本發(fā)明涉及一種南極磷蝦5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪的提取純化及檢測(cè)方法，屬食品、藥品和化工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

南極磷蝦(Euphausia superba Dana)，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、磷蝦目，體型較小，一般體長(zhǎng)約5.5～6.0cm，體重約2g左右。南極生物種類較少，但數(shù)量龐大，食物鏈也相對(duì)簡(jiǎn)單。以浮游植物為食的南極磷蝦是鯨、海豹、企鵝等肉食動(dòng)物的主要食物，也是南極食物鏈中的基礎(chǔ)。南極磷蝦是地球上數(shù)量最大繁衍最成功的單種生物資源之一，其生物蘊(yùn)藏量約為6.5×10⁸～10×10⁸噸，最新估算量為3.79×10⁸噸。在糧食短缺，世界漁業(yè)資源萎縮，尤其是中國(guó)近海漁業(yè)開發(fā)過度的情況下，南極磷蝦無疑是一種具有巨大開發(fā)潛力的境外漁業(yè)資源。南極磷蝦營(yíng)養(yǎng)豐富，富含活性物質(zhì)。南極磷蝦蛋白及酶類、蝦青素、甲殼素等均已有研究報(bào)道。隨著南極磷蝦研究的深入，南極磷蝦產(chǎn)品也由初級(jí)的飼料蝦粉等向高端的保健、醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展。加快南極磷蝦研究進(jìn)度有利于我國(guó)在南極磷蝦產(chǎn)業(yè)方面占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,簡(jiǎn)稱DTDP)具有明顯的抗炎、抗腫瘤等作用，多發(fā)現(xiàn)于微生物中，蠐螬、茶葉等也含有DTDP。目前世界上還未有南極磷蝦DTDP的研究報(bào)道。因此研究南極磷蝦中是否含有DTDP以及它的提取和檢測(cè)方法，這對(duì)南極磷蝦的活性物質(zhì)開發(fā)，提高其附加值具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種南極磷蝦5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪的提取純化方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種南極磷蝦5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪的提取純化方法，步驟如下：

(1)將南極磷蝦與甲醇接觸而進(jìn)行提取，過濾，得濾液；濾液蒸發(fā)濃縮得到甲醇膏；

(2)將步驟(1)中的甲醇膏與乙醚接觸而進(jìn)行浸提，過濾，得乙醚液；乙醚液蒸發(fā)后得到乙醚浸膏；

(3)將步驟(2)中的乙醚浸膏與乙醚接觸而進(jìn)行溶解，得乙醚浸膏液，使其與酸水 溶液接觸而進(jìn)行萃取，萃取得到酸水相；

(4)將步驟(3)中的酸水相與氯仿接觸而進(jìn)行萃取，分離得到氯仿層A；

(5)將步驟(4)中的氯仿層A與氫氧化鈉水溶液接觸而進(jìn)行萃取，分離得到堿水層和氯仿層B；

(6)將步驟(5)中的氯仿層B蒸發(fā)除去溶劑，得到預(yù)提取物，使其與石油醚接觸而進(jìn)行浸溶，過濾得到石油醚浸提液；

(7)將步驟(6)中的石油醚浸提液蒸發(fā)除去溶劑，得到5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪。

步驟(1)中，南極磷蝦在接觸甲醇提取前先經(jīng)過冷凍干燥處理。由于南極磷蝦體內(nèi)的酶具有很高的活性，南極磷蝦被捕撈后，其體內(nèi)的內(nèi)源消化酶能高活性的降解蛋白質(zhì)，使死亡后的組織快速分解，加速了南極磷蝦的自溶、腐敗和變質(zhì)；通過對(duì)南極磷蝦進(jìn)行冷凍干燥預(yù)處理，能夠防止南極磷蝦自溶，有效的保持南極磷蝦的品質(zhì)，從而可以有效提取5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪。

步驟(1)中，所述南極磷蝦與甲醇加入量的比為1g:(6-10)mL，提取溫度為75～85℃，優(yōu)選80℃，甲醇提取的次數(shù)為7-9次，每次浸提的時(shí)間為1-2h，提取方式可以為回流提取或攪拌提取。甲醇回流提取的次數(shù)選為7-9次，能夠盡可能多的分離提取出5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪。

