本發(fā)明涉及天麻素技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及天麻素衍生物、其制備方法、其應(yīng)用與藥物制劑。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是一種嚴重威脅人類，特別是影響中老年人健康的常見疾?。蝗澜缑磕晁烙谛哪X血管疾病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。目前，我國心腦血管疾病患者已經(jīng)超過2.7億人，我國每年死于心腦血管疾病近300萬人，占我國每年總死亡病因的51％。心腦血管疾病已成為人類死亡病因最高的頭號殺手，也是人們健康的“無聲兇煞”。心腦血管疾病具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復發(fā)率高與并發(fā)癥多，即“四高一多”的特點。即使應(yīng)用目前最先進、完善的治療手段，仍可有50％以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，而幸存下來的患者75％不同程度喪失勞動能力，由此導致的家庭、醫(yī)療和經(jīng)濟負擔已成為不可小覷的社會問題。因此，研制更多療效顯著、安全的心腦血管疾病治療藥物是極為迫切的事情。
在中國血栓性疾病已經(jīng)成為各種疾病中最主要致殘和致死的病因之一。血栓性疾病包括：急性冠脈綜合征；而急性冠脈綜合征包括：不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死、心臟猝死、外周動脈阻塞、缺血性中風、深靜脈血栓(DVT)與肺動脈栓塞等。盡管目前對以上血栓性疾病的治療手段和藥物上有了長足的進步，但由于這些藥物均存在不同程度的缺陷，如抗血栓作用不強或因完全阻斷了機體的抗凝機制而觸發(fā)內(nèi)出血現(xiàn)象，因此臨床上可以選擇的治療手段和藥物仍然十分有限，急需更有效而且安全性更高的抗血栓新藥來替代現(xiàn)有的治療方法，以滿足目前日益增長的臨床需求。
分子病理學研究顯示，體內(nèi)血栓的形成過程主要有血小板聚集激活和血液凝固反應(yīng)激活兩大機制參與，兩個機制各有不同的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。阿司匹林和雷比格雷是強烈的血小板聚集抑制劑，在臨床上常用于血栓防治；而肝素鈉、磺達肝素和法華林則屬于抗凝劑，作用于血液凝集通路，在臨床上也廣泛使用于各種血栓性疾病的預防與治療。但上述兩大常規(guī)抗血栓藥物的一個主要副作用是部分患者使用之后引發(fā)內(nèi)出血。因此，目前還沒有抗血栓且副作用較小的藥物。
天麻素本品是蘭科植物天麻的干燥根塊提取物，原料產(chǎn)地為云南。天麻素的中文別名為4-羥甲基苯基-β-D-吡喃葡萄糖甙，其結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示。天麻素具有較好的鎮(zhèn)靜和安眠作用，對神經(jīng)衰弱、失眠和頭痛癥狀有緩解作用。中藥天麻素可治療痛眩暈、肢體麻木和驚痛抽搐。臨床天麻素主要用于治療椎一基底動脈供血不足、前庭神經(jīng)元炎、眩暈癥等癥。
尹述凡等人報道了圍繞與天麻素具有相同碳骨架的豆腐果苷所做的一系列衍生，以及它們在鎮(zhèn)靜催眠方面的用途。申請?zhí)枮镃N200710027503.8的中國專利同樣圍繞豆腐果苷進行了一系列的衍生，并保護了其在治療老年癡呆癥方面的用途。但目前圍繞天麻素苷元進行結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)具有心腦血管方面用途的藥物卻鮮有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種天麻素衍生物及其制備方法，本申請?zhí)峁┑奶炻樗匮苌锞哂忻黠@的擴張血管、抗凝血和抗缺血再灌注損傷的作用，可用于制備預防或治療心腦血管疾病藥物和抗凝血藥物。
有鑒于此，本申請?zhí)峁┝艘环N具有式(II)結(jié)構(gòu)的天麻素衍生物，
其中，R為取代的茚環(huán)。
優(yōu)選的，所述R的結(jié)構(gòu)式如式(X)所示；
其中，X為氫、羥基、氨基或羰基。
優(yōu)選的，所述R的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)、式(IV)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)或式(VIII)所示；
本申請還提供了一種天麻素衍生物的制備方法，包括：
在催化劑的作用下，將具有式(XI)結(jié)構(gòu)的化合物與具有式(Ⅻ)結(jié)構(gòu)的化合物在溶劑中反應(yīng)，得到具有式(II)結(jié)構(gòu)的天麻素衍生物；
R-OH (Ⅻ)；
其中，R為取代的茚環(huán)。
優(yōu)選的，所述具有式(Ⅻ)結(jié)構(gòu)的化合物為4-羥基-1-茚酮、5-羥基-1-茚酮或6-羥基-1-茚酮。
優(yōu)選的，所述天麻素衍生物為含茚酮類天麻素衍生物，得到含茚酮類天麻素衍生物之后還包括：
將得到的含茚酮類天麻素衍生物與NaBH4進行還原反應(yīng)，得到含茚醇類天麻素衍生物。
