本發(fā)明涉及試劑盒檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體的說涉及一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒微滴數(shù)字rt-pcr(rt-ddpcr)絕對定量檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,prrs)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的一種以懷孕母豬繁殖障礙、尤其哺乳仔豬呼吸困難為特征的高度接觸性傳染病。本病在1987年首次暴發(fā)于美國，隨后在加拿大、歐洲與亞洲相繼出現(xiàn)，目前已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行，每年造成巨大的經(jīng)濟損失。我國在1995年首次出現(xiàn)prrs，隨后迅速蔓延。2006年在我國全面暴發(fā)了體溫高、發(fā)病率高、死亡率高為主要臨床特征的豬“高熱病”，而導(dǎo)致該病的病原是較之前在國內(nèi)流行的經(jīng)典prrsv發(fā)生變異的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(highlypathogenicprrs，hp-prrs)。目前為止，prrsv有兩種型，歐洲型和美洲型，而美洲型又分為兩種亞型，經(jīng)典美洲株和高致病性美洲株，三種亞型毒株在基因序列上存在一定差異。我國國內(nèi)主要流行的為美洲型毒株，而歐洲株在國內(nèi)也偶有發(fā)現(xiàn)，因此在臨床上需要一種能夠快速診斷prrsv的檢測方法。傳統(tǒng)的prrsv檢測方法主要包括病毒的分離與鑒定、免疫過氧化物酶單層試驗(ipma)、間接免疫熒光試驗(ifa)和間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(間接elisa)等。目前最常用核酸檢測方法有反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試驗(rt-pcr)等而熒光rt-pcr(realtimert-pcr)試驗。傳統(tǒng)的prrsv檢測方法存在需要使用高成本儀器設(shè)備，試驗所需時間較長等不足。rt-pcr和realtimert-pcr雖然較之以往方法具有特異性更強、靈敏度高、重復(fù)性好，且自動化程度高等特點，但是上述方法均只能實現(xiàn)定性和半定量的檢測，無法對病毒核酸進行精確定量，在靈敏度和敏感性特異性上仍存在一定的局限性。數(shù)字化pcr(digitalpcr，dpcr)的概念早在1999年就由bertvogelstein采用并發(fā)表相關(guān)文獻，其初衷是為了能夠從臨床樣品(如尿液、淋巴液、血漿、糞便等)大量的正常體細胞中檢測出微量的突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現(xiàn)數(shù)字pcr的核心理念——“無限稀釋”(terminaldilution)。bio-rad公司的qx200系統(tǒng)核心的微滴化技術(shù)能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0,000個納升級的微滴，本質(zhì)上將傳統(tǒng)定量pcr的一個test變成20,000個test，大大提高了核酸序列檢測的靈敏度和精準度，是對“無限稀釋”這一概念的完美演繹，其方法原理可稱為微滴式數(shù)字化pcr(dropletdigitalpcr，ddpcr)。qx200ddpcr系統(tǒng)包括兩臺儀器：微滴發(fā)生器和微滴分析儀，及其相關(guān)的耗材。微滴發(fā)生器將每個樣品分成20,000個均勻的納升級微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。每個微滴都作為一個獨立的pcr反應(yīng)器。隨后微滴轉(zhuǎn)移至96孔pcr板上，開展終點pcr擴增。采用微滴分析儀(dropletreader)逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可計算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)。與傳統(tǒng)的定量pcr相比，數(shù)字pcr的精確度和靈敏度更佳。利用微滴式數(shù)字pcr技術(shù)，研究人員可以檢測稀有突變，精確測定拷貝數(shù)變異，并對基因表達進行絕對定量。癌癥相關(guān)突變因濃度較低，往往逃過檢測。憑借qx200系統(tǒng)的高靈敏度，研究人員如今可檢測濃度低至1/1,000,000的靶分子。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、可實現(xiàn)精確定量的微滴數(shù)字rt-pcr檢測方法和微滴數(shù)字rt-pcr測試劑盒，用于高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的快速精確檢測。本發(fā)明的第一個技術(shù)目的是提供用于檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物和探針組合，包括1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：f：agtgggtcggagcaccagttcr：cgcagacacgaatccagaggctp：fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1。