步驟(2)中，所述甲醇膏與乙醚加入量的比為1g:(4-6)mL，加入乙醚浸提的次數(shù)為4-6次，每次浸提的時(shí)間為0.5-1h。乙醚的提取次數(shù)選為4-6次，不僅有效分離出南極磷蝦中的5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪，還能盡量減少提取次數(shù)的增加所帶來的能源浪費(fèi)。

步驟(3)中，不同條件所得乙醚浸膏量不同，乙醚復(fù)溶時(shí)加入乙醚的量可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。一般所述乙醚浸膏與乙醚的加入量比為1g：8～12mL(優(yōu)選1g:10mL)，乙醚膏先用適量乙醚溶解，再與酸水萃取，可以增加與酸水的接觸面積，保證堿性物質(zhì)充分溶于酸水層。

乙醚很容易旋蒸，即便全部整除，花費(fèi)的時(shí)間也較短。其次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用旋蒸保留的乙醚不能使乙醚浸提物全部溶解。

步驟(3)中，所述酸水溶液為硫酸水溶液或者酒石酸水溶液，優(yōu)選的為硫酸水溶液；所述乙醚浸膏液與酸水溶液加入量的體積比為1:(10-30)。所述硫酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％，優(yōu)選的，所述硫酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)為2％，選擇該濃度的硫酸水溶液既能保證足夠的酸性以去除酸性雜質(zhì)，又防止硫酸濃度過高引起目的物的氧化分解。

步驟(4)中，所述酸水相和氯仿的體積比為1～2：1，優(yōu)選的，所述酸水層和氯仿的體積比為1：1。氯仿與酸水相的攪拌萃取次數(shù)為6-8次，每次攪拌時(shí)間為1～1.5h(優(yōu)選攪拌時(shí)間為1h)，充分混勻，盡可能使目標(biāo)物質(zhì)溶于氯仿層。

本發(fā)明的萃取工序的萃取溶劑為氯仿時(shí)，不僅在萃取效率、分液性方面而且在萃取溶劑的易獲得性方面，特別優(yōu)選。

步驟(5)中，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1～2：1，優(yōu)選的，所述氯仿層A和氫氧化鈉水溶液的體積比為1：1。所述氫氧化鈉水溶液的體積分?jǐn)?shù)為1～3％。

加入氯仿與氫氧化鈉水溶液的攪拌萃取次數(shù)為6-8次，每次攪拌時(shí)間為1～1.5h(優(yōu)選為1h)，充分混勻，盡可能除去弱酸性雜質(zhì)。

步驟(6)中，所述預(yù)提取物與石油醚的質(zhì)量體積比為1mg:1-3mL，加入石油醚后輕振，浸溶，保證盡可能的使目標(biāo)物質(zhì)溶于石油醚。

從有效的純化的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明優(yōu)選選擇石油醚，使得純化后的DTDP的純度較高。

本發(fā)明中的攪拌方式為機(jī)械攪拌或磁力攪拌。

對(duì)于萃取的具體方法，可列舉出使用公知的萃取方法進(jìn)行萃取，例如可列舉出采用分液漏斗進(jìn)行靜置分液的方式進(jìn)行萃取的方法等。

采用上述提取純化方法制備得到含有5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪的樣品。

本發(fā)明還提供一種采用上述方法提取純化的南極磷蝦5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1′,2′-d]吡嗪的檢測(cè)方法，該方法采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析檢測(cè)，檢測(cè)條件為：DB-1色譜柱；載氣：氦氣；流速：0.8～1.2mL/min，溶劑延遲2～2.2min；升溫程序：初始溫度為45～55℃，以1.8～2.2℃/min升溫到55～65℃，再以25～35℃/min升到240～260℃，保持5～10min。離子化方式:EI，60～80eV；離子源溫度:240～260℃；載氣:氦氣；柱流速：0.8～1.2mL/min。以上條件是本發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)與分析進(jìn)行摸索得到的色譜-質(zhì)譜條件。