本申請?zhí)峁┝怂龅幕蛏鲜龇桨杆龅闹苽浞椒ㄋ苽涞奶炻樗匮苌镌谥苽淇鼓幬镏械膽?yīng)用。
本申請還提供了上述方案所述的或上述方案所述的制備方法所制備的天麻素衍生物在制備預防或治療心腦血管疾病藥物和保健品中的應(yīng)用。
本申請還提供了一種藥物制劑，包括上述方案所述的或上述方案所述的制備方法所制備的天麻素衍生物和藥學上可接受的輔料。
優(yōu)選的，所述藥物制劑的劑型為片劑、膠囊劑、注射液或凍干粉針劑。
本申請?zhí)峁┝艘环N天麻素衍生物及其制備方法，所述天麻素衍生物中含有取代的茚環(huán)類基團；本申請還提供了天麻素衍生物的制備方法。本申請采用比濁法測定血小板聚集率，以評價所述天麻素衍生物對血小板聚集的抑制率，實驗結(jié)果表明，本申請?zhí)峁┑奶炻樗匮苌锞哂忻黠@的抗凝血作用，可作為潛在的先導化合物，在制備治療血栓、心腦血管疾病、中風和其它與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
具體實施方式
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是應(yīng)當理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
本發(fā)明提供了一種具有式(II)結(jié)構(gòu)的天麻素衍生物，
其中，R為取代的茚環(huán)。
本申請?zhí)峁┑奶炻樗匮苌镏械腞為取代的茚環(huán)類基團。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，茚具有式(Ⅸ)結(jié)構(gòu)；本申請所述R優(yōu)選為五元環(huán)上含有取代基的茚環(huán)類基團，而六元環(huán)與O相連；作為優(yōu)選方案，五元環(huán)上的取代基可以為一個，也可以為多個，對此本申請沒有特別的限制。作為優(yōu)選方案，所述R的結(jié)構(gòu)式如式(X)所示；
其中，X為氫、羥基、氨基或羰基。
作為優(yōu)選方案，本申請所述R的結(jié)構(gòu)式如式(Ⅲ)、式(IV)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)或式(VIII)所示；
示例的，所述天麻素衍生物的結(jié)構(gòu)式如表1中所示，
表1本發(fā)明天麻素衍生物的結(jié)構(gòu)式表
本發(fā)明還提供了一種天麻素衍生物的制備方法，包括：
在催化劑的作用下，將具有式(XI)結(jié)構(gòu)的化合物與具有式(Ⅻ)結(jié)構(gòu)的化合物在溶劑中反應(yīng)，得到具有式(II)結(jié)構(gòu)的天麻素衍生物；
R-OH (Ⅻ)；
其中，R為取代的茚環(huán)。
在制備天麻素衍生物的過程中，所述式(XI)結(jié)構(gòu)的化合物為四乙酰葡萄糖三氯乙酰亞胺酯，其按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備方法制備即可，對此本申請沒有特別的限制。所述四乙酰葡萄糖三氯乙酰亞胺酯與所述具有式(Ⅻ)結(jié)構(gòu)的化合物的摩爾比優(yōu)選為2～3：1，所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20～30℃，所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為1～3h。本申請所述天麻素衍生物的反應(yīng)過程如下式所示：
所述溶劑優(yōu)選為包含碳原子的能溶解不溶于水的物質(zhì)的一類有機化合物，包括鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化物、含氮化合物及含硫化合物等多類物質(zhì)，在常溫常壓下呈液態(tài)，具有較大的揮發(fā)性，在溶解過程中，溶質(zhì)與溶劑的性質(zhì)均無改變。作為優(yōu)選方案，所述溶劑為二氯甲烷、甲醇、乙醇、叔丁基甲基醚或四氫呋喃中的一種。催化劑是指能提高化學反應(yīng)速率，而本身結(jié)構(gòu)不發(fā)生永久性改變的物質(zhì)。本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選以三氟化硼乙醚作為催化劑。
按照本發(fā)明，反應(yīng)原料之一具有式(Ⅻ)結(jié)構(gòu)的化合物在優(yōu)選為為4-羥基-1-茚酮、5-羥基-1-茚酮或6羥基-1-茚酮時，得到的產(chǎn)物天麻素衍生物為茚酮類天麻素衍生物，在此情況下，所述天麻素衍生物再與NaBH4進行還原反應(yīng)，即得含茚醇類天麻素衍生物。
本申請還提供了上述方案所述的或上述方案所述的制備方法所制備的天麻素衍生物在制備抗凝血藥物中的應(yīng)用。
血小板可由一系列血漿活性因子激活和聚集，如AA、5-HT、凝血酶等。凝血和血小板聚集共同促進血栓形成。本申請以上述天麻素衍生物作為抑制血小板活化聚集的樣品，以減少血栓的形成。
實驗采用比濁法測定血小板聚集率，其原理是離心制備PPP和PRP，將PPP所測得的透光率視為100％，PRP的透光率視為0％。將PRP置于比色管中，加入誘導劑，在攪拌的條件下，誘導劑與血小板膜受體之間相互作用，引起血小板逐漸聚集，血漿濁度下降，透光率增加，光電池迅速將光濁度的信號轉(zhuǎn)換為電訊號，血小板聚集儀自動地進行動態(tài)測量和記錄，從而描繪出血小板聚集曲線。此法利用血小板聚集儀能夠比較方便地獲得血小板聚集情況，從而評價血小板的聚集功能。
