本發(fā)明涉及一種南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿的提取純化及檢測(cè)方法，屬食品、藥品和化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

南極磷蝦(Euphausia superba Dana)因其生物儲(chǔ)量巨大，含有豐富的天然活性物質(zhì)，廣泛被人們關(guān)注。近年來(lái)，關(guān)于南極磷蝦的研究越來(lái)越熱。南極磷蝦的開(kāi)發(fā)主要集中于南極磷蝦剝殼工藝、脫氟技術(shù)和營(yíng)養(yǎng)及活性成分的研究等方面。南極磷蝦蛋白、酶、脂類(lèi)、蝦青素、甲殼素等均已有不同程度的研究進(jìn)展。隨著南極磷蝦研究的深入，南極磷蝦產(chǎn)品也由初級(jí)的飼料蝦粉等向高端的保健、醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展。加快南極磷蝦研究進(jìn)度有利于我國(guó)在南極磷蝦產(chǎn)業(yè)方面占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

生物堿主要來(lái)自于植物，又稱(chēng)植物堿，具有鎮(zhèn)痛、緩解痙攣、抗菌、消炎、降血壓、平喘、抗腫瘤等功效。動(dòng)物源的生物堿主要來(lái)源于兩棲類(lèi)、海珊瑚、海綿等。雖有推測(cè)南極磷蝦中含有生物堿，但并未清楚生物堿的種類(lèi)，而且目前關(guān)于南極磷蝦中的生物堿還未有相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道。

因此，研究南極磷蝦生物堿的種類(lèi)以及生物堿的提取純化及檢測(cè)方法，對(duì)南極磷蝦資源的開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿提取純化及檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿的提取純化方法，步驟如下：

(1)將南極磷蝦與甲醇接觸而進(jìn)行提取，過(guò)濾，得濾液；濾液蒸發(fā)濃縮得到甲醇膏；

(2)將步驟(1)中的甲醇膏與乙醚接觸而進(jìn)行浸提，過(guò)濾，得乙醚液；乙醚液蒸發(fā)后得到乙醚浸膏；

(3)將步驟(2)中的乙醚浸膏與乙醚接觸而進(jìn)行溶解，得乙醚浸膏液，使其與酸水溶液接觸而進(jìn)行萃取，萃取得到酸水相；

(4)將步驟(3)中的酸水相與氯仿接觸而進(jìn)行萃取，萃取次數(shù)為3～4次，分離得到氯仿層A；

(5)將步驟(4)中的氯仿層A與氫氧化鈉水溶液接觸而進(jìn)行萃取，分離得到堿水層和氯仿層B；

(6)將步驟(5)中的氯仿層B蒸發(fā)除去溶劑，即得到南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿樣品。

步驟(1)中，南極磷蝦在接觸甲醇提取前先經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理。由于南極磷蝦體內(nèi)的酶具有很高的活性，南極磷蝦被捕撈后，其體內(nèi)的內(nèi)源消化酶能高活性的降解蛋白質(zhì)，使死亡后的組織快速分解，加速了南極磷蝦的自溶、腐敗和變質(zhì)；通過(guò)對(duì)南極磷蝦進(jìn)行冷凍干燥預(yù)處理，能夠防止南極磷蝦自溶，有效的保持南極磷蝦的品質(zhì)。

步驟(1)中，所述南極磷蝦與甲醇加入量的比為1g:(6-10)mL，提取溫度為75～85℃，優(yōu)選80℃，甲醇提取的次數(shù)為7～9次，每次浸提的時(shí)間為1-2h，提取方式可以為回流提取或攪拌提取。甲醇回流提取的次數(shù)選為7～9次，能夠盡可能多的分離提取出非酚性弱堿性生物堿。

步驟(2)中，所述甲醇膏與乙醚加入量的比為1g:(4-6)mL，加入乙醚浸提的次數(shù)為4-6次，每次浸提的時(shí)間為0.5-1h。乙醚的提取次數(shù)選為4-6次，不僅有效分離出南極磷蝦中的非酚性弱堿性生物堿，還能盡量減少提取次數(shù)的增加所帶來(lái)的能源浪費(fèi)。

步驟(3)中，不同條件所得乙醚浸膏量不同，乙醚復(fù)溶時(shí)加入乙醚的量可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。一般所述乙醚浸膏與乙醚的加入量比為1g：8～12mL(優(yōu)選1g:10mL)，乙醚膏先用適量乙醚溶解，再與酸水萃取，可以增加與酸水的接觸面積，保證堿性物質(zhì)充分溶于酸水層。

乙醚很容易旋蒸，即便全部整除，花費(fèi)的時(shí)間也較短。其次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用旋蒸保留的乙醚不能使乙醚浸提物全部溶解。

步驟(3)中，所述酸水溶液為硫酸水溶液或者酒石酸水溶液，優(yōu)選的為硫酸水溶液；所述乙醚浸膏液與酸水溶液加入量的體積比為1:(10-30)。所述硫酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％，優(yōu)選的，所述硫酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為2％，選擇該濃度的硫酸水溶液既能保證足夠的酸性以去除酸性雜質(zhì)，又防止硫酸濃度過(guò)高引起目的物的氧化分解。

