本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑類化合物及其用途，確切地說，涉及該類化合物作為腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑在制備抗腫瘤的藥物方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是威脅人類健康與生命的嚴(yán)重疾病，在中國為主要致死病因之一。尋找和發(fā)現(xiàn)治療與預(yù)防腫瘤的新藥是當(dāng)前世界的熱點研究方向。

Combretastatin A-4(CA-4)是從南非柳樹中分離得到的順式二苯乙烯類天然產(chǎn)物，其化學(xué)名稱為(Z)-2-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)苯酚。CA-4為微管蛋白聚合抑制劑，呈現(xiàn)很強的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性，由于其水溶性差，現(xiàn)已制成前藥CA-4磷酸酯鹽(CA-4P)，并以進(jìn)入三期臨床試驗研究階段。以CA-4為先導(dǎo)化合物進(jìn)行抗腫瘤活性研究目前已經(jīng)有大量報道，但是大多數(shù)合成的新化合物存在活性不夠突出或毒性較大或合成比較困難等缺點。五元雜環(huán)并六元雜環(huán)類化合物作為CA-4類似物已有文獻(xiàn)報道，具有代表性的化合物結(jié)構(gòu)如下所示。(相關(guān)報道參見：Lu Y.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2009,52,1701；Chen J.J.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2010,53,7414；Xiao M.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2013,56,3318；Romagnoli R.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2011,54,5144；Lu Y.,et al.Journal of Medicinal Chemistry,2014,57,7355；Hwang D.J.,et al.ACS Medicinal Chemistry Letter,2015,6,993.)

本發(fā)明涉及的五元雜環(huán)并五元雜環(huán)即3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑類化合物作為抗腫瘤活性化合物的研究目前尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于設(shè)計、合成具有良好的腫瘤細(xì)胞增殖活性的Combretastatin A-4的結(jié)構(gòu)類似物，即3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑類化合物的CA-4類似物；所制備的化合物在體內(nèi)外抗腫瘤活性測試中顯現(xiàn)良好的結(jié)果。

本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)物可用結(jié)構(gòu)通式I來表示：

本發(fā)明優(yōu)選涉及定義如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄為C₁-C₆烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自獨立地為氫、鹵素、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₆烷基氨基、二C₁-C₆烷基氨基。

本發(fā)明優(yōu)選涉及定義如下的通式I的化合物：

其中，通式I中R₂-R₄為C₁-C₄烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自獨立地為氫、鹵素、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₄烷基氨基、二C₁-C₄烷基氨基。

本發(fā)明優(yōu)選涉及定義如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄為C₁-C₃烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自獨立地為氫、氟、氯、溴、碘、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷基氧基、硝基、氨基、C₁-C₃烷基氨基、二C₁-C₃烷基氨基。

本發(fā)明優(yōu)選涉及定義如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄為C₁-C₃烷基氧基，R₁、R₅、R₆各自獨立地為氫、氯、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷基氧基、硝基、氨基。

本發(fā)明優(yōu)選涉及定義如下的通式I的化合物：

其中，通式I中，R₂-R₄為甲氧基，R₁、R₅、R₆各自獨立地為氫、氯、甲基、甲氧基、硝基、氨基。

本發(fā)明的化合物還包括上述結(jié)構(gòu)式所示衍生物所形成的在藥學(xué)上可接受的 無毒鹽及其水合物，這些藥學(xué)上可接受的無毒鹽包括該衍生物與酸所形成的鹽。所述的酸可以為鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸的無機酸或選自乙酸、檸檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、蘋果酸的有機酸。所述水合物的結(jié)晶水?dāng)?shù)目為0～16中的任意實數(shù)。

本發(fā)明優(yōu)選的部分化合物結(jié)構(gòu)如下：

化合物1

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物2

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-氯苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物3

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

化合物4

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4] 三氮唑

化合物5

3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑

發(fā)明的3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑類化合物可以按照以下反應(yīng)路線合成得到：

