本發(fā)明涉及基因工程和酶工程的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)是一種能特異性水解許多物質(zhì)末端的L-鼠李糖的糖苷水解酶，例如黃酮類、多糖、類固醇和糖脂等。在一些動物和植物組織、真菌以及細(xì)菌中可以產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶。α-L-鼠李糖苷酶在食品、藥物領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值。主要的功能作用在于：

(1)脫苦作用：柑橘類果汁中過多的苦味物質(zhì)如柚皮苷，阻礙了其市場發(fā)展，為了減少果汁中的柚皮苷含量以提高果汁口感，人們將α-L-鼠李糖苷酶作用于黃酮類苦味物質(zhì)，使其脫去末端的L-鼠李糖，從而大大降低苦味，改進(jìn)果汁品質(zhì)。

(2)生物轉(zhuǎn)化：α-L-鼠李糖苷酶還可以應(yīng)用在黃酮類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，將黃酮類物質(zhì)中的鼠李糖苷水解，從而便捷高效的獲得應(yīng)用價值更高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，如用α-L-鼠李糖苷酶轉(zhuǎn)化柚皮苷制備普魯寧、轉(zhuǎn)化蘆丁制備異槲皮苷。

(3)增加果酒的芳香：酒中含有一些芳香類物質(zhì)的前體單萜如香葉醇、橙花醇等，以帶二糖苷的形式存在，包括鼠李糖等，因此在葡萄酒釀造業(yè)中加入α-L-鼠李糖苷酶，將這些前體物質(zhì)中的糖基水解下來，成為具有香氣的物質(zhì)，具有顯著增香的效果。

由于α-L-鼠李糖苷酶具有良好的應(yīng)用前景，對于該酶的研究受到越來越多的關(guān)注。但是，直接通過原始菌株發(fā)酵生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶，不僅產(chǎn)量不高，而且發(fā)酵液中常常存在分子量大小與α-L-鼠李糖苷酶類似的β-D-葡萄糖苷酶，使得α-L-鼠李糖苷酶的分離純化更加困難和昂貴。本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及應(yīng)用，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來源于塔賓曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆和表達(dá)及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是：

一種編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該序列全長2667bp。

一種由所述α-L-鼠李糖苷酶基因編碼的α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，該序列全長888個氨基酸。

一種含有SEQ ID NO.1所示α-L-鼠李糖苷酶基因的表達(dá)載體。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述表達(dá)載體為pPIC9k表達(dá)載體。

一種含有所述α-L-鼠李糖苷酶基因或含有所述表達(dá)載體的基因工程菌。

作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述基因工程菌為生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的畢赤酵母GS115。

一種所述表達(dá)載體的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、按照真菌鼠李糖苷酶的同源性設(shè)計(jì)簡并引物P1(SEQ ID NO.3)和P2(SEQ ID NO.4)，以黑曲霉菌株(Aspergillus niger)的mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到α-L-鼠李糖苷酶的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物為：

P1：5’-CGTCTGCCTGGACGGCSCNAARMGNGA-3’；

P2：5’-CTATAGTCGACGGCTTATT-3’；

步驟二、將步驟一所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD-18T克隆載體在16℃下過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽性克隆，進(jìn)行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pMD-18T-Rha；

步驟三、通過對鼠李糖苷酶Rha全序列分析，設(shè)計(jì)引物P3(SEQ ID NO.5)和P4(SEQ ID NO.6)；

P3：5’-GAGACCCTAGGATGGCAGCGTTGGAGGA-3’，下劃線表示AvrII酶切位點(diǎn)；

P4：5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACCTCTGACGGCA-3’，下劃線表示NotI酶切位點(diǎn)；

以P3和P4為引物，以步驟二中所得的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，并將擴(kuò)增產(chǎn)物回收與pPIC9k表達(dá)載體酶切，分別用Avr II和Not I酶切，并分別割膠回收，16℃過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，測序，獲得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pPIC9k-Rha。

