本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體的涉及一種兼具抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性的二甲雙胍偶聯(lián)物的制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，約80%的腫瘤患者主要的死亡原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移近。統(tǒng)計資料顯示直腸癌在手術(shù)切除后5年內(nèi)，尚有50%的患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，肝癌在根治性切除后5年內(nèi)，仍有60%-70%的患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，60%的宮頸癌患者存在盆腔轉(zhuǎn)移，60%-70%的卵巢癌患者也存在多處轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移的過程涉及到細(xì)胞從原發(fā)灶點脫落、浸潤相鄰組織、降解細(xì)胞外基質(zhì)、遷移運動以及新生血管生成等過程。從理論上來說，只要能夠有效干預(yù)以上這些環(huán)節(jié)中的某個或某些過程，就有望對腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生顯著的抑制作用。隨著對腫瘤轉(zhuǎn)移過程的了解和深入,近年來人們一直致力于新型抗腫瘤藥物的研究，其中有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物是一個新的藥物開發(fā)方向。相對于傳統(tǒng)化學(xué)合成藥物, 開發(fā)天然藥物具有資金投入少、研究周期短、篩選效率高等優(yōu)點。因此越來越多的新的化學(xué)實體和各種天然化合物被廣大科研工作者所發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用到抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展過程中。

熊果酸(ursolicacid, UA)即3β-羥基-熊果-12-烯-28-酸(3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid，UA)，又名烏索酸，是一種五環(huán)三萜類化合物，其相對分子量為456.68，分子式為C₃₀H₄₈O₃，具有抗癌、肝損傷保護(hù)、抗菌消炎和抗病毒等多方面的藥理學(xué)活性，綜述了近十年來熊果酸在癌的化學(xué)預(yù)防和治療領(lǐng)域的新進(jìn)展。熊果酸毒性小，抗腫瘤譜廣，資源豐富，很可能會成為新的抗腫瘤藥。但是UA的水溶性差，導(dǎo)致其制劑制備困難和體內(nèi)生物利用低等問題，因此通過對UA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以提高難溶性UA的溶解度，從而進(jìn)一步提高其抗癌活性，并有效改善其生物利用度，正日益成為科研工作者研究的熱點和難點。過去的十年中，熊果酸及其衍生物在抗腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究越來越深入，研究表明熊果酸可以通過抑制腫瘤血管新生、降低腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)降解、削弱癌細(xì)胞的粘附能力以及影響轉(zhuǎn)移過程中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個層面來抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，因此熊果酸及其衍生物可以被用來控制多種腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本課題組專利N 201510466210.4首次公開了將熊果酸及其衍生物和阿司匹林偶聯(lián)物ASP-UA，對熊果酸進(jìn)行改性并將用ASP-UA于治療預(yù)防乳腺癌轉(zhuǎn)移中。本課題組專利N 201410189256.1也公開了熊果酸衍生物（US597）對腫瘤細(xì)胞的增殖、粘附、遷移等具有顯著的抑制作用。

UA1，結(jié)構(gòu)如式III所示，該化合物可明顯改善UA的溶解度，理化性質(zhì)更加穩(wěn)定；此外跟UA對比，其對不同種類腫瘤細(xì)胞均具有更顯著的增殖抑制作用，且對正常細(xì)胞毒性較低，提示其具有安全、高效和低毒的特點，可望將其應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期預(yù)防和治療中。

二甲雙胍（Metformin，簡稱Met），其相對分子量為129.10，分子式為C₄H₁₁N₅，被認(rèn)為是胰島素增敏劑之一，二甲雙胍作為治療Ⅱ糖尿病經(jīng)典而有效的藥物，已有近50年的臨床應(yīng)用歷史，還用于治療多囊卵巢綜合癥、假性黑棘病等。二甲雙胍為強(qiáng)水溶性性藥物，口服后主要在小腸吸收，生物利用度為50-60%左右。目前二甲雙胍在各國的糖尿病治療指南中均被推薦為首選用藥，且無禁忌癥，它的作用機(jī)理不同于其他類型的口服抗血糖藥，它可減少肝糖的產(chǎn)生，降低小腸對糖的吸收，并且還可增加外周糖的攝取和利用，從而提高胰島素的敏感性，它在糖尿病治療中的威望也與日俱增，成為全球抗擊糖尿病的核心藥物。專利N201310069025.2首先公開了一種二甲雙胍的新用途，證明了二甲雙胍能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。