本發(fā)明提供了上述的特異性引物和探針組合在制備高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測試劑盒或檢測試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種含有上述特異性引物和探針組合的試劑盒。所述試劑盒優(yōu)選為微滴數(shù)字rt-pcr絕對定量檢測試劑盒。本發(fā)明的另一技術(shù)目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度和精確度的、操作簡單的檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測試劑盒，其中包含1對特異性引物和1條與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：f：agtgggtcggagcaccagttcr：cgcagacacgaatccagaggctp：fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1。還包含病毒總rna提取試劑和檢測試劑；所述檢測試劑包括無rna酶的蒸餾水，一步法rt-ddpcr探針法預(yù)混液，探針法rt-ddpcr微滴發(fā)生油，質(zhì)控液，陰性對照和陽性對照。所述病毒總rna提取試劑含有trizol、氯仿或異戊醇、異丙醇。所述一步法rt-ddpcr探針法預(yù)混液其900μl的配方為：500μl的2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分別為90μl，特異探針為40μl，引物和探針的濃度均為10μm，以及無rnase酶蒸餾水180μl。所述陽性對照為含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組rna的提取液，陰性對照為無rna酶蒸餾水。本發(fā)明的試劑盒其工作原理是采用微滴式數(shù)字化rt-pcr(rt-ddpcr)，所述試劑盒的工作程序為：(1)配制rt-ddpcr反應(yīng)液；rt-ddpcr反應(yīng)液20μl配方為：一步法ddpcr探針法預(yù)混液18μl，待測樣品rna模板為2μl；(2)制備微滴，然后將微滴轉(zhuǎn)入pcr板，于pcr儀中進行擴增；(3)將完成pcr擴增的pcr板放入微滴分析儀中，檢測微滴，分析數(shù)據(jù)，顯示檢測結(jié)果。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，制備微滴的方法是采用bio-rad公司的qx200系統(tǒng)中的微滴發(fā)生器，按照說明書操作進行微滴制備即可。其中，步驟(2)中pcr的擴增程序為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，57～60℃退火60sec(優(yōu)選58℃)，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)，每步都設(shè)置2.5℃/sec的降溫速度。本發(fā)明提供的試劑盒在豬疫病檢測和預(yù)防中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明試劑盒檢測結(jié)果的判定方法為：(1)陽性對照：100±5個拷貝；(2)陰性對照：<1個拷貝；待測樣本結(jié)果判定：(1)陽性：標本檢測結(jié)果≥1個拷貝。(2)陰性：標本檢測結(jié)果<1拷貝。本發(fā)明摸索了引物和探針的濃度，找到了最適rt-ddpcr的引物和探針的工作濃度。摸索了rt-ddpcr反應(yīng)過程中最適的升降溫速度，以提高rt-ddpcr的擴增效率，使本發(fā)明方法能夠與bio-rad公司的qx200系統(tǒng)相結(jié)合。本發(fā)明試劑盒具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、可直接定量，無需標準曲線、操作簡便、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，可以在疫情預(yù)爆發(fā)前便于在早期內(nèi)確定疫病，做好預(yù)防，從源頭控制疫情。具體表現(xiàn)在：(1)高特異性：本發(fā)明根據(jù)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列設(shè)計了特異性引物和特異探針，其特異性極高，且非常穩(wěn)定，保證了反應(yīng)的順利進行，進一步確保高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢出的特異性；(2)高靈敏度：檢測濃度低至1/1,000,000的靶分子；能夠直接定量待測樣本中的拷貝數(shù)；(3)低模板：由于檢測的靈敏度很高，可以檢測出低豐度的目的基因，所以可以降低模板用量，稀釋模板濃度，對于一些珍貴，稀少的樣本可以有更多的研究。(4)可直接定量，無需標準曲線：與傳統(tǒng)的prrsv檢測方法相比，該試劑盒可直接定量，無需標準曲線，操作簡便、準確無誤，更加適合現(xiàn)場檢測，有效預(yù)防豬疫病的大規(guī)模爆發(fā)。具體實施方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1引物及探針的設(shè)計與篩選1、本發(fā)明引物、探針設(shè)計：根據(jù)genbank已發(fā)表的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組序列，進行適用于rt-ddpcr的特異性引物和的設(shè)計。主要在變異序列段設(shè)計引物探針，以防止擴增出非prrsv美洲型變異株的病毒序列。