抗體制備領(lǐng)域，具體涉及一種卡那霉素抗體及制備工藝。

背景技術(shù)：

近年來，隨著抗生素等獸藥添加劑在農(nóng)牧業(yè)領(lǐng)域里的應(yīng)用不斷擴(kuò)張，抗生素污染問題、獸藥殘留問題已日益嚴(yán)重。抗生素等獸藥半衰期長、自然條件下很難被分解，對環(huán)境危害巨大。如果不加控制的作為動(dòng)物食品添加劑，抗生素在動(dòng)物源性食品中會形成一定的殘留，如果人類長期服用此類含有抗生素殘留的食品，將對健康造成嚴(yán)重威脅。

細(xì)菌的耐藥性指的是細(xì)菌與某種藥物多次接觸后，對該藥物的敏感性下降甚至對其敏感性消失的現(xiàn)象。如果細(xì)菌長期接觸這些殘留的低濃度藥物，就會使其產(chǎn)生一定的耐藥性，而且細(xì)菌的耐藥性可以通過動(dòng)物群中的細(xì)菌、人群中的細(xì)菌與生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌互相傳遞，可能會達(dá)到無法操控的規(guī)模。細(xì)菌耐藥性這一現(xiàn)象的危害不容忽視，它不僅能使得抗生素的療效在一定程度上減弱或失效；更嚴(yán)峻的是，由于其療效減弱，導(dǎo)致生產(chǎn)者增加投藥劑量，勢必造成藥物殘留量的增加，由此形成一個(gè)惡性循環(huán)，加重耐藥菌的普遍化。由此將導(dǎo)致嚴(yán)峻的人類環(huán)境問題及公共衛(wèi)生問題。

氨基糖苷類抗生素能有效抑制細(xì)菌生長，它主要作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體30s亞基發(fā)生集聚反應(yīng)，從而抑制細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、阻礙已合成蛋白的釋放。具體過程為：氨基糖苷類抗生素通過細(xì)胞外膜的孔蛋白，然后經(jīng)Ⅰ期轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)攝入細(xì)胞內(nèi)，此過程為能量依賴過程，受鈣離子、鎂離子等離子及高滲、低氧和酸堿性等因素的影響，可被此類因素阻斷。當(dāng)氨基糖苷類抗生素與細(xì)胞核糖體的30S亞基發(fā)生積聚時(shí)，可引起Ⅱ期轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)參與，此過程可導(dǎo)致大量氨基糖苷類抗生素在細(xì)胞內(nèi)迅速積聚，阻斷正常的肽鏈延長過程，造成遺傳密碼mRNA的錯(cuò)誤解讀，從而阻礙正常蛋白質(zhì)的合成。這些非正常蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞膜，可引起細(xì)胞膜斷裂，致使胞內(nèi)的核苷酸、鉀離子、腺嘌呤等參與生命活動(dòng)的重要物質(zhì)外漏，從而直接導(dǎo)致細(xì)菌死亡。氨基糖苷類抗生素對革蘭氏陰性細(xì)菌的抑制效果良好，但對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑制效果較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種卡那霉素抗體及制備工藝，利用分子的官能團(tuán)等功能基團(tuán)，并添加一些偶聯(lián)試劑，產(chǎn)生一定的化學(xué)反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)半抗原與載體分子偶聯(lián)，可以有效解決背景技術(shù)中的問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種卡那霉素抗體及制備工藝，按照重量份數(shù)由如下原料組成：

硫酸卡那霉素58-80份、牛血清白蛋白5-25份、卵清白蛋白3-5份、弗氏完全佐劑3-5份、弗氏不完全佐劑3-5份、碳二亞胺3-5份、戊二醛1-2份、羊抗鼠酶標(biāo)二抗1-3份、磷酸氫二鈉2-3份、醋酸鈉8-10份、十二烷基磺酸鈉15-20份、考馬斯亮藍(lán)R-250 10-15份、過氧化脲8-12份、乙醇6-11份、甲醛5-7份、硼氫化鈉8-13份、甲醇1-3份、濃硫酸1-3份、磷酸鹽緩沖液1-3份、包被用碳酸鹽緩沖液CBS1-3份、洗滌液PBST 1-3份、封閉液5%豬血清1-3份，ELISA試驗(yàn)顯色液1-3份、ELISA試驗(yàn)終止液1-3份。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述ELISA試驗(yàn)顯色液必須現(xiàn)用現(xiàn)配，由兩種試劑（試劑一、試劑二）等體積混合而成，試劑一：取150mL0.1mol的檸檬酸與850mL等摩爾濃度的醋酸鈉混合，在此混合液中加入0.5g的過氧化脲，充分溶解后再在混合液中加入0.08g非那西汀，混勻，于4℃保存；準(zhǔn)確稱取1.27g四甲基聯(lián)苯胺，加熱攪拌使其充分溶于甲醇溶液中，再將混合液加入500mL甘油中，充分混合4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述ELISA試驗(yàn)終止液配置：取約43mL濃硫酸，緩慢加入356.5mL去離子水中邊加邊攪拌，制成2mol/L的硫酸溶液，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述封閉液5%豬血清在4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述乙醇的純度為30%。