將相應(yīng)的取代的化合物A加入到茄型瓶中，用乙酸酐作溶劑反應(yīng)2h，TLC檢測原料消失后，將反應(yīng)液倒入冰水中攪拌，析出的固體過濾干燥，然后將其用濃鹽酸-乙醇體系回流；待反應(yīng)完后，將乙醇蒸干，加乙酸乙酯，水洗，將有機層用無水硫酸鈉干燥后蒸干，得終產(chǎn)物B，收率69-84％。

其中，化合物中含有氨基的3,6-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑類化合物可由相應(yīng)的化合物中含有硝基的化合物經(jīng)還原反應(yīng)制備，還原劑為無水三氯化鐵/水合肼/活性炭體系。

具體實施方式

通過下述實例將有助于理解本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不限于所舉實例。

本發(fā)明所用試劑均為市售，所用微波型號為CEM-discover-sp,超聲儀為KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，核磁共振譜由AVANCE-400、Bruker ARX-300、Bruker ARX-400、Bruker ARX-600傅立葉變換核磁共振波譜儀測定，質(zhì)譜由Brukee Esqure 2000、Shimadzu GCMS-QP5050A型質(zhì)譜儀測定。

實施例1：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4] 三氮唑(化合物1)的制備：

將3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲基苯基)-[1,2,4]三氮唑并[3,4-b][1,3,4]噻二嗪0.40g(1mmol)加入到50ml茄型瓶中，用乙酸酐作溶劑反應(yīng)2h，TLC檢測原料消失后，將反應(yīng)液倒入冰水中攪拌，析出的固體過濾干燥，然后將其加入到50ml茄型瓶中，用20ml乙醇溶解，加1ml濃鹽酸，回流反應(yīng)2h；待反應(yīng)完后，將乙醇蒸干，加乙酸乙酯，水洗，將有機層用無水硫酸鈉干燥后蒸干，色譜方法純化，得化合物1；紅棕色固體，收率：81％。M.p.:119-122℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.73(s,1H),7.88(s,2H),7.82(d,J＝8.0Hz,2H),7.25(d,J＝8.0Hz,2H),6.02(s,1H),4.01(s,6H),3.94(s,3H),2.40(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ160.1,153.4(2C),148.4,139.5,139.4,138.4,130.9,129.3(2C),126.0(2C),121.1,103.8(2C),75.0,60.9,56.2(2C),21.3；ESI-MS:m/z＝365.3[M+H]⁺,387.3[M+Na]⁺。

實施例2：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-氯苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物2)的制備：

除了使用相應(yīng)的原料外，以實施例1相同的方法制備化合物2；紅色固體，收率：82％。M.p.:150-151℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.65(s,1H),7.86(s,2H),7.85(d,J＝8.4Hz,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,2H),6.05(s,1H),4.02(s,6H),3.94(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ158.7,153.4(2C),148.4,139.7,139.4,134.3,132.3,128.8(2C),127.3(2C),120.9,103.8(2C),75.3,60.9,56.2(2C)；ESI-MS:m/z＝385.0[M+H]⁺,407.1[M+Na]⁺。

實施例3：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物3)的制備：

除了使用相應(yīng)的原料外，以實施例1相同的方法制備化合物3；紅色固體，收率：84％。M.p.:146-147℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.89(s,1H),7.87(s,2H),7.86(d,J＝8.7Hz,2H),6.97(d,J＝8.7Hz,2H),5.98(s,1H),4.01(s,6H),3.93(s,3H),3.86(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃):δ159.9,159.8,153.4(2C),148.4,139.5,139.3,127.3(2C),126.5,121.2,114.0(2C),103.8(2C),74.6,60.9,56.2(2C),55.3；ESI-MS:m/z＝381.3[M+H]⁺。

實施例4：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-硝基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并 [5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物4)的制備：

除了使用相應(yīng)的原料外，以實施例1相同的方法制備化合物4；黃色固體，收率：76％。M.p.:149-151℃；¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ13.23(s,1H),8.41(d,J＝2.0Hz,1H),8.25(dd,J＝8.8Hz,J＝2.0Hz,1H),7.80(s,2H),7.44(d,J＝8.8Hz,1H),6.50(s,1H),3.97(s,3H),3.93(s,6H),3.76(s,3H)；¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ156.7,153.7(2C),152.3,149.2,139.9,139.4,137.8,131.7,126.9,122.3,121.5,115.2,103.6(2C),75.7,60.7,57.3,56.4(2C)；ESI-MS:m/z＝426.1[M+H]⁺,448.1[M+Na]⁺。