本發(fā)明首次將以熊果酸及其衍生物為先導(dǎo)物，利用化學(xué)修飾的方法對熊果酸及其衍生物的C-28位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，選用兼具多種生物學(xué)效應(yīng)的含胍基類的藥物進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，制得抗癌前藥:二甲雙胍-熊果酸及其衍生物，期望得到的新化合物能起到全面的、兩者協(xié)同的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，提高熊果酸及其衍生物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，提高熊果酸及其衍生物的生物利用度，同時能夠降低兩者的毒副作用，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移方面的應(yīng)用提供兩者協(xié)同作用理論研究基礎(chǔ)。以A549、HepG2、LO2和HELF細(xì)胞作為研究對象，通過二甲雙胍和熊果酸的偶聯(lián)及二甲雙胍和UA1的偶聯(lián)，對A549、HepG2、LO2和HELF進(jìn)行體外抗轉(zhuǎn)移、侵襲、增殖等活性測試，結(jié)果表明，UA-Met及UA1-Met均能有效癌癥的遷移。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一種兼具抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移活性的二甲雙胍偶聯(lián)物的制備及其應(yīng)用，其特征在于其結(jié)構(gòu)如式I或II所示：

I;

II。

UA-Met偶聯(lián)物（式I）的制備方法如下：

a)UA和DCC用四氫呋喃攪拌溶解；

b)NHS用乙腈攪拌溶解，于冰浴上逐滴加入到a溶液中；

c)反應(yīng)24h后，待UA反應(yīng)完全后，過濾除去不溶物，過柱純化的活化后的UA純品；

d)活化后的UA和鹽酸二甲雙胍用乙醇攪拌溶解，于室溫下反應(yīng)24h，過柱純化得到UA-Met偶聯(lián)物純品。

UA1-Met偶聯(lián)物（式II）的制備方法如下：

a)二氯甲烷，吡啶，熊果酸，醋酸酐，少量DMAP，室溫磁力攪拌過夜；

b)向a中補(bǔ)充加入二氯甲烷，用1N HCl溶液萃取有機(jī)層兩次，收集有機(jī)層；

c)與b步驟相同，用飽和NaHCO₃溶液萃取b得到的有機(jī)層2次，最后分出有機(jī)層。

d)向c中得到的有機(jī)層中加入無水硫酸鈉充分?jǐn)嚢韪稍铮?，過濾；

e)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得粗品。

f)柱層析純化得純白色粉末UA1。

g)UA1和DCC用四氫呋喃攪拌溶解；

h)NHS用乙腈攪拌溶解，于冰浴上逐滴加入到g溶液中；

i)反應(yīng)24h后，待UA1反應(yīng)完全后，過濾除去不溶物，過柱純化的活化后的UA1純品；

j)活化后的UA1和鹽酸二甲雙胍用乙醇攪拌溶解，于室溫下反應(yīng)24h，過柱純化得到UA1-Met偶聯(lián)物純品。

附圖說明

圖1.偶聯(lián)物UA-Met紅外表征圖譜；

圖2.偶聯(lián)物UA-Met質(zhì)譜圖譜；

圖3.偶聯(lián)物UA-Met作用24h后對不同細(xì)胞株的增殖抑制作用；

圖4.偶聯(lián)物UA-Met作用48h后對不同細(xì)胞株的增殖抑制作用；

圖5.偶聯(lián)物UA-Met作用72h后對不同細(xì)胞株的增殖抑制作用；

圖6.偶聯(lián)物UA1-Met作用24h后對不同細(xì)胞株的增殖抑制作用；

圖7.偶聯(lián)物UA-Met作用24h對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲能力的影響；