本發(fā)明實施例中，建立含茚環(huán)類天麻素衍生物對ADP誘導家兔體外血小板聚集抑制率的測定，結(jié)果顯示KPC-4000006、KPC-4000007、KPC-4000008、KPC-4000009、KPC-40000010和KPC-40000011六個含茚環(huán)類天麻素衍生物對ADP誘導的家兔血小板聚集抑制率均超過60％，顯示這6個受試樣品均可作為抗血小板聚集的候選藥物。
綜上所述，本發(fā)明所述天麻素衍生物具有明顯的抗凝血的作用。本申請通過附加環(huán)來約束羥基的空間構(gòu)象，使其更好地與受體匹配，從而使天麻素衍生物具有抗凝血作用。
本申請還提供了上述方案所述的或上述方案所述的制備方法所制備的天麻素衍生物在制備預防和或治療心腦血管疾病藥物和保健品中的應(yīng)用。
本申請還提供了一種藥物制劑，其包括上述方案所述的天麻素衍生物以及藥學上可接受的輔料。
具體的，本發(fā)明所述天麻素衍生物可以和常規(guī)的輔料組合制成治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物。
本申請對所述藥物制劑的劑型沒有特別的限制，為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的劑型，示例的，所述劑型可為口服液、顆粒劑、片劑、丸劑、散劑、膠囊劑或滴丸劑。
本發(fā)明所述天麻素衍生物是一種全新結(jié)構(gòu)的化合物，具有明顯的抗凝血作用，可用于作為潛在的先導化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物中運用。同時，本發(fā)明所述天麻素衍生物的制備方法簡單易行、重現(xiàn)性好、環(huán)境污染小，可大量制備。
為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的天麻素衍生物、其制備方法及其應(yīng)用進行詳細說明，本發(fā)明的保護范圍不受以下實施例的限制。
實施例1KPC-4000006的制備
在一個25ml的雙口燒瓶中加入化合物1(150mg，1.0mmol，1.0eq),化合物2(748mg，1.52mmol，1.5eq)和分子篩(3.0g，4A)，用真空油泵將反應(yīng)裝置內(nèi)部的空氣置換為氮氣，往燒瓶中依次加入二氯甲烷(5.0ml)，將燒瓶置于冰浴中，攪拌30分鐘；用注射器緩緩滴入三氟化硼合乙醚(0.15mL，1.21mmol，1.2eq)；滴加完畢以后繼續(xù)攪拌30分鐘，然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(2小時)；將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(20g)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(20ml×3)；將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化；洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝50％，得到白色固體285mg，產(chǎn)率：59％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.40(d,J＝8.3Hz,1H),7.32(d,J＝2.4Hz,1H),7.24(dd,J＝8.3,2.5Hz,1H),5.29(td,J＝6.6,6.1,3.4Hz,2H),5.13(tt,J＝10.9,5.7Hz,2H),4.24–4.16(m,2H),3.91(ddd,J＝9.0,5.9,2.4Hz,1H),3.12–3.07(m,2H),2.75–2.70(m,2H),2.08–2.00(m,12H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物3。
實施例2KPC-4000007的制備
在一個25ml的雙口燒瓶中加入化合物4(150mg，1.0mmol，1.0eq)，化合物2(748mg，1.52mmol，1.5eq)和分子篩(3.0g，4A)，用真空油泵將反應(yīng)裝置內(nèi)部的空氣置換為氮氣，往燒瓶中依次加入二氯甲烷(5.0ml)，將燒瓶置于冰浴中，攪拌30分鐘；用注射器緩緩滴入三氟化硼合乙醚(0.15mL，1.21mmol，1.2eq)，滴加完畢以后繼續(xù)攪拌30分鐘；然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(2小時)；將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(20g)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(3×20ml)，將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化，洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝50％，得到白色固體183mg，產(chǎn)