本實施例給出了篩選最佳引物的過程，選擇用軟件設(shè)計出的其中幾對備選引物進行篩選，備選引物如下，見表1。表1名稱序列f1cccactgatgacacctttg(seqidno.4)r1aacagaggctcatcctggt(seqidno.5)p1fam-cgcgtagaactgacaacaacgctga-bhq1(seqidno.6)f2agtgggtcggagcaccagttc(seqidno.1)r2cgcagacacgaatccagaggct(seqidno.2)p2fam-aactgtgacaactggaacgctgacgca-bhq1(seqidno.3)2、引物的篩選(1)引物隨機配為四對：f1r1、f1r2、f2r1、f2r2；(2)然后用染料法做熒光定量rt-pcr，rt-pcr體系配方：2x一步法sybrgreensupermix10μl，上游引物，下游引物分別為1μl，rnasefreedh2o3μl，陽性模板5μl。pcr的擴增程序為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，60℃退火60sec讀取熒光，共40個循環(huán)；65℃—95℃每5秒升高0.5℃溶解曲線，結(jié)束反應(yīng)。(3)結(jié)果分析，選擇沒有非特異性擴增的引物對f2r2.3、探針的篩選(1)引物探針的組合為：1、f2r2+p1，2、f2r2+p2(2)然后在ddpcr平臺上，rt-ddpcr體系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermix10μl，上游引物，下游引物分別為1μl，探針0.5μl，rnasefreedh2o3.5μl，陽性模板4μl，總體積20μl(引物和探針的濃度均為10μm)。然后生成微滴。(3)上pcr儀擴增，為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，55℃退火60sec，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字pcr檢測儀檢測。(4)分析結(jié)果：根據(jù)實驗結(jié)果選擇f2r2+p2引物探針組合。實施例2在ddpcr平臺上檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的pcr方法退火溫度的優(yōu)化。1、選擇引物探針的組合為：f2r2+p2。2、然后在ddpcr平臺上，rt-ddpcr體系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermix10μl，上游引物，下游引物分別為1μl，探針0.5μl，rnasefreedh2o3.5μl，陽性模板4μl，總體積20μl(引物和探針的濃度均為10μm)。做8個復(fù)孔，然后生成微滴。3、上pcr儀擴增，為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，50～60℃(儀器自動分布8個溫度梯度)退火60sec，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字pcr檢測儀檢測。4、分析結(jié)果：根據(jù)實驗結(jié)果選擇57～60℃的退火溫度，最優(yōu)溫度為58℃。實施例3引物、探針濃度的優(yōu)化實驗設(shè)計引物探針濃度均為10μm,組合為f2r2p2,體系配置方法見表2。表2然后在ddpcr平臺上生成微滴，轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，封鋁膜。上pcr儀擴增，pcr的擴增程序為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，60℃退火60sec，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)。上微滴數(shù)字pcr檢測儀檢測。分析結(jié)果：根據(jù)實驗結(jié)果選擇f2r2+p2引物探針配方，選擇引物分別為1.8μl，探針為0.8μl。實施例4pcr擴增升降溫速度的優(yōu)化實驗1、然后在ddpcr平臺上，引物探針組合f2r2+p2(濃度為10μm),用ddpcr體系配方：2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes10μl，上游引物，下游引物分別為1.8μl，探針為0.8μl，rnasefreedh2o3.6μl，陽性模板2μl，總體積20μl。每臺儀器做4個復(fù)孔。然后生成微滴，轉(zhuǎn)移到pcr小管內(nèi)。2、在兩臺同樣的pcr儀平臺上擴增，為50℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30sec，58℃退火60sec，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)，一臺設(shè)置升降溫速度設(shè)置為5℃/sec，另一臺上設(shè)置升降溫速度設(shè)置為2.5℃/sec，擴增結(jié)束后，把pcr小管內(nèi)的擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到同一塊96孔板內(nèi)，封鋁膜，上微滴數(shù)字pcr檢測儀檢測。3、分析結(jié)果：根據(jù)實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，升降溫速度慢的最后檢測的微滴數(shù)比升降溫速度快的多，擴增效率高，升降溫速度慢的陰性微滴和陽性微粒之間的距離分的很開，很容易區(qū)分，升降溫速度快的陰性微滴和陽性微粒之間的距離分的不開，不容易區(qū)分，故選擇2.5℃/sec升降溫速度。