本發(fā)明涉及生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

天然防腐劑是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外倡導(dǎo)、開發(fā)和尋求的新型產(chǎn)品，開發(fā)抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒的天然防腐劑已成為各國(guó)科技工作者的研究熱點(diǎn)。ε-聚賴氨酸是L-賴氨酸殘基通過(guò)α-羧基和ε-氨基形成的酰胺鍵連接而成的均聚氨基酸，故成為ε-聚賴氨酸。ε-聚賴氨酸作為一種天然的生物代謝產(chǎn)品，具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果，是目前天然防腐中具有優(yōu)良防腐性能和巨大商業(yè)潛力的微生物類食品防腐劑，相比于山梨醇等傳統(tǒng)化學(xué)食品防腐劑，ε-聚賴氨酸具有抑菌譜廣，抑菌能力強(qiáng)，不受PH影響，并且耐熱，使用量低和安全性高等優(yōu)點(diǎn)。

ε-聚賴氨酸主要由白色鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)制得，但ε-聚賴氨酸產(chǎn)量過(guò)低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高，價(jià)格昂貴，限制了ε-聚賴氨酸的廣泛應(yīng)用。因此，近些年來(lái)人們也致力于通過(guò)改善發(fā)酵添加和發(fā)酵用添加劑來(lái)提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，但是其效果都不夠顯著。進(jìn)而又逐漸致力于創(chuàng)新從發(fā)酵液中提取和提純?chǔ)?聚賴氨酸的方法上，以希望能夠提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，如中國(guó)專利CN101701069A公開了一種提取ε-聚賴氨酸及其鹽的方法，依次通過(guò)將發(fā)酵液酸化、堿化、吸附、解析、脫色、濃縮的方式得到ε-聚賴氨酸，然而利用這種方式從發(fā)酵液中提取出的ε-聚賴氨酸大多都結(jié)合了氯離子，也就是說(shuō)實(shí)際提取得到的是ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，而不是ε-聚賴氨酸，實(shí)際得到的ε-聚賴氨酸的純度低，而且ε-聚賴氨酸鹽酸鹽的抑菌活性明顯低于ε-聚賴氨酸，最終使得使用上述方法從發(fā)酵液中提取得到的ε-聚賴氨酸產(chǎn)品的防腐性能不理想。

因此，針對(duì)ε-聚賴氨酸生產(chǎn)方法進(jìn)行進(jìn)一步的創(chuàng)新和研究，提高ε-聚賴氨酸的純度和產(chǎn)量，成為了推動(dòng)ε-聚賴氨酸工業(yè)化發(fā)展過(guò)程中亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，提高ε-聚賴氨酸的純度、收率和產(chǎn)量。

為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法， 包括以下操作步驟：

1）制備發(fā)酵液；

2）取步驟1）制備的發(fā)酵液依次進(jìn)行過(guò)濾、堿化、吸附、鹽酸解析、脫色處理后得到清液；

3）調(diào)整步驟2）制備的清液的pH為9.0~10.0，進(jìn)行納濾操作，即完成。

可選的，步驟3）中所述納濾操作為循環(huán)納濾至納濾濃縮液的濃度大于10g/L，濾除鹽水的電導(dǎo)率小于200us/cm。

可選的，步驟3）中采用摩爾濃度為1.0~1.5mol/L的氫氧化鈉調(diào)整步驟2制備的清液的pH為9.0~10.0。

可選的，步驟3）中納濾操作后還包括將納濾后的濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，其中噴霧干燥的進(jìn)口溫度為140±10℃，出口溫度為83±15℃，濃縮液的流速為80~120L/h。

可選的，步驟2）中所述過(guò)濾為向發(fā)酵液中加入珍珠巖，然后進(jìn)行板框過(guò)濾，得過(guò)濾液；所述堿化為將過(guò)濾液的pH調(diào)整為堿性。其中珍珠巖在發(fā)酵液中的質(zhì)量百分含量為1.5~2.5%。

可選的，步驟2）中所述吸附為將堿化后的發(fā)酵液經(jīng)D155樹脂上柱吸附至樹脂達(dá)到飽和狀態(tài)，之后用純水洗滌吸附飽和的樹脂，至洗滌液體澄清；所述鹽酸解析為將洗滌后的吸附飽和的樹脂用鹽酸進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液；所述脫色為將ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液升溫至60±5℃，加入活性炭進(jìn)行脫色，再進(jìn)行板框過(guò)濾，得清液。其中鹽酸的摩爾濃度為0.15~0.20mol/L。