步驟(4)中，所述酸水相和氯仿的體積比為1～2：1，優(yōu)選的，所述酸水層和氯仿的體積比為1：1。氯仿與酸水相的攪拌萃取次數(shù)為3-4次，每次攪拌萃取時(shí)間為1～1.5h(優(yōu)選攪拌時(shí)間為1h)，充分混勻，盡可能使目標(biāo)物質(zhì)溶于氯仿層。

本發(fā)明的萃取工序的萃取溶劑為氯仿時(shí)，不僅在萃取效率、分液性方面而且在萃取溶劑的易獲得性方面，特別優(yōu)選。

所述氯仿與酸水相的攪拌萃取次數(shù)為3-4次，發(fā)明人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)整限定萃取次數(shù)為3～4次，不僅能盡可能的使目標(biāo)生物堿溶于氯仿層，又能減少其他雜質(zhì)，尤其是己二酸二 辛酯和油酸酰胺的引入。

步驟(5)中，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1～2：1，優(yōu)選的，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1：1。所述氫氧化鈉水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％。

加入氯仿與氫氧化鈉水溶液的攪拌萃取次數(shù)為6-7次，每次攪拌萃取時(shí)間為1～1.5h(優(yōu)選為1h)，充分混勻，盡可能除去弱酸性雜質(zhì)。

發(fā)明人經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將萃取次數(shù)限定為6～7次，能有效的除去步驟(4)引入的少許己二酸二辛酯和油酸酰胺及其他小分子酰胺類(lèi)雜質(zhì)。

本發(fā)明中的攪拌方式為機(jī)械攪拌或磁力攪拌。

本發(fā)明中采用分液漏斗進(jìn)行靜置分液的方式進(jìn)行萃取。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供采用上述提取純化方法制備得到的南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿樣品，其中，所述樣品至少包含兩種非酚性弱堿性生物堿，分別是5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,簡(jiǎn)稱(chēng)DTDP)、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基){Cyclo(Pro-Leu)}。優(yōu)選的，所述樣品還包含吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(苯基甲基){Cyclo(Pro-Phe)}。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種采用上述方法提取的南極磷蝦非酚性弱堿性生物堿的檢測(cè)方法，該方法采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析檢測(cè)，檢測(cè)條件為：DB-1色譜柱；載氣：氦氣；流速：0.8～1.2mL/min，溶劑延遲2～2.2min；升溫程序：初始溫度為45～55℃，以1.8～2.2℃/min升溫到55～65℃，再以25～35℃/min升到240～260℃，保持5～10min。離子化方式:EI，60～80eV；離子源溫度:240～260℃；載氣:氦氣；柱流速：0.8～1.2mL/min。以上條件是在對(duì)被分離檢測(cè)物質(zhì)的種類(lèi)以及性質(zhì)并不明確的情況下，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)與分析，進(jìn)行摸索得到的色譜-質(zhì)譜條件。

優(yōu)選的，為有效分離檢測(cè)提取得到的物質(zhì)成分，所述檢測(cè)條件為：DB-1色譜柱，型號(hào)為30m×0.25mm×0.25μL；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式:EI，70eV；離子源溫度:250℃；載氣:氦氣；柱流速：1.0mL/min。

本發(fā)明中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明采用以上提取純化和檢測(cè)方法，首次發(fā)現(xiàn)三種非酚性弱堿性生物堿，并從南極磷蝦中提取分離得到了三種穩(wěn)定存在的具有較強(qiáng)生物活性的非酚性弱堿性生物堿：5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,簡(jiǎn)稱(chēng)DTDP)；吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮, 六氫-3-(2-甲基丙基){Cyclo(Pro-Leu)}；吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(苯基甲基){Cyclo(Pro-Phe)}。經(jīng)過(guò)本發(fā)明的研究得到，南極磷蝦中主要存在三種非酚性弱堿性生物堿，對(duì)南極磷蝦資源的開(kāi)發(fā)利用具有十分重要的意義。

(2)本發(fā)明針對(duì)南極磷蝦這一特定的海洋原料，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)與分析，探索研究得到一種提取率和純度相對(duì)較高的提取方法，該提取方法簡(jiǎn)單，通過(guò)控制分離步驟的萃取次數(shù)，使得類(lèi)別分離后的粗提物中生物堿相對(duì)含量直接達(dá)到80％以上，能簡(jiǎn)單、高效地去除己二酸二辛酯和油酸酰胺以及其他小分子酰胺類(lèi)雜質(zhì)。

(3)本發(fā)明主要是針對(duì)南極磷蝦非酚性弱堿性生物提取過(guò)程雜質(zhì)的去除，尤其是己二酸二辛脂和油酸酰胺的去除進(jìn)行了研究，這對(duì)優(yōu)化南極磷蝦生物堿提取、簡(jiǎn)化工藝，降低成本有著十分重要的意義。

(4)本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)和分析，選擇了具有一定參數(shù)的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)提取的未知生物堿進(jìn)行分析檢測(cè)，該檢測(cè)方法能有效、準(zhǔn)確的分離和檢測(cè)生物堿的種類(lèi)和含量。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1樣品的GC-MS總離子流色譜圖；