率：38％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.71(d,J＝8.5Hz,1H),7.03(d,J＝2.1Hz,1H),6.98(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),5.33(d,J＝2.2Hz,1H),5.32–5.30(m,1H),5.23–5.19(m,1H),4.29(dd,J＝12.3,5.4Hz,2H),4.20(dd,J＝12.4,2.5Hz,1H),3.94(ddd,J＝10.2,5.5,2.5Hz,1H),3.14–3.07(m,2H),2.73–2.67(m,2H),2.07–2.02(m,12H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物5。
實施例3KPC-4000008的制備
在一個25ml的雙口燒瓶中加入化合物2(698mg，1.42mmol，1.4eq)，化合物6(150mg，1.01mmol，1.0eq)和分子篩(3.0g，4A)，用真空油泵將反應(yīng)裝置內(nèi)部的空氣置換為氮氣，往燒瓶中依次加入二氯甲烷(5.0ml)，將燒瓶置于冰浴中，攪拌30分鐘，用注射器緩緩滴入三氟化硼合乙醚(0.14ml，1.11mmol，1.1eq)，滴加完畢以后繼續(xù)攪拌30分鐘，然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(2小時)；將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(20克)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(20ml×3)，將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化，洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝40％，得到白色固體192mg，產(chǎn)率：40.7％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ7.42(d,J＝7.7Hz,1H),7.29(t,J＝7.7Hz,1H),7.17(d,J＝7.9Hz,1H),5.32-5.25(m,2H),5.17-5.10(m,2H),4.29-4.12(m,2H),3.88(m,1H),3.09-2.81(m,2H),2.66-2.59(m,2H),2.04-2.00(m,12H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物7。
實施例4KPC-4000009的制備
將化合物3(150mg，0.31mmol，1.0eq)溶在5.0ml甲醇中，氮氣保護下降溫至0℃，分批加入硼氫化鈉(11.8mg，0.31mmol，1.0eq)，然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(1小時)；將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(5克)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(10ml×3)，將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化，洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝50％，得到白色固體92mg，產(chǎn)率：61％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.16(d,J＝8.2Hz,1H),7.06(d,J＝2.3Hz,1H),6.90(d,J＝8.5Hz,1H),5.33–5.24(m,2H),5.22–5.13(m,2H),5.10–5.01(m,1H),4.32–4.15(m,2H),3.89–3.80(m,1H),3.04–2.92(m,1H),2.77(dt,J＝15.5,7.5Hz,1H),2.53(td,J＝12.6,7.3Hz,1H),2.11–2.03(m,12H),1.93(tq,J＝12.2,6.3,5.6Hz,1H),1.80(d,J＝7.3Hz,1H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物8。
實施例5KPC-4000010的制備