圖8.偶聯(lián)物UA-Met作用24h對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲的抑制率；

圖9.偶聯(lián)物UA1-Met作用24h對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲能力的影響；

圖10.偶聯(lián)物UA1-Met作用24h對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲的抑制率；

圖11.偶聯(lián)物UA-Met作用24、48、72h后對非小細(xì)胞肺癌A549遷移能力的影響；

圖12.偶聯(lián)物UA-Met作用24h對非小細(xì)胞肺癌A549遷移的抑制率；

圖13.偶聯(lián)物UA-Met作用48h對非小細(xì)胞肺癌A549遷移的抑制率；

圖14.偶聯(lián)物UA-Met作用72h對非小細(xì)胞肺癌A549遷移的抑制率。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1

室溫下，200mg的UA(熊果酸)和181mg的DCC用3ml的THF攪拌溶解；反應(yīng)瓶在冰浴上逐滴加入事先用1.7ml乙腈溶解的101mg NHS。室溫下攪拌反應(yīng)24h，待UA反應(yīng)完全后，過濾除去不溶物，減壓蒸除溶劑，柱層析得活化后的UA純品。取100mg活化后的UA純品和30mg的Met用5 ml的甲醇攪拌溶解，室溫下反應(yīng)24 h后，減壓蒸除溶劑，柱層析得UA-Met純品。

結(jié)果如圖1-2所示。

實施例2

①250mL圓底燒瓶，加入二氯甲烷20ml，吡啶20ml，熊果酸1g，醋酸酐3.5mL。加少量DMAP，室溫磁力攪拌過夜；

②向①瓶中補(bǔ)充加入100ml二氯甲烷，分別用100mL 1N HCl 溶液萃?、诘玫降挠袡C(jī)層2次，收集有機(jī)層；

③與②步驟相同，分別用飽和NaHCO₃溶液萃?、诘玫降挠袡C(jī)層2次，每次用量100mL，最后分出有機(jī)層；

④向③中得到的有機(jī)層中加入無水硫酸鈉充分?jǐn)嚢韪稍铮s4勺），過濾；

⑤旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑，得粗品；

⑥柱層析純化得純白色UA1；

⑦室溫下，200mg的UA1和170.9mg的DCC用3ml的THF攪拌溶解；反應(yīng)瓶在冰浴上逐滴加入事先用1.7ml乙腈溶解的95.5mg NHS，室溫下攪拌反應(yīng)24h；

⑧待UA1反應(yīng)完全后，過濾除去不溶物，減壓蒸除溶劑，柱層析得活化后的UA1純品；

⑨取100mg活化后的UA1純品和28.6mg的Met用5ml的甲醇攪拌溶解，室溫下反應(yīng)24h后；

⑩減壓蒸除溶劑，柱層析得UA1-Met純品。

實施例3

將實施例1 所得的純品進(jìn)行氫譜1H NMR檢查為UA-Met

1H NMR(400MHz,Chloroform-d,ppm):δ=8.53(s,1H),5.32(s,1H),4.02(s,1H),3.60 (pd,J=7.0,5.0Hz,1H),2.87(s,6H),2.09-1.86(m,2H),1.84-1.39(m,10H),1.37-1.26(m,2H),1.31-1.18(m,3H),1.22-1.00(m,3H),1.04-0.89(m,16H),0.83(s,3H),0.78(s,3H).