一種編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因的真核表達(dá)方法，包括以下步驟：

步驟一：將所述表達(dá)載體，經(jīng)Sal I線性化后，采用電轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入畢赤酵母GS115中，篩選出陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

步驟二：將含有重組表達(dá)載體的畢赤酵母GS115接種在YPD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)活化，收集OD600為2.0-3.0的菌體，轉(zhuǎn)入到BMMY培養(yǎng)基中，置于30℃，200rpm搖床進(jìn)行α-L-鼠李糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)；每隔24h按照體積比0.5％向培養(yǎng)基中補(bǔ)加無菌甲醇；同時將含有空白載體pPIC9K的菌株作為空白對照；通過SDS-PAGE分析，判斷有無特異性條帶出現(xiàn)。

一種所述基因工程菌所制備的α-L-鼠李糖苷酶在食品醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用，包括以下應(yīng)用領(lǐng)域：1)柑橘類果汁脫苦；2)制備普魯寧；3)制備鼠李糖；4)增加果汁、果酒的芳香味；5)去除橙子果汁中橙皮苷晶體；6)制備糖苷抗生素。

本發(fā)明有益效果如下：

本發(fā)明首次克隆并重組表達(dá)了塔賓曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶的基因，重組酶Rha具有良好的底物特異性，該酶在酶用量為，pH4.0，60℃的條件下水解300μg/ml的柚皮苷20min，水解效率高達(dá)89.3％。本發(fā)明提供了新的α-L-鼠李糖苷酶基因來源，并可在短時間內(nèi)獲得大量的且不含其他酶活性的α-L-鼠李糖苷酶，降低了α-L-鼠李糖苷酶的生產(chǎn)成本。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重組α-L-鼠李糖苷酶電泳圖：A圖中泳道1為粗酶液、泳道2為陰離子交換層析結(jié)果、泳道3為疏水層析結(jié)果、泳道4為凝膠層析結(jié)果；B圖中泳道1、2均為N-糖苷酶處理結(jié)果；M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；

圖2為本發(fā)明重組α-L-鼠李糖苷酶的最適pH和pH穩(wěn)定性曲線圖；

圖3為本發(fā)明重組α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性曲線圖；

圖4為本發(fā)明重組α-L-鼠李糖苷酶的底物動力學(xué)曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式以對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例一、基因的克隆表達(dá)

1.主要試劑

DNA聚合酶、T4DNA連接酶、DNA marker、克隆載體pMD-18T、限制性內(nèi)切酶(Bln Ⅰ和Not Ⅰ)、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒均購自Takara公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械荣徸陨虾Ｉぃ籖NA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金。RCR引物由北京六合華大基因公司合成；IPTG、氨芐青霉素、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海生工；其它常規(guī)試劑均為化學(xué)分析純。

2.質(zhì)粒和菌株

塔賓曲霉、大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115和pPIC9K均為常規(guī)生物材料。

3.方法

3.1塔賓曲霉接種于活化培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)接于產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)2天，常溫離心收集菌體。從此菌體中獲得總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過P1、P2引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃后延伸10min。通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，并進(jìn)行割膠回收，標(biāo)記為Rha1。

所述引物為：

P1：5’-CGTCTGCCTGGACGGCSCNAARMGNGA-3’；

P2：5’-CTATAGTCGACGGCTTATT-3’。

3.2將上述步驟3.1所得的擴(kuò)增產(chǎn)物連接于pMD-18T克隆載體，導(dǎo)入大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆，測序。獲得含有α-L-鼠李糖苷酶的重組質(zhì)粒pMD-18T-Rha1。

3.3表達(dá)載體的構(gòu)建

以提取的克隆載體為模板，用P3和P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)，72℃后延伸10min。將回收產(chǎn)物酶切連接到pPIC9K表達(dá)載體上，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素的抗性平板和菌落PCR挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒測序。獲得含有α-L-鼠李糖苷酶基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-Rha。

所述引物為：

P3:5’-GAGACCCTAGGATGGCAGCGTTGGAGGA-3’，下劃線表示AvrII酶切位點(diǎn)；

P4:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACCTCTGACGGCA-3’，下劃線表示NotI酶切位點(diǎn)；