將化合物5(135mg，0.28mmol，1.0eq)溶在5.0ml甲醇中，氮氣保護下降溫至0℃，分批加入硼氫化鈉(10.8mg，0.28mmol，1.0eq)，然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(1小時)，將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(5克)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(10ml×3)，將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化，洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝50％，得到白色固體104mg，產(chǎn)率：65％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.33(d,J＝8.4Hz,1H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),5.34–5.26(m,2H),5.26–5.18(m,1H),5.16(d,J＝9.0Hz,1H),5.06(d,J＝6.6Hz,1H),4.29(dd,J＝12.3,5.4Hz,1H),4.18(dd,J＝12.4,2.4Hz,1H),3.90–3.82(m,1H),3.10–2.98(m,1H),2.79(dt,J＝15.6,7.3Hz,1H),2.50(dq,J＝13.5,6.8Hz,1H),2.12–2.02(m,12H),1.98(td,J＝13.7,5.8Hz,1H),1.69(d,J＝6.8Hz,1H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物9。
實施例6KPC-4000011的制備
將化合物7(100mg，0.21mmol，1.0eq)溶在5.0ml四氫呋喃中，氮氣保護下降溫至0℃，分批加入硼氫化鈉(15.8mg，0.42mmol，2.0eq)，然后撤去冰浴，令反應(yīng)液自然升溫至室溫(20℃)，用TLC檢測反應(yīng)進程，直至原料消失(6小時)；將反應(yīng)液緩緩倒入一個盛有碎冰(5克)的燒杯淬滅，待冰塊完全融化，對生成的混合液的水相用乙酸乙酯進行萃取(10ml×3)，將有機相合并，用無水硫酸鈉干燥，將混合物過濾，在旋蒸上除去溶劑，用硅膠柱對粗產(chǎn)物進行純化，洗脫液比例：乙酸乙酯/石油醚＝50％，得到白色固體65mg，產(chǎn)率：65％。
檢測本實施例制備的化合物，檢測結(jié)果如下所示：1H NMR(400MHz,CHLOROFORM-d)δ7.25-7.12(m,2H),6.91(d,J＝7.9Hz,1H),5.33-5.14(m,4H),5.05(d,J＝4.6Hz,1H),4.34-4.12(m,2H),3.94-3.80(m,1H),3.09-2.43(m,2H),2.11-2.02(m,12H),1.99-1.88(m,1H),1.74(d,J＝7.0Hz,1H)。由此表明，本實施例制備的化合物為化合物10。
上述實施例制得的化合物如表1所示：
表1本發(fā)明實施例1～6制備的化合物
實施例7含茚環(huán)類天麻素衍生物對ADP誘導家兔體外血小板聚集抑制率的測定
本發(fā)明采用的試劑皆為普通市售品，皆可于市場購得。
其中，實驗動物：新西蘭家兔，2～3kg體重，雄性，昆明醫(yī)科大學實驗動物研究所提供。
實驗試劑：誘導劑ADP為法國HYPHEN BioMed公司產(chǎn)品；溶劑二甲基亞砜(DMSO)：sigma，批號：BCBM7089V；生理鹽水：規(guī)格250ml/瓶，昆明南疆制藥有限公司出品，批號：A120612I2；
受試樣品：KPC-4000006，KPC-4000007，KPC-4000008，KPC-4000009，KPC-4000010，KPC-4000011共6個樣品；
實驗設(shè)備：雙通道血小板聚集儀：Chrono-log公司，型號：700-2S/N:210N；IMS-70型全自動雪花制冰機，常熟市雪科電器有限公司；其他玻璃儀器及耗材為Chrono-log公司產(chǎn)品；10～1000μl單道手動移液器，Eppendorf公司產(chǎn)品。
供試品按以下方法配制：
化合物(受試樣品溶液)均用DMSO配制成100mmol/L，對應(yīng)的體系(250μL體系，加入樣品2.5μL)終濃度為1mM。
家兔PPP和PRP制備：家兔仰臥固定于手術(shù)臺上，用手感受心臟位置，針頭穿刺心臟取血，用3.8％枸櫞酸鈉溶液以1:9(抗凝劑:血，v/v)的比例抗凝，顛倒混勻后移至新的5ml塑料離心管中，1020rpm(200g)離心10min，待離心機自然停止后取出離心管，小心吸取上清液即為PRP，將剩余的血再次離心，3540rpm(2400g)離心20min，取上清液即為PPP，用PPP調(diào)整PRP血小板計數(shù)為4×108/ml。
操作步驟：以PPP調(diào)零，取PRP 0.25mL(墊高比濁管)加入比濁管，體外實驗同時加入受試樣品溶液，37℃溫育5～10min，分別加入不同誘導劑ADP，在血小板聚集儀上測定血小板聚集性，并記錄10～20min內(nèi)的血小板最大聚集率，并計算血小板聚集抑制率，受試樣品對血小板聚集的抑制率按下式計算，實驗結(jié)果如表2所示，
血小板聚集抑制率(％)＝[1-樣品管聚集百分率/對照管聚集百分率]×100
注：對照管體系：250μL體系，加入溶劑DMSO 2.5μL
表2受試樣品對ADP誘導的家兔血小板聚集率的影響數(shù)據(jù)表(n＝2)
結(jié)果顯示KPC-4000006、KPC-4000007、KPC-4000008、KPC-4000009、KPC-40000010和KPC-40000011六個含茚環(huán)類天麻素衍生物對ADP誘導的家兔血小板聚集抑制率均超過60％，顯示這6個受試樣品均可作為抗血小板聚集的候選藥物。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。