實施例4

抗癌活性實驗通過細(xì)胞毒性來實現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測定了偶聯(lián)藥UA-Met對不同細(xì)胞株增殖抑制活性。具體步驟為：將對數(shù)期的細(xì)胞，用胰酶消化后，細(xì)胞計數(shù)，配成5×10⁴-1×10⁵/ml的細(xì)胞濃度，將制得的細(xì)胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板，放于37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄掉舊的培養(yǎng)基，加入配制好的不同濃度樣品，藥物作用24、48和72 h 后，吸棄含藥培養(yǎng)基，于每孔中加入100 μL稀釋好的MTT溶液（0.5 mg/ml MTT的母液:無血清無酚紅培養(yǎng)基=1：9），繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)；小心吸棄96孔板孔內(nèi)上清液，每孔加入100 μL DSMO，振蕩10 min，于570 nm 波長處在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值（OD值），計算細(xì)胞成活率（%）=（用藥組平均OD值/空白對照組平均OD值）×100%。用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果見下圖3-5。

實驗結(jié)果如圖3-5所示，熊果酸給藥組、二甲雙胍給藥組、UA-Met給藥組作用于多種細(xì)胞株24、48和72 h之后，熊果酸給藥組對多種細(xì)胞株具有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性和時間依賴性，在>25 μM的條件下能有效的抑制A549和HepG2兩株癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞死傷達(dá)一半，但對HELF和LO2兩株正常細(xì)胞株表現(xiàn)出很大的細(xì)胞毒性，殺傷癌細(xì)胞的同時也殺傷了正常的組織細(xì)胞；二甲雙胍在≤100 μM的條件下，對多種細(xì)胞株沒有殺傷，不能抑制細(xì)胞的增殖；UA-Met給藥組對多種細(xì)胞株也有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性和時間依賴性，但在>50 μM的條件下能有效的抑制A549和HepG2兩株癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞死傷達(dá)一半；但與熊果酸相比明顯的降低了對HELF和LO2兩株正常細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。綜上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，UA-Met能夠明顯降低UA對正常細(xì)胞株的毒副作用，且呈濃度依賴性和時間依賴性的抑制癌細(xì)胞的增殖。

實施例5

抗癌活性實驗通過細(xì)胞毒性來實現(xiàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)MTT 比色法測定了偶聯(lián)藥UA1-Met對不同細(xì)胞株的增殖抑制活性。步驟如實施例4，結(jié)果如圖6所示。

實驗結(jié)果如圖6所示，當(dāng)UA1給藥組、二甲雙胍給藥組、UA1-Met給藥組作用于多種細(xì)胞株24、48、72 h之后，UA1給藥組熊果酸給藥組對多種細(xì)胞株具有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性和時間依賴性，在>25 μM的條件下能有效的抑制A549和HepG2兩株癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞死傷達(dá)一半，但對HELF和LO2兩株正常細(xì)胞株表現(xiàn)出很大的細(xì)胞毒性，殺傷癌細(xì)胞的同時也殺傷了正常的組織細(xì)胞；二甲雙胍在≤100 μM的條件下，對多種細(xì)胞株沒有殺傷，不能抑制細(xì)胞的增殖；UA1-Met給藥組對多種細(xì)胞株也有不同程度的增殖抑制作用，并呈濃度依賴性和時間依賴性，但在>50 μM的條件下能有效的抑制A549和HepG2兩株癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞死傷達(dá)一半；但與UA1相比明顯的降低了對HELF和LO2兩株正常細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。綜上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，UA1-Met能夠明顯降低UA1對正常細(xì)胞株的毒副作用，且呈濃度依賴性和時間依賴性的抑制癌細(xì)胞的增殖。

實施例6

熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及UA-Met的使用對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲能力的影響。

A549細(xì)胞先加無血清無酚紅培養(yǎng)基饑餓過夜，消化、離心收集的細(xì)胞用空白培養(yǎng)基懸浮。取12孔板，在小室的上室中加入500 μL用空白的培養(yǎng)基配制好的不同濃度樣品的細(xì)胞懸浮液 (約5×10⁵/孔)，下室加500 μL含10%小牛血清的培養(yǎng)基，藥物作用24 h后，取出小室，用4%的多聚甲醛固定20 min，用棉簽擦掉上層未遷移細(xì)胞，用PBS洗3次，用0．1％結(jié)晶紫染色30 min，用PBS洗三次，將小室的底膜取下，用甘油封片保存，倒置顯微鏡下隨機(jī)5個視野下拍照，結(jié)果見下圖7、8。