圖2為實(shí)施例2樣品的GC-MS總離子流色譜圖；

圖3為實(shí)施例3樣品的GC-MS總離子流色譜圖。

圖4為對(duì)比例1樣品的GC-MS總離子流色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1

稱(chēng)取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇800ml，80攝氏度回流提取7次，每次1h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，比例為1g：10mL，再加入10倍體積的體積分?jǐn)?shù)為2％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取3次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為2％NaOH水溶液攪拌萃取6次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，得樣品1，約9.98mg。

對(duì)樣品1采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下：

檢測(cè)儀器：Agilent 7890 GC-5975MS；

GC-MS條件：DB-1色譜柱(30m×0.25mm×0.25μL)；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶 劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式:EI，70eV；離子源溫度:250℃；載氣:氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣方式:分流，比例50:1；進(jìn)樣體積:0.2μL。

經(jīng)檢測(cè)，所得樣品1中生物堿成分總相對(duì)含量達(dá)到96.33％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS總離子流色譜圖如圖1所示。所得樣品中主要生物堿成分如下表1。

表1：GC-MS分析樣品1中主要生物堿成分

從表1和圖1可以看出，本實(shí)施例的提取純化方法從南極磷蝦中分離得到了三種穩(wěn)定存在的具有較強(qiáng)生物活性的非酚性弱堿性生物堿，三種生物堿的相對(duì)含量較高，且雜質(zhì)較少。

實(shí)施例2

稱(chēng)取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇1000ml，80攝氏度回流提取8次，每次1.5h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提5次，每次1h,過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，比例為1g：10mL，再加入20倍體積的體積分?jǐn)?shù)為1％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取3次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為1％NaOH水溶液攪拌萃取7次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，得樣品2，約9.87mg。

對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，所得樣品1中生物堿成分總相對(duì)含量達(dá)到86.79％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS總離子流色譜圖如圖2所示。

表2：GC-MS分析樣品1中主要生物堿成分

從表2和圖2可以看出，本實(shí)施例的提取純化方法從南極磷蝦中分離得到了兩種穩(wěn)定 存在的具有較強(qiáng)生物活性的非酚性弱堿性生物堿，兩種生物堿的相對(duì)含量較高，且雜質(zhì)較少。

實(shí)施例3

稱(chēng)取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇600ml，80攝氏度回流提取9次，每次2h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提6次，每次0.5h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，比例為1g：10mL，再加入體積分?jǐn)?shù)為3％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取4次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為3％NaOH水溶液攪拌萃取7次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，得樣品3，約9.76mg。

對(duì)樣品采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，所得樣品1中生物堿成分總相對(duì)含量達(dá)到82.70％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS總離子流色譜圖如圖1所示。

表3：GC-MS分析樣品1中主要生物堿成分

從表3和圖3可以看出，本實(shí)施例的提取純化方法從南極磷蝦中分離得到了三種穩(wěn)定存在的具有較強(qiáng)生物活性的非酚性弱堿性生物堿，三種生物堿的相對(duì)含量較高，且雜質(zhì)較少。

對(duì)比例1

稱(chēng)取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇800ml，80攝氏度回流提取7次，每次1h，至浸提液無(wú)色。過(guò)濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，過(guò)濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加適量乙醚溶解，比例為1g：10mL，再加入10倍體積的體積分?jǐn)?shù)為2％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取6次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為2％NaOH水溶液攪拌萃取6次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，得樣品1，約17.78mg。

對(duì)樣品1采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下：

檢測(cè)儀器：Agilent 7890 GC-5975MS；

GC-MS條件：DB-1色譜柱(30m×0.25mm×0.25μL)；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式:EI，70eV；離子源溫度:250℃；載氣:氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣方式:分流，比例50:1；進(jìn)樣體積:0.2μL。

經(jīng)檢測(cè)，所得樣品中主要非酚性弱堿性生物堿成分如下表4，其主要生物堿成分為5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,簡(jiǎn)稱(chēng)DTDP)、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(2-甲基丙基){Cyclo(Pro-Leu)}、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氫-3-(苯基甲基){Cyclo(Pro-Phe)}；主要雜質(zhì)為油酸酰胺和己二酸二辛酯以及其他小分子酰胺類(lèi)雜質(zhì)。對(duì)GC-MS總離子流色譜圖如圖4所示。

表4：GC-MS分析樣品1中主要生物堿成分

從表4和圖4可以看出，本對(duì)比例的提取方法雖然從南極磷蝦中分離得到了三種穩(wěn)定存在的具有較強(qiáng)生物活性的非酚性弱堿性生物堿，但是雜質(zhì)較多，主要雜質(zhì)為油酸酰胺和己二酸二辛酯以及其他小分子酰胺類(lèi)雜質(zhì)。經(jīng)過(guò)分析，主要原因是酸水相和氯仿萃取的次數(shù)不合適，導(dǎo)致引入較多的油酸酰胺和己二酸二辛酯雜質(zhì)以及其他小分子酰胺類(lèi)雜質(zhì)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。