實施例5病毒rna提取取100μl組織樣品研磨上清液置1.5mleppendorf管中，加500μl溶液a，混勻，室溫劇烈震蕩15s，室溫靜置5min。加120μl溶液b，小心蓋上帽蓋，室溫劇烈震蕩15s，室溫放置5min。12,000rpm，4℃，離心15min，可見分為三層，上層水相含rna。轉(zhuǎn)移水相至一新eppendorf管，加入等量溶液c(約500μl)，混勻，室溫放置15min。12,000rpm，4℃，離心10min，離心后在eppendorf管邊和底部可見有膠樣rna沉淀。洗rna：棄上清，加1000μl75％乙醇(使用前用溶液d加無水乙醇配置而成，-20℃預(yù)冷)漂洗沉淀，12000rpm，4℃，離心5min，棄上清。室溫充分干燥rna沉淀。加15μlrnasefreedh2o，即可用于pcr擴增?？梢?20℃保存?zhèn)溆?。實施?檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的rt-ddpcr方法的建立1、微滴數(shù)字pcr絕對定量檢測試劑盒的組裝將試劑盒分為一步法微滴數(shù)字rt-pcr檢測試劑，方便保存和運輸。用合適的外包裝盒包裝以下試劑，貼標簽(標示名稱、批號、生產(chǎn)日期、有效期等)。溶液a(rnasefreedh2o)1支，1ml；溶液b(一步法rt-ddpcr探針法預(yù)混液)一支，900μl；溶液c(探針法rt-ddpcr微滴發(fā)生油)一支，7ml；溶液d為rt-ddpcr探針法質(zhì)控液，3.5ml；溶液e(陽性對照)一支，40μl；溶液f(陰性對照)一支，40μl；使用基因組rna為陽性模板，使用tris-edta緩沖液(0.01mph8.0)稀釋后冷凍保存。將檢驗合格的陽性對照制劑按400μl定量分裝。使用rnasefreedh2o為陰性對照。上述一步法rt-ddpcr探針法預(yù)混液其900μl的配方為：500μl的2xone-steprt-ddpcrsupermixforprobes，上、下游引物分別為90μl，特異探針為40μl，引物和探針的濃度均為10μm。rnasefreedh2o180μl。使用時，在18μl的rt-ddpcr探針法預(yù)混液中加入2μl的rna模板，得到20μl的rt-ddpcr反應(yīng)液，用于制備微滴。2、rt-ddpcr方法的建立(1)制備rt-ddpcr反應(yīng)液，總體積20μl。向pcr擴增管中加入下列反應(yīng)物：單反應(yīng)體系配方一步法rt-ddpcr探針法預(yù)混液18μl模板rna2μl空白對照：以rnasefreedh2o代替模板，同樣條件下擴增。(2)取微滴發(fā)生卡置于卡托中固定，將20μl反應(yīng)液加入到微滴發(fā)生卡中間一排的8個孔內(nèi)，不足8個樣品時用20μl1×溶液d補足，建議使用8通道20μl排槍和20μl槍頭(不能用200ul槍頭)，加樣時槍頭接近孔一側(cè)底部，與側(cè)壁呈大約15°角，緩慢打出液體，打出一部分后慢慢提升槍頭位置再打出余下液體，不要將槍按至超過第一檔位置以免引入氣泡。(3)在微滴發(fā)生卡最底下一排8個孔中各加入70μl微滴生成油，同樣不能有空著的孔。(4)蓋上膠墊，注意兩邊的小孔都要鉤牢。(5)將以上卡托輕輕地平穩(wěn)放置于微滴生成儀中，開始生成微滴，注意儀器上指示燈狀態(tài)，一般2分鐘之內(nèi)完成。(6)微滴生成于微滴發(fā)生卡最上面一排孔內(nèi)，優(yōu)選使用8通道排槍和200μl槍頭小心緩慢吸取，調(diào)整吸取體積為40μl，將卡托放平，槍頭以與孔壁呈30～45°角放入，輕觸孔底，約5秒吸取40ul，再同樣緩慢地打入96孔板相應(yīng)位置孔內(nèi)(約5秒)，槍頭貼近孔壁接近孔底，注意封上蓋以防油揮發(fā)，每次棄去已使用過的微滴發(fā)生卡和膠墊。(7)轉(zhuǎn)移油滴進入96孔板內(nèi)完成后，用預(yù)熱好的px1熱封儀對其進行封膜(膜亮面朝上，暗面向下)，推薦的運行程序為：180℃，10s，一般無需顛倒方向二次封膜；封好膜之后應(yīng)該在30分鐘內(nèi)進行pcr反應(yīng)，或者放于4℃冰箱4小時之內(nèi)進行pcr，可在任意一臺96孔pcr儀上完成，注意升降溫速度≤2.5℃/s。推薦反應(yīng)條件：(8)將之前完成pcr的96孔板放入plateholder中組裝好，注意板斜角方位，組裝好之后輕輕地平穩(wěn)放入微滴讀取儀中。(9)打開quantasoft軟件，建議每次實驗之前做一次系統(tǒng)清洗，若一周以上未使用建議先做一次填充油路再做系統(tǒng)清洗。之后對96孔板中樣品信息進行設(shè)置，主要是提供實驗名稱、實驗類型以及探針信息等，完成后即可運行儀器，結(jié)束后結(jié)果會被自動分析，人工核實后保存結(jié)果。4、結(jié)果分析和判定本發(fā)明試劑盒檢測結(jié)果的判定方法為：(1)陽性對照：100±5個拷貝；(2)陰性對照：<1個拷貝；待測樣本結(jié)果判定：(1)陽性：標本檢測結(jié)果≥1個拷貝。(2)陰性：標本檢測結(jié)果<1拷貝。實施例7特異性檢驗用制備的試劑盒分別檢測豬健康細胞培養(yǎng)物，prrsv美洲型經(jīng)典株，prrsv歐洲型，豬圓環(huán)病毒，偽狂犬病病毒，豬細小病毒，豬傳染性胃腸炎病毒各10份，結(jié)果全為陰性；檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的組織與細胞培養(yǎng)物各10份，結(jié)果全為陽性。以上檢測結(jié)果證明了本發(fā)明的試劑盒特異性好、靈敏度高、可直接定量，檢測方便快捷、結(jié)果準確可靠。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁12