本發(fā)明涉及一種表面帶氨基、羧基和羥基官能團的自發(fā)熒光的聚合物微球及其制備方法，屬于高分子材料領(lǐng)域。該微球表面的多官能團為后續(xù)的熒光微球與蛋白等生物分子的結(jié)合提供位點，適用于作為示蹤和藥物載體等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應用。

背景技術(shù)：

熒光微球指直徑在納米或微米級范圍，負載有熒光物質(zhì)，受外界能量刺激能發(fā)出熒光的固體顆粒。近年來發(fā)展起來的聚合物熒光微球由于粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高，微球表面弧度有利于抗原決定簇和抗體結(jié)合位點的暴露面處于最佳的反應狀態(tài)，因此在標記、示蹤、檢測、標準、固定化酶、免疫醫(yī)學、高通量藥物篩選、基因研究以及某些高新技術(shù)領(lǐng)域的基礎研究和應用方面引起廣泛的重視。

理想的熒光微球不僅要求能產(chǎn)生較強的熒光、微球尺寸均勻、粒徑分布窄、化學穩(wěn)定性好、表面含有豐富的功能基團，且制備工藝簡單，價格便宜。目前熒光微球的制備方法主要分物理法和化學法。物理法是將熒光性物質(zhì)，如熒光素、量子點或稀土離子等吸附在聚合物微球表面或包覆于其中。聶微等（沈陽藥科大學學報，2013,30，329）以三氯甲烷和異丙醇為溶脹劑，吖啶橙和羅丹明為熒光素，通過溶劑逐漸揮發(fā)法對聚苯乙烯微球染色，制備粒徑為1-5μm的熒光微球。閆凱等（高分子學報，2013,11，1453）在種子磁性微球存在下，以對苯乙烯磺酸鈉、稀土配合物等功能單體，通過無皂種子乳液聚合制備磁性熒光微球。但物理方法制備的熒光微球存在大小不一、熒光物質(zhì)分布不均以及易脫落等缺點?；瘜W法是將熒光性材料接枝到微球表面，或?qū)⒑瑹晒馍珗F的單體與其它可聚合單體通過懸浮聚合、乳液聚合以及分散聚合等方法獲得熒光微球。化學法制得的熒光微球各方面性能均較為穩(wěn)定，能避免微球在應用過程中熒光物質(zhì)的泄漏。顏曉梅等（Journal of Material Chemsity,2010,20,1179）通過分散聚合制備微米級的聚苯乙烯微球，之后再將熒光染料羅丹明6G和帶有羧基官能團的物質(zhì)在聚苯乙烯種子微球表面共聚，形成核殼結(jié)構(gòu)的熒光微球。然而，接枝法獲得的熒光微球其熒光物質(zhì)是成點狀分布在微球表面。目前共聚法主要采用可聚合的熒光性單體與苯乙烯共聚，或共軛高分子聚合制備熒光微球。Sherman等（Langmuir, 2005, 21(11)，5218）使用乙烯基芐基（三甲基）-氯化銨對疏水性量子點進行修飾，后與苯乙烯共聚獲得復合熒光微球。范麗娟等（CN102643488B）將聚對苯乙烯撐前驅(qū)體溶液吸附在磺化的聚苯乙烯微球表面提供，在溶液中催化四氫噻吩基團消除，得到殼層材料為聚對苯乙烯撐共軛高分子熒光微球。但這類高分子熒光微球生物相容性較差，合成中用到的大量有機溶劑也不利于其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應用，并且還需對微球表面進行官能化修飾的后處理步驟，以便后續(xù)的微球與蛋白等生物分子結(jié)合。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種可自發(fā)熒光，無毒性，表面帶有大量氨基、羧基，有利于下一步生物醫(yī)學應用的高分子微球及其制備方法。近年綠色熒光蛋白（GFP）作為一種無需底物、自身發(fā)光的蛋白為生物科學領(lǐng)域的應用帶來巨大影響。組成蛋白質(zhì)的氨基酸中，酪氨酸發(fā)色團羥基連接在苯環(huán)上，使得酪氨酸不僅具有較強的熒光性，還具有多種反應活性。本發(fā)明方法以生物小分子酪氨酸為原料，形成油包水的均一乳液，然后升溫乳液縮聚形成初始微球，后經(jīng)戊二醛固化，脫水得到顆粒尺寸為1-10微米，呈現(xiàn)良好單分散性、自發(fā)熒光的酪氨酸-縮甲醛微球。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明所述的表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發(fā)熒光的聚合物微球的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）酪氨酸水相溶液的配制：將一定比例的酪氨酸和草酸溶解在鹽酸溶液中，配制得到濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液；然后加入適量乳化劑，混合乳化均勻即成水相，所述乳化劑為Tween20，用量為濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；

（2）油相的配制：將乳化劑加入液體石蠟中，混合均勻，置于35 ～ 75℃恒溫水浴中配制得到油相；所述乳化劑為司盤80，用量為液體石蠟重量的0.5 ～ 2wt％ ；

(3) 乳化縮聚：在攪拌條件下采用注射器將步驟（1）獲得的水相滴加到步驟（2）獲得的油相中，水相與油相的體積比為(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化溫度為40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化縮聚10-24h后轉(zhuǎn)移到冰水浴中；

(4) 固化與脫水：繼續(xù)攪拌，向其中滴加適量戊二醛，繼續(xù)攪拌，用分液漏斗緩慢滴加入無水異丙醇，滴加完畢之后，繼續(xù)攪拌3-6h，放置0.5-3h；

(5) 洗滌、分離、過篩與干燥：傾去上清液，用無水異丙醇反復清洗，抽濾，再用乙醚清洗數(shù)次；抽濾，真空干燥，即得淡黃色微球干粉。

步驟（1）所述的酪氨酸與草酸的物質(zhì)的量比為1：（0.01~0.1）。

步驟（1）所述的鹽酸的濃度為0.1 -2 mol/L 。

步驟（3）所述的酪氨酸與甲醛物質(zhì)的量比為1：（0.6-1.5）。

步驟（4）所述的戊二醛投加量與酪氨酸物質(zhì)量比為（0.5-1.5）：1，異丙醇投加量為100-150mL。

本發(fā)明上述的方法制得的一種表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發(fā)熒光的聚合物微球，其特征在于：所述自發(fā)熒光的聚合物微球呈單分散分布，平均粒徑為0.1-20μm。

所述自發(fā)熒光的聚合物微球的激發(fā)波長為330-420nm，最大發(fā)射波長為510-540nm。

本發(fā)明所述的表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發(fā)熒光的聚合物微球的制備方法，具體地說包括以下步驟：

（1）配制水相：將一定比例的酪氨酸和草酸溶解在一定濃度的鹽酸溶液中，配制得到濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液；然后加入適量乳化劑，混合乳化均勻即成水相，所述乳化劑為Tween20，用量為濃度為4-30wt%的酪氨酸溶液重量的0.3-2wt%；

（2）配制油相：將乳化劑加入液體石蠟中，混合均勻，置于35 ～ 75℃恒溫水浴中配制得到油相；所述乳化劑為司盤80，用量為液體石蠟重量的0.5 ～ 2wt％ ；

(3) 乳化：在攪拌條件下采用注射器將步驟（1）獲得的水相滴加到步驟（2）獲得的油相中，水相與油相的體積比為(5 ～ 10) ∶ 1 ；乳化溫度為40 ～ 70℃，在500 ～ 7000r/min 下乳化10 ～ 30min，再逐滴加入一定量甲醛溶液，乳化縮聚10-24h后轉(zhuǎn)移到冰水浴中；

(4) 固化與脫水：繼續(xù)攪拌，向其中滴加適量戊二醛，繼續(xù)攪拌3-5h，用分液漏斗滴加無水異丙醇，每分鐘20 滴，滴加完畢之后，繼續(xù)攪拌3-6h，放置0.5-3h；

(5) 洗滌、分離與干燥：傾去上清液，用異丙醇反復清洗，抽濾，再用乙醚清洗數(shù)次；抽濾，干燥，即得淡黃色微球干粉。

所述的一種表面帶氨基、羧基和羥基多官能團的自發(fā)熒光的聚合物微球，其特征在于：所述熒光微球呈單分散分布，粒徑可根據(jù)需要在0.1-20μm進行調(diào)控；熒光微球的激發(fā)波長為330-420nm，最大發(fā)射波長為510-540nm。

步驟（1）所述的酪氨酸與草酸的物質(zhì)的量比為1：（0.01~0.1）。

步驟（1）所述的鹽酸濃度為0.1-2mol/L。

步驟（3）所述的酪氨酸與甲醛物質(zhì)的量比為1：（0.6-1.5）。

步驟（4）所述的戊二醛投加量與酪氨酸物質(zhì)量比為（0.5-1.5）：1，異丙醇投加量為100-150mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

（1）以多官能團的酪氨酸為熒光原料，通過乳液縮聚一步制備粒度分布較為均勻、可在0.1-20μm范圍調(diào)控的熒光微球，熒光物質(zhì)分布均勻、性能穩(wěn)定、不易泄漏與脫落。

（2）與先合成聚合物再通過乳化-凝聚法制備熒光微球工藝相比，該乳液縮聚一步制備熒光微球直接采用酪氨酸單體為原料，不受聚合物溶解性限制；制備過程通過改變酪氨酸溶液的濃度實現(xiàn)微球粒徑的調(diào)控，工藝簡單，反應過程易于控制，生產(chǎn)成本低，重現(xiàn)性好，適合工業(yè)化批量生產(chǎn)。

（3）本發(fā)明采用的熒光原料酪氨酸為人體組成蛋白質(zhì)的重要成分，制備的酪氨酸縮甲醛微球不僅具有良好的生物相容性，而且合成的微球表面帶有大量的氨基、羧基和羥基多官能團，為微球的生物反應提供位點，有利于其在示蹤、藥物載體等生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所制備的酪氨酸縮甲醛熒光微球的FT-IR譜圖。

圖2為本發(fā)明實施例1所制備的酪氨酸縮甲醛熒光微球的SEM照片。

圖3為本發(fā)明實施例1所制備的酪氨酸縮甲醛熒光微球的發(fā)射光譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，僅在于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在6mL 0.5mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，攪拌，混合均勻；

（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25gspan 80，攪拌，混合均勻；

（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL37 wt%甲醛溶液，乳化縮聚14h后轉(zhuǎn)移到冰水浴中；

(4)繼續(xù)攪拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌2h，用分液漏斗逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之后，繼續(xù)攪拌3h，放置30min ；

(5)傾去上清液，用異丙醇反復清洗，抽濾，再用乙醚清洗數(shù)次，真空40℃干燥，得到淡黃色粉末狀產(chǎn)物。

產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜鑒定為酪氨酸-甲醛縮聚物；從掃描電子顯微鏡的形貌分析可以看出，形貌為單分散規(guī)整圓球狀顆粒，粒子平均尺度為1-10μm；從熒光光譜可以看出，產(chǎn)物受波長為365nm光激發(fā)，在540nm處有強發(fā)射峰，見圖1、圖2和圖3。

實施例2

（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在12mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20，攪拌，混合均勻；

（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25g span 80，攪拌，混合均勻；

（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，800r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt%甲醛溶液，乳化縮聚14h后轉(zhuǎn)移到冰水浴中；

(4)繼續(xù)攪拌，向其中滴加4mL 50 wt %戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌2h，用分液漏斗逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之后，繼續(xù)攪拌3h，放置2h；

(5)傾去上清液，用異丙醇反復清洗，抽濾，再用乙醚清洗數(shù)次，沉淀物即為淡黃色，粒徑為1-20微米的酪氨酸縮甲醛熒光微球。各項表征結(jié)果與實施例1合成產(chǎn)物類似。各項表征結(jié)果與實施例1合成產(chǎn)物類似。

實施例3

（1）稱取1.9g酪氨酸溶解在6mL 1mol/L HCl溶液中，加入0.05g草酸，攪拌，使之完全溶解。加入0.08g tween 20 ，攪拌，混合均勻；

（2）在500mL燒杯中加入100mL液體石蠟,加入2.25g span 80，攪拌，混合均勻；

（3）在60℃條件下，將酪氨酸溶液用注射器緩慢滴加到含有span80 的100mL液體石蠟中，7000r/min下乳化30min，逐滴加入2mL 37 wt %甲醛溶液，乳化縮聚14h后轉(zhuǎn)移到冰水浴中；

(4)繼續(xù)攪拌，向其中滴加4mL 50wt%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌4h，用分液漏斗逐滴加入100mL無水異丙醇，滴加速率為20d/min，滴加完畢之后，繼續(xù)攪拌5h，放置1h ；

(5)傾去上清液，用異丙醇反復清洗，抽濾，再用乙醚清洗數(shù)次，沉淀物即為淡黃色，粒徑為0.1-5微米的酪氨酸縮甲醛熒光微球。各項表征結(jié)果與實施例1合成產(chǎn)物類似。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請保護范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。