另外本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一種卡那霉素抗體的制備工藝，包括如下步驟：

（1）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白20mg，碳二亞胺55mg，使之充分溶解于2mL0.01M的PBS中，得到反應(yīng)液為A液；

（2）按配方進(jìn)行配料，準(zhǔn)確稱取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，加入1.5mL0.01M的PBS中，邊加邊攪拌，使之充分溶解后所得溶液稱為B液；

（3）將上述B液逐滴加入A液中（邊加入邊攪拌），密封，避光，在4℃下攪拌過夜；

（4）待上述反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中，在4℃環(huán)境下用0.01M的PBS透析3天。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述步驟（1）中，反應(yīng)液在0.01M的PBS中在4℃環(huán)境下避光攪拌反應(yīng)6h。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述步驟（4）中，反應(yīng)液的透析分為恒溫透析、換液透析和降溫透析。

根據(jù)上述技術(shù)方案，所述恒溫透析是將溫度調(diào)至4℃，并保持恒定；所述換液透析是指透析液需要每間隔一定的時(shí)間進(jìn)行換液，在透析第一天每3h換液一次，以后每8-10h換液一次；所述降溫透析是指在透析完成后，將偶聯(lián)產(chǎn)物分裝于1.5ml離心管中，將溫度降至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以硫酸卡那霉素和牛血清白蛋為主要原料，加入一定量的碳二亞胺、醋酸鈉、包被用碳酸鹽緩沖液CBS，采用偶聯(lián)方法制備出可以與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合包被的抗體，整個(gè)反應(yīng)過程具有簡單、高效、經(jīng)濟(jì)、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明抗卡那霉素多抗血清稀釋倍數(shù)與ELISA測定多抗血清敏感性的關(guān)系圖。

圖2為本發(fā)明KAN標(biāo)準(zhǔn)品濃度與ELISA測定多抗血清敏感性關(guān)系圖。

圖3為本發(fā)明ELISA測定多抗血清敏感性的關(guān)系曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

一種卡那霉素抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制備而成：

硫酸卡那霉素58份、牛血清白蛋白5份、卵清白蛋白3份、弗氏完全佐劑3份、弗氏不完全佐劑3份、碳二亞胺3份、戊二醛1份、羊抗鼠酶標(biāo)二抗1份、磷酸氫二鈉2份、醋酸鈉8份、十二烷基磺酸鈉15份、考馬斯亮藍(lán)R-250 10份、過氧化脲8份、乙醇6份、甲醛5份、硼氫化鈉8份、甲醇1份、濃硫酸1份、磷酸鹽緩沖液2份、包被用碳酸鹽緩沖液CBS 1份、洗滌液PBST 1份、封閉液5%豬血清1份，ELISA試驗(yàn)顯色液1份、ELISA試驗(yàn)終止液2份。

所述ELISA試驗(yàn)顯色液選用0.25毫升；所述ELISA試驗(yàn)終止液選用0.5毫升；所述封閉液5%豬血清在4℃條件下保存?zhèn)溆?；所述乙醇的純度?0%。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白20mg，碳二亞胺55mg，使之充分溶解于2mL0.01M的PBS中，得到反應(yīng)液為A液；

（2）按配方進(jìn)行配料，準(zhǔn)確稱取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，加入1.5mL0.01M的PBS中，邊加邊攪拌，使之充分溶解后所得溶液稱為B液；

（3）將上述B液逐滴加入A液中（邊加入邊攪拌），密封，避光，在4℃下攪拌過夜，反應(yīng)液在0.01M的PBS中在4℃環(huán)境下避光攪拌反應(yīng)6h；

（4）待上述反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中，在4℃環(huán)境下用0.01M的PBS透析3天；反應(yīng)液的透析分為恒溫透析、換液透析、和降溫透析；所述恒溫透析是將溫度調(diào)至4℃，并保持恒定；所述換液透析是指透析液需要每間隔一定的時(shí)間進(jìn)行換液，在透析第一天每3h換液一次，以后每8-10h換液一次；所述降溫透析是指在透析完成后，將偶聯(lián)產(chǎn)物分裝于1.5ml離心管中，將溫度降至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：