實驗結(jié)果如圖7、8 所示熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及UA-Met作用24 h后對A549細(xì)胞侵襲能力的檢測，結(jié)果表明,空白對照組、熊果酸和二甲雙胍單獨使用組，穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于UA-Met給藥組且呈濃度依賴性的抑制細(xì)胞的侵襲，特別是在UA-Met≥20 μM的條件下，穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯的減少很多，UA-Met可以明顯的抑制細(xì)胞的侵襲能力。

實施例7

UA1和二甲雙胍單獨使用以及UA1-Met的使用對非小細(xì)胞肺癌A549侵襲能力的影響。

步驟如實施例6所示，結(jié)果如圖9、10所示。

實驗結(jié)果如圖9、10 所示UA1和二甲雙胍單獨使用以及UA1-Met作用24 h后對A549細(xì)胞侵襲能力的檢測，結(jié)果表明,空白對照組、熊果酸和二甲雙胍在低濃度的條件下，穿過微孔濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于UA1-Met給藥組且呈濃度依賴性的抑制細(xì)胞的侵襲，UA1-Met可以明顯的抑制細(xì)胞侵襲能力。

實施例8

UA-Met藥物對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響。

先用記號筆在12孔板板背部1/4、1/2和3/4處水平劃3條直線再進(jìn)行細(xì)胞接種，取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(約4×10⁶/孔)接種于該板中，置于37℃,5% CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞接近融合后，用200 μl移液槍槍頭垂直于三條平行線方向劃線，用PBS清洗細(xì)胞3次；加入用無血清無酚紅培養(yǎng)基（含2%胎牛）配制好的不同濃度樣品，藥物作用24、48和72 h并拍照，記錄下所拍圖片的坐標(biāo)軸，培養(yǎng)24、48、72 h后，同一部位再次拍照，測定遷移距離，對比各組兩次拍照的遷移距離，結(jié)果見下圖11-14。

實驗結(jié)果如圖11-14所示熊果酸和二甲雙胍單獨使用以及UA-Met作用24、48和72 h后對A549細(xì)胞遷移抑制率檢測，結(jié)果表明：在0h，給藥干預(yù)組與空白對照組對比遷移距離無明顯影響；經(jīng)給藥24 h后，空白對照組，熊果酸和二甲雙胍單獨使用時，細(xì)胞明顯發(fā)生了遷移，劃痕距離變窄；UA-Met作用組，在1 μM的條件下，細(xì)胞的劃痕愈合也發(fā)生了明顯的遷移，但隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞的遷移能力受到了顯著抑制，劃痕距離明顯沒那么窄；經(jīng)給藥48 h后，24 h的結(jié)果相比，空白對照組，熊果酸和二甲雙胍單獨使用時，劃痕寬度也明顯減小很多；UA-Met作用組在≥5 μM的條件下可以明顯的抑制了A549細(xì)胞的遷移，而且表現(xiàn)出濃度依賴性，隨著藥物濃度的增大遷移距離明顯減少；經(jīng)給藥72 h后，空白對照組，熊果酸和二甲雙胍單獨使用時，細(xì)胞劃痕距離已經(jīng)趨于閉合，劃痕寬度發(fā)生了很明顯的變化，而UA-Met給藥組在≥5 μM的條件下也能夠明顯抑制了A549細(xì)胞的遷移，且表現(xiàn)出濃度依賴性，特別是當(dāng)UA-Met在20 μM的條件下的細(xì)胞劃痕寬度和0 h的空白對照組相比，遷移距離變化不明顯，細(xì)胞間的間隙增大，細(xì)胞零零散散的分布，細(xì)胞數(shù)明顯的減少很多。