優(yōu)選的，為有效分離檢測(cè)提取得到的物質(zhì)成分，所述檢測(cè)條件為：DB-1色譜柱，型號(hào)為30m×0.25mm×0.25μL；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式:EI，70eV；離子源溫度:250℃；載氣:氦氣；柱流速：1.0mL/min。

上述技術(shù)方案中的一個(gè)技術(shù)方案具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明以南極磷蝦為原料，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)南極磷蝦中含有DTDP，并對(duì)南極磷蝦DTDP進(jìn)行了提取、分離和純化，對(duì)南極磷蝦的活性物質(zhì)開發(fā)，提高其附加值具有十分 重要的意義。

(2)本發(fā)明針對(duì)南極磷蝦這一特定的海洋原料，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)與分析，探索研究得到一種提取率和純度相對(duì)較高的提取方法，該提取方法簡(jiǎn)單，得到的5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪純度較高，可達(dá)90％以上。

(3)本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)和分析，選擇了具有一定參數(shù)的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)提取的DTDP進(jìn)行分析檢測(cè)，該檢測(cè)方法能有效、準(zhǔn)確的分離和檢測(cè)出DTDP及其含量。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖；

圖2為實(shí)施例2樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖；

圖3為實(shí)施例3樣品的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇800ml，80攝氏度回流提取7次，每次1h，至浸提液無色。過濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，過濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加10倍體積乙醚溶解，再加入10倍體積的體積分?jǐn)?shù)為2％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取3次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為2％NaOH水溶液攪拌萃取6次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，加入1:1(mg:mL)體積的石油醚浸溶得樣品1，約3.47mg。

對(duì)樣品1采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件如下：

檢測(cè)儀器：Agilent 7890GC-5975MS；

GC-MS條件：DB-1色譜柱(30m×0.25mm×0.25μL)；載氣：氦氣；流速：1mL/min，溶劑延遲2.06min；升溫程序：初始溫度為50℃，以2℃/min升溫到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。離子化方式:EI，70eV；離子源溫度:250℃；載氣:氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣方式:分流，比例50:1；進(jìn)樣體積:0.2μL。

樣品1經(jīng)GC-MS檢測(cè)，在保留時(shí)間11.882min處的色譜峰檢索匹配物質(zhì)為5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪，其相對(duì)含量占88.82％。圖1為對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖。

實(shí)施例2

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇1000ml，80攝氏度回流提取8次，每次1.5h，至浸提液無色。過濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提5次，每次1h,過濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加10倍體積乙醚溶解，再加入20倍體積的體積分?jǐn)?shù)為1％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取4次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為1％NaOH水溶液攪拌萃取7次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，加入1:2(mg:mL)體積石油醚浸溶得樣品2，約3.56mg。

對(duì)樣品2采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)GC-MS處檢測(cè)，在保留時(shí)間11.850min處的色譜峰檢索匹配物質(zhì)為5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪，其相對(duì)含量占90.02％。圖2為對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖。

實(shí)施例3

稱取100g冷凍干燥的南極磷蝦，加入甲醇600ml，80攝氏度回流提取9次，每次2h，至浸提液無色。過濾，濾液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提6次，每次0.5h，過濾得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸濃縮后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加10倍體積乙醚溶解，再加入體積分?jǐn)?shù)為3％的H₂SO₄水溶液攪拌萃取，分液得酸水層。向酸水層加入等體積的氯仿攪拌萃取3次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層A。向氯仿層A中加入等體積的體積分?jǐn)?shù)為3％NaOH水溶液攪拌萃取7次，每次攪拌1h，靜置后分液得氯仿層B。氯仿層B蒸干氯仿后，加1:3(mg:mL)倍體積石油醚浸溶得樣品3，約3.52mg。

對(duì)樣品3采用GC-MS法對(duì)物質(zhì)成分進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法同實(shí)施例1。經(jīng)檢測(cè)，在保留時(shí)間11.859min處的色譜峰檢索匹配物質(zhì)為5,10-二甲氧基-2,3,7,8-四氫-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪，其相對(duì)含量占88.56％。圖3為對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜及結(jié)構(gòu)圖。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。