一種卡那霉素抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制備而成：

硫酸卡那霉素69份、牛血清白蛋白15份、卵清白蛋白4份、弗氏完全佐劑4份、弗氏不完全佐劑4份、碳二亞胺4份、戊二醛1.5份、羊抗鼠酶標(biāo)二抗2份、磷酸氫二鈉2.5份、醋酸鈉9份、十二烷基磺酸鈉17.5份、考馬斯亮藍(lán)R-250 12.5份、過氧化脲10份、乙醇8.5份、甲醛6份、硼氫化鈉10.5份、甲醇2份、濃硫酸2份、磷酸鹽緩沖液1份、包被用碳酸鹽緩沖液CBS 1份、洗滌液PBST1份、封閉液5%豬血清1份，ELISA試驗(yàn)顯色液1份、ELISA試驗(yàn)終止液1份。

所述ELISA試驗(yàn)顯色液選用0.25毫升；所述ELISA試驗(yàn)終止液選用0.5毫升；所述封閉液5%豬血清在4℃條件下保存?zhèn)溆?；所述乙醇的純度?0%。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白20mg，碳二亞胺55mg，使之充分溶解于2mL0.01M的PBS中，得到反應(yīng)液為A液；

（2）按配方進(jìn)行配料，準(zhǔn)確稱取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，加入1.5mL0.01M的PBS中，邊加邊攪拌，使之充分溶解后所得溶液稱為B液；

（3）將上述B液逐滴加入A液中（邊加入邊攪拌），密封，避光，在4℃下攪拌過夜，反應(yīng)液在0.01M的PBS中在4℃環(huán)境下避光攪拌反應(yīng)6h；

（4）待上述反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中，在4℃環(huán)境下用0.01M的PBS透析3天；反應(yīng)液的透析分為恒溫透析、換液透析、和降溫透析；所述恒溫透析是將溫度調(diào)至4℃，并保持恒定；所述換液透析是指透析液需要每間隔一定的時(shí)間進(jìn)行換液，在透析第一天每3h換液一次，以后每8-10h換液一次；所述降溫透析是指在透析完成后，將偶聯(lián)產(chǎn)物分裝于1.5ml離心管中，將溫度降至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例3：

一種卡那霉素抗體，按照重量份數(shù)由如下原料制備而成：

硫酸卡那霉素80份、牛血清白蛋白25份、卵清白蛋白5份、弗氏完全佐劑5份、弗氏不完全佐劑5份、碳二亞胺5份、戊二醛2份、羊抗鼠酶標(biāo)二抗3份、磷酸氫二鈉3份、醋酸鈉10份、十二烷基磺酸鈉20份、考馬斯亮藍(lán)R-250 15份、過氧化脲12份、乙醇11份、甲醛7份、硼氫化鈉13份、甲醇3份、濃硫酸3份、磷酸鹽緩沖液1份、包被用碳酸鹽緩沖液CBS 1份、洗滌液PBST 1份、封閉液5%豬血清1份，ELISA試驗(yàn)顯色液1份、ELISA試驗(yàn)終止液3份。

所述ELISA試驗(yàn)顯色液選用0.25毫升；所述ELISA試驗(yàn)終止液選用0.5毫升；所述封閉液5%豬血清在4℃條件下保存?zhèn)溆茫凰鲆掖嫉募兌葹?0%。

其制備工藝，包括如下步驟：

（1）準(zhǔn)確稱取牛血清白蛋白20mg，碳二亞胺55mg，使之充分溶解于2mL0.01M的PBS中，得到反應(yīng)液為A液；

（2）按配方進(jìn)行配料，準(zhǔn)確稱取卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品50mg，加入1.5mL0.01M的PBS中，邊加邊攪拌，使之充分溶解后所得溶液稱為B液；

（3）將上述B液逐滴加入A液中（邊加入邊攪拌），密封，避光，在4℃下攪拌過夜，反應(yīng)液在0.01M的PBS中在4℃環(huán)境下避光攪拌反應(yīng)6h；

（4）待上述反應(yīng)完后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到處理好的透析袋中，在4℃環(huán)境下用0.01M的PBS透析3天；反應(yīng)液的透析分為恒溫透析、換液透析、和降溫透析；所述恒溫透析是將溫度調(diào)至4℃，并保持恒定；所述換液透析是指透析液需要每間隔一定的時(shí)間進(jìn)行換液，在透析第一天每3h換液一次，以后每8-10h換液一次；所述降溫透析是指在透析完成后，將偶聯(lián)產(chǎn)物分裝于1.5ml離心管中，將溫度降至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4