實施例5：3-(3,4,5-三甲氧基苯基)-6-(3-氨基-4-甲氧基苯基)-二芳基-1H-吡唑并[5,1-c][1,2,4]三氮唑(化合物5)的制備：

將0.26g(0.5mmol)化合物4加入到50mL茄型瓶中，加入活性炭20mg和三氯化鐵20mg作催化劑，用無水乙醇作溶劑，攪拌下滴加80％水合肼0.1mL，回流反應(yīng)3小時；TLC檢測反應(yīng)完畢后，過濾除去活性炭，將無水乙醇蒸干，加水，用乙酸乙酯萃取，將有機層合并干燥，減壓蒸餾得到粗品，色譜分離得化合物5；紅棕色固體，收率：69％。M.p.:135-137℃；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.86(s,1H),7.85(s,2H),7.31(s,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,1H),5.95(s,1H),4.00(s,6H),3.92(s,3H),3.89(s,3H)；ESI-MS:m/z＝396.4[M+H]⁺。

實施例6：本發(fā)明的化合物的體外抗腫瘤活性測試

體外活性測試方法和結(jié)果如下：

其中，選用文獻(xiàn)報道的CA-4和臨床常用的抗腫瘤藥物阿霉素(ADM)為陽性對照實驗組。

抗腫瘤活性體外篩選試驗-1

篩選方法：四氮唑鹽(micoculture tetrozolium,MTT)還原法

細(xì)胞株：人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901cell line

作用時間：72h

各化合物10μg/mL劑量下對腫瘤生長的抑制率(％)見表-1。

抗腫瘤活性體外篩選試驗-2

篩選方法：四氮唑鹽(micoculture tetrozolium,MTT)還原法

細(xì)胞株：人口腔上皮癌細(xì)胞株KB cell line

作用時間：72h

各化合物10μg/mL劑量下對腫瘤生長的抑制率(％)見表-1。

抗腫瘤活性體外篩選試驗3

篩選方法：四氮唑鹽(micoculture tetrozolium,MTT)還原法

細(xì)胞株：人纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080cell line

作用時間：72h

各化合物10μg/mL劑量下對腫瘤生長的抑制率(％)見表-1。

實施例7：本發(fā)明的化合物的動物體內(nèi)抗腫瘤活性測試

選擇體外活性較好的化合物2和化合物5進(jìn)行了動物體內(nèi)抗腫瘤活性測試，所用模型為小鼠S-180肉瘤模型，陽性對照藥物為臨床常用的抗腫瘤藥物氟尿嘧啶(Fluorouracil)。

實驗方法：選用18-22克雌性昆明小鼠及生長良好的7-11天的S-180瘤種，將瘤組織制成細(xì)胞懸液，接種至小鼠右側(cè)腋部皮下，約1.0-2.0×10⁶細(xì)胞/只，接種24小時后隨機分籠，腹腔注射給藥連續(xù)7天。停藥后24小時處死動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重，按如下公式求出腫瘤抑制率并進(jìn)行t檢驗。

腫瘤抑制率＝[(空白對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/(空白對照組平均瘤重)]×100％

實驗結(jié)果見表-2。

實施例8：本發(fā)明的化合物的動物體內(nèi)急性毒性初步測試

選擇動物體內(nèi)抗腫瘤活性較好的化合物2和化合物5進(jìn)行了動物體內(nèi)急性毒性測試。

選用18-22克雌性昆明小鼠各10只，分別腹腔注射給藥化合物2、化合物5各500mg/kg后，出現(xiàn)自發(fā)運動抑制，扭體，并對體重增長、攝食量、攝水量的抑制，但未見小鼠死亡。停藥數(shù)日后，存活動物恢復(fù)正常。腹腔給藥的LD₅₀值大于500mg/kg。

表-1

表-2