可選的，步驟1）中制備發(fā)酵液的具體方法為：取發(fā)酵用菌種配置菌液進(jìn)行發(fā)酵15~22h后，調(diào)整發(fā)酵菌液的pH為4.1±0.2，之后持續(xù)不斷的向發(fā)酵菌液中加入葡萄糖和生物素，并控制葡萄糖的質(zhì)量百分含量為0.2~2%，生物素的濃度為500μg/L，發(fā)酵7~9天，即完成。

可選的，步驟1）制備發(fā)酵液的過(guò)程中發(fā)酵起始配置菌液的質(zhì)量濃度大于15%。

可選的，步驟1）中制備發(fā)酵液所用的菌種為鏈霉菌屬白色鏈霉菌。

本發(fā)明ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，將發(fā)酵液首先依次經(jīng)過(guò)過(guò)濾、堿化、吸附、鹽酸解析、脫色處理，在鹽酸解析過(guò)程中，氯離子與ε-聚賴氨酸結(jié)合形成ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，本發(fā)明通過(guò)調(diào)整脫色處理后的發(fā)酵液的pH為堿性，使得結(jié)合在ε-聚賴氨酸上的氯離子解離，然后再通過(guò)納濾的方式去除氯離子及其他雜質(zhì)離子，提高所生產(chǎn)的ε-聚賴氨酸的純度，使其純度達(dá)到98%以上，ε-聚賴氨酸的收率提高20%以上。

進(jìn)一步的，本發(fā)明通過(guò)在發(fā)酵15~22h后，在發(fā)酵菌液中持續(xù)不斷的加入生物素，進(jìn)一步提高ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量，使得ε-聚賴氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量提高一倍。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

下述實(shí)施例中ε-聚賴氨酸發(fā)酵液由下述方法制備而得，具體操作步驟為：

（1）種子培養(yǎng)：種子罐經(jīng)水清洗干凈后，開始進(jìn)行空消，之后將溶氧和pH電極校正準(zhǔn)確后裝入種子罐內(nèi)，配種子培養(yǎng)基至種子罐，之后進(jìn)行實(shí)消，降溫至30℃，并將實(shí)消后降溫至30℃的糖并至種子罐中；調(diào)節(jié)好種子培養(yǎng)所需控制的各參數(shù)，溫度自動(dòng)控制在30±1℃，溶氧大于30%，罐壓在0.01-0.03mpa，pH調(diào)至6.8-7.0，之后用氨水自動(dòng)控制在6.0；之后，將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)好的斜面白色鏈霉菌菌種接種至種子罐中，培養(yǎng)14-22h，得發(fā)酵用菌種；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐經(jīng)水清洗干凈后，開始進(jìn)行空消，之后將溶氧和pH電極校正準(zhǔn)確后裝入發(fā)酵罐內(nèi)，配發(fā)酵培養(yǎng)基至發(fā)酵罐，之后進(jìn)行實(shí)消，降溫至30℃，并將實(shí)消后降溫至30℃的糖并至發(fā)酵罐中；調(diào)節(jié)好發(fā)酵培養(yǎng)所需控制的各參數(shù)，溫度自動(dòng)控制在30±1℃，溶氧大于30%，罐壓在0.01-0.03mpa，pH調(diào)至6.0-6.2用氨水進(jìn)行自動(dòng)控制；將步驟1）制備的發(fā)酵用菌種移種至發(fā)酵罐中，使得菌種質(zhì)量濃度達(dá)到15%以上，發(fā)酵15-22h，之后用氨水自動(dòng)調(diào)整發(fā)酵液的pH為4.1±0.2，以無(wú)菌操作的方式一定速度連續(xù)流加葡萄糖和生物素，葡萄糖的殘留量控制在0.2%-2%，生物素控制在500μg/l，發(fā)酵 7-9天，即制得發(fā)酵液。

利用上述方法制備的發(fā)酵液中ε-聚賴氨酸的濃度達(dá)到50g/l，相對(duì)于未采用連續(xù)流加生物素的發(fā)酵方法，ε-聚賴氨酸的產(chǎn)量提高一倍。