通過以下測試方法研究了卡那霉素完全抗原的免疫學(xué)鑒定。

間接ELISA測定多抗血清效率（如圖1和圖2所示）

用pH9.6的碳酸鹽緩沖液（CBS）將包被原KAN-GDA-OVA稀釋至4μg/mL，以每孔50μL包被在96孔酶標(biāo)板上，37℃孵育3h，棄去酶標(biāo)板內(nèi)包被液，用PBST洗滌5次；每孔加200μL5%的豬血清4℃封閉過夜，封閉完成后棄去酶標(biāo)板內(nèi)封閉液；將待測抗血清用PBS倍比稀釋（稀釋濃度為1：1600~1：102400），以每孔50μL分別加入酶標(biāo)板；同時(shí)設(shè)置陰性對照（等量陰性血清）和空白對照（等量PBS）；37℃溫育40min，洗滌；加入用封閉液稀釋的羊抗鼠酶抗（1:1000倍稀釋），每孔加入50μL，于37℃孵育30min，洗滌方法同上；每加入TMB底物顯色液50μL，37℃顯色1~2min；每孔加入50μL2mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)。

用酶標(biāo)儀記錄450nm波長處的吸光值（OD₄₅₀）。以待測血清的OD₄₅₀大于或等于陰性對照OD₄₅₀的2.1倍時(shí)，所對應(yīng)的血清稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)，從圖中可以看出人工偶聯(lián)產(chǎn)物KAN-BSA、KAN-GDA-OVA的蛋白電泳條帶分別與載體蛋白BSA、OVA的條帶相比有一定的滯后現(xiàn)象，初步說明KAN半抗原小分子與載體蛋白偶聯(lián)成功。

實(shí)施例5

間接競爭ELISA測定多抗血清敏感性（如圖3所示）

步驟如下：

包被：用pH9.6的碳酸鹽緩沖液（CBS）將包被原KAN-GDA-OVA稀釋至4μg/mL，以每孔50μL包被在96孔酶標(biāo)板上，37℃孵育3h，棄去酶標(biāo)板內(nèi)包被液，用PBST洗滌5次；

封閉：每孔加入200μL5%的豬血清于4℃封閉過夜，封閉完成后棄去酶標(biāo)板內(nèi)封閉液；

加標(biāo)品：用0.01M的PBS稀釋KAN標(biāo)準(zhǔn)品，將其濃度設(shè)定為0、30、60、125、250、500、1000ng／mL。每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液各50μL，設(shè)陰性對照（NC)和空白對照（BC），其中陰性對照不含標(biāo)品；

加抗血清：選擇用間接ELISA方法測定的抗體效價(jià)中OD₄₅₀值為1.0左右的孔所對應(yīng)的抗體的稀釋濃度配置抗卡那霉素多抗血清，每孔加入50μL，空白對照不加抗血清，于37℃溫育30min；

加酶標(biāo)二抗：將羊抗鼠酶標(biāo)二抗用PBST稀釋（1:1000倍稀釋），每孔加入50μL，37℃溫育30min；

顯色：將顯色液A液和B液等體積充分混勻，每孔加入50μL，顯色5min；每孔加50μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取450nm波長處的吸光值即OD₄₅₀，并記錄結(jié)果以備分析。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品對卡那霉素多抗血清效價(jià)的半數(shù)抑制濃度（IC₅₀），以IC₅₀衡量其敏感度，具體計(jì)算方法：用KAN標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，用B/B0的值為縱坐標(biāo)（B為不同濃度的KAN標(biāo)準(zhǔn)品OD₄₅₀的值，B0為不添加KAN標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)OD₄₅₀的值，即NC對照的OD₄₅₀值），用EXCEL繪制卡那霉素標(biāo)品對多抗血清的抑制曲線，根據(jù)所繪制的曲線生成回歸方程，并計(jì)算IC₅₀。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，免疫的3只小鼠多抗血清的效價(jià)均達(dá)到了1：2.56×10⁴以上，從而說明本實(shí)驗(yàn)制備的卡那霉素人工抗原KAN-BSA具有良好的免疫原性。

基于上述，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明以硫酸卡那霉素和牛血清白蛋為主要原料，加入一定量的碳二亞胺、醋酸鈉、包被用碳酸鹽緩沖液CBS，采用偶聯(lián)方法制備出可以與酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合包被的抗體，整個(gè)反應(yīng)過程具有簡單、高效、經(jīng)濟(jì)、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，該工藝生產(chǎn)效率得到大大的提高，所得的抗體的效價(jià)及敏感性均良好，生產(chǎn)工藝操作方便，成本較低。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。