3.4α-L-鼠李糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)

提取測序結(jié)果正確的上述陽性克隆質(zhì)粒，Sal Ⅰ線性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液涂布MD篩選平板，20℃培養(yǎng)2-3天，挑選生長良好的單菌落在2mg/ml的YPD平板上篩選，然后采用菌落PCR的方法挑選陽性轉(zhuǎn)化子。將挑選到的陽性克隆接種到BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到2-6，3000rpm/min，4℃離心收集菌體，棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30℃甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度0.5％。同時將空白載體pPIC9k的菌株作為空白對照，并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例二、重組α-L-鼠李糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.1pH對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

在濃度為0.05mol/L的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的Na₂HPO₄-C₄H₂O₇的反應(yīng)體系中測定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100％，其余與之相比，由相對酶活對應(yīng)pH作圖，即得酶反應(yīng)pH對酶活力影響圖；將100μLα-L-鼠李糖苷酶與400μL上述不同pH緩沖液混合后在4℃放置24h測定剩余酶活力，以相對酶活對應(yīng)pH作圖，即得酶的pH穩(wěn)定范圍，結(jié)果如圖2所示。

2.2溫度對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

分別在30、40、50、60、70、80℃下測定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100％，其余與之相比，由相對酶活對應(yīng)溫度作圖，即得酶反應(yīng)溫度對酶活力影響圖；將相同濃度的α-L-鼠李糖苷酶液在上述不同溫度下保溫1h后，測定不同溫度下的酶活力，以相對酶活對應(yīng)溫度作圖，即得酶的溫度穩(wěn)定范圍，結(jié)果如圖3所示。

2.3金屬離子對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

將相同濃度的α-L-鼠李糖苷酶分別與終濃度為1mmol/L和10mmol/L的Na⁺、Ni⁺、K⁺、Ag⁺、Li⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Al³⁺和Fe³⁺離子混勻，于30℃保溫1h后測定剩余酶活，以未加金屬離子的酶液為對照設(shè)酶活為100％，其余與之相比得相對酶活，結(jié)果如表1所示。

表1 金屬離子對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

2.4重組α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性

在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系下，α-L-鼠李糖苷酶分別與濃度為300μg/mL的pNPR、楊梅苷、蕓香苷、柚皮苷和柴胡皂苷C反應(yīng)，計(jì)算其轉(zhuǎn)化率來研究α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性，結(jié)果如表2所示。

表2 重組α-L-鼠李糖苷酶的底物特異性

2.5效應(yīng)物和抑制劑對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

將同一重組α-L-鼠李糖苷酶等量分裝后，與終濃度為1mM及10mM的不同效應(yīng)物混勻，于4℃條件保存24h后測定相對酶活力來研究效應(yīng)物對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響，所選用的效應(yīng)物為L-鼠李糖、葡萄糖、EDTA、SDS、DTT和β-巰基乙醇，結(jié)果如表3所示。

表3 效應(yīng)物和抑制劑對重組α-L-鼠李糖苷酶的影響

2.6重組α-L-鼠李糖苷酶的動力學(xué)研究

將同一酶活力的重組α-L-鼠李糖苷酶與具有濃度梯度的柚皮苷反應(yīng)，利用HPLC法測得各酶促反應(yīng)中α-L-鼠李糖苷酶活力，以底物濃度為橫坐標(biāo)，以酶反應(yīng)速度為縱坐標(biāo)繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，并計(jì)算重組α-L-鼠李糖苷酶Km，Vmax和Kcat等動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

綜上，α-L-鼠李糖苷酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的重組酶分子量為100±10kDa；酶對柚皮苷適宜的反應(yīng)溫度為50-60℃，適宜的反應(yīng)pH為4.0-5.0；在30-60℃保溫1h，能夠保留80％以上的活性；在pH3.0-8.0的范圍內(nèi)4℃保存12h可以保留80％以上的活性；酶對柚皮苷的K_m和K_cat分別為1.27μmol/mL和3445μM·min^–1。

本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。