實(shí)施例1

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的pH為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)D155樹脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹脂采用摩爾濃度為0.17mol/L的鹽酸進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液；之后在ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液中加入活性炭，升溫至60℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

2）采用摩爾濃度為1.2mol/L的氫氧化鈉將步驟1）制備的清液的pH調(diào)整為9.5，然后加入納濾罐中進(jìn)行循環(huán)納濾至納濾濃縮液的濃度12g/L，濾出鹽水的濃度的電導(dǎo)率186μs/cm，制得納濾濃縮液；其中納濾過(guò)程中濃縮液流量為550L/h，濾出鹽水的流量為25L/h；

3）將步驟2）制備的納濾濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制出口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速100L/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為75.5%，純度達(dá)到99%。

實(shí)施例2

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的pH為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)D155樹脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹脂采用摩爾濃度為0.15mol/L的鹽酸進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液；之后在ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液中加入活性炭，升溫至55℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

2）采用摩爾濃度為1.0mol/L的氫氧化鈉將步驟1）制備的清液的pH調(diào)整為9，然后加入納濾罐中進(jìn)行循環(huán)納濾操作至納濾濃縮液的濃度11g/L,濾出鹽水的濃度的電導(dǎo)率180μs/cm，制得納濾濃縮液；其中納濾過(guò)程中濃縮液流量為500L/h，濾出鹽水的流量為20L/h；

3）將步驟2）制備的納濾濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制出口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速80L/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為75.3%，純度達(dá)到98%。

實(shí)施例3

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的pH為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)D155樹脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹脂采用摩爾濃度為0.2mol/L的鹽酸進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液；之后在ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液中加入活性炭，升溫至65℃，進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

2）采用摩爾濃度為1.5mol/L的氫氧化鈉將步驟1）制備的清液的pH調(diào)整為10，然后加入納濾罐中進(jìn)行循環(huán)納濾操作至納濾濃縮液的濃度12g/L,濾出鹽水的濃度的電導(dǎo)率190μs/cm，制得納濾濃縮液；其中納濾過(guò)程中濃縮液流量為600L/h，濾出鹽水的流量為30L/h；

3）將步驟2）制備的納濾濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制出口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速120L/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品，即為所述的ε-聚賴氨酸。

本實(shí)施例從發(fā)酵液中提取ε-聚賴氨酸的收率為75.6%，純度達(dá)到99%。

對(duì)比例1

一種ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)方法，具體操作步驟為：

1）取上述制備的發(fā)酵液，向發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，進(jìn)行板框過(guò)濾，得到過(guò)濾液，調(diào)整過(guò)濾液的pH為堿性，將堿性過(guò)濾液經(jīng)D155樹脂上柱吸附，吸附至飽和后用反滲透純化水洗滌至洗滌液體澄清，然后將洗滌后的飽和樹脂采用摩爾濃度為0.17mol/L的鹽酸進(jìn)行洗脫，制得ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液；之后在ε-聚賴氨酸鹽酸鹽溶液中加入活性炭進(jìn)行脫色，之后再經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾，得到清液；

2）將步驟1）制備的清液加入納濾罐中進(jìn)行循環(huán)納濾操作至納濾濃縮液的濃度12g/L，濾出鹽水的濃度的電導(dǎo)率186μs/cm，制得納濾濃縮液；其中納濾過(guò)程中濃縮液流量為550L/h，濾出鹽水的流量為25L/h；

3）將步驟2）制備的納濾濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，控制出口溫度為140±10℃，出口溫度83±15℃，料液流速100L/h，得到白色或黃色粉末狀產(chǎn)品。

本對(duì)比例從發(fā)酵液中提取得到的白色或黃色粉末狀產(chǎn)品存在結(jié)合了氯離子的ε-聚賴氨酸鹽酸鹽，ε-聚賴氨酸的純度僅達(dá)到78.5%，收率為50.2%。

結(jié)論：相比對(duì)比例在脫色后不調(diào)整清液的pH為堿性，直接進(jìn)行納濾操作，本發(fā)明方法中調(diào)整清液的pH為堿性后，將與ε-聚賴氨酸結(jié)合的氯離子解離，使得在納濾過(guò)程中濾除氯離子和其他雜質(zhì)，使得ε-聚賴氨酸的純度由78.5%提高至98%以上，收率由50.2%提高至75.5%左右，收率提高了25.3%。