技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂的制備方法。
背景技術(shù)：
磷脂是含有磷酸的類脂化合物，普遍存在于生物體細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中，對(duì)維持細(xì)胞膜功能進(jìn)而維持細(xì)胞代謝起關(guān)鍵作用。磷脂按其分子結(jié)構(gòu)可分為甘油醇磷脂和鞘磷脂兩大類。甘油醇磷脂主要包括卵磷脂、腦磷脂、絲氨酸磷脂、肌醇磷脂等。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能低下帶來的疾病，如焦躁不安、食欲不振、耳鳴、性無能力、神經(jīng)性下痢、習(xí)常性便秘以及神經(jīng)傳達(dá)物質(zhì)缺乏所帶來的癡呆癥和內(nèi)存力減退，每天充分地補(bǔ)充卵磷脂，會(huì)收到很好的療效。有研究發(fā)現(xiàn)用卵磷脂飼育懷孕的大鼠，其后代在智力測(cè)驗(yàn)（迷宮測(cè)試）中，記憶力顯著優(yōu)于未飼育卵磷脂的大鼠的后代。1997年第七屆卵磷脂國際會(huì)議曾作出結(jié)論：“建議懷孕婦女服用適量的卵磷脂，這對(duì)于幼兒的智力發(fā)育是很重要的?！?1998年卵磷脂被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)列為世界五大營養(yǎng)食品之一；1999年美國食品與藥物管理委員會(huì)（FDA）明確規(guī)定，所有的嬰兒食譜中都要適量補(bǔ)充卵磷脂。
目前磷脂主要來源于植物，市售的磷脂主要含有棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸等含16或18個(gè)碳原子的飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸。然而除了這些脂肪酸之外，人體還需要補(bǔ)充多不飽和脂肪酸，如亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸等。二十二碳六烯酸在大腦中的濃度很高，被認(rèn)為在視覺、認(rèn)知功能和其他正常的腦功能的發(fā)展上發(fā)揮至關(guān)重要的作用。花生四烯酸是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最豐富，也是最活躍的一種多不飽和脂肪酸，它不僅對(duì)人體的健康有極為重要的意義，對(duì)嬰幼兒的正常發(fā)育也至關(guān)重要，花生四烯酸還具有預(yù)防心血管疾病、免疫調(diào)節(jié)、輔助抑制腫瘤、預(yù)防癌變和調(diào)節(jié)神經(jīng)的功能，可預(yù)防和治療高血壓、糖尿病、肥胖癥和病毒感染等疾病。
與甲酯/乙酯型或甘油三酯型多不飽和脂肪酸相比，磷脂型多不飽和脂肪酸不但具有生物利用度高、安全性高及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)，還能同時(shí)為機(jī)體提供豐富的磷脂，對(duì)大腦的發(fā)育起到1+1>2的效果。有研究表明，人體對(duì)乙酯型二十二碳六烯酸的消化吸收率只有21%，而對(duì)磷脂型二十二碳六烯酸的消化吸收率超過99%。蛋黃中的二十二碳六烯酸與蛋黃中的卵磷脂緊密結(jié)合在一起，與卵磷脂一起被人體消化吸收，特別適合孕產(chǎn)婦和嬰幼兒食用。
中國專利公開號(hào)為CN103509047A的發(fā)明專利公開了一種南極磷蝦來源的磷脂酰膽堿的提取工藝和磷脂酰絲氨酸的制備方法。該方法通過收集南極磷蝦頭并通過煎煮攪拌提取等一系列工藝獲得二十二碳六烯酸含量為7.6-8.1 %，二十碳五烯酸含量為14.6-15.6%的磷脂產(chǎn)品。這種方法的弊端在于：原材料來源有較大限制，煎煮等工序會(huì)損耗大量的多不飽和脂肪酸，且對(duì)南極磷蝦的大肆捕撈會(huì)對(duì)環(huán)境造成破壞。
中國專利公開號(hào)為CN101195637B的發(fā)明專利公開了一種制備富含多不飽和脂肪酸磷脂的工藝，該方法主要通過酶對(duì)大豆卵磷脂和富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的游離脂肪酸進(jìn)行酯交換催化反應(yīng)，從而獲得富含多不飽和脂肪酸的磷脂。但是這種方法制得的磷脂中，二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量較低。而且這種方法需要使用酶制劑，因此終產(chǎn)品的應(yīng)用范圍會(huì)受到限制。
綜上，提供一種有益環(huán)境的，可持續(xù)發(fā)展的，具有更廣應(yīng)用范圍的富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂及其制備方法實(shí)為必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能滿足產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)需求的、富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂的制備方法，包括如下步驟：（1）發(fā)酵獲得富含多不飽和脂肪酸的微生物，（2）對(duì)微生物進(jìn)行破壁提取，獲得微生物油脂，（3）富集微生物油脂中的磷脂，純化后得到富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂。
本發(fā)明的富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂的制備方法具有以下有益效果：1、整個(gè)制備方法以天然來源的微生物油脂為原料，因此原料不受限制，2、制備的磷脂型多不飽和脂肪酸微生物油脂中多不飽和脂肪酸含量高，3、與現(xiàn)有酶法合成的磷脂型多不飽和脂肪酸相比，更安全，應(yīng)用范圍更廣泛。
進(jìn)一步的，步驟（3）中，用低溫靜置、溶劑洗脫、超臨界萃取、膜分離法、水或蒸汽實(shí)施富集。這些富集的手段符合食品安全的相關(guān)規(guī)定。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1
以裂殖壺菌作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含二十二碳六烯酸的微生物發(fā)酵液;
(2) 將上述發(fā)酵液經(jīng)膜分離后，得到含水量為68%的濃縮發(fā)酵液，取6L該濃縮發(fā)酵液，加入3ml的堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8.0，升溫至45℃保溫4h進(jìn)行破壁，再用10L正己烷進(jìn)行提取。得到的提取液用1um濾棒過濾，脫溶得到共計(jì)511g微生物油脂；
(3) 取450g上述微生物油脂，加入450ml己烷，降溫至0℃處理2h，然后在0.2MPa的環(huán)境下，用0.2um孔徑陶瓷膜保溫微濾，將膜截留得到的半固體經(jīng)薄膜蒸發(fā)得到11g富含磷脂型二十二碳六烯酸的微生物油脂。此步驟為同時(shí)對(duì)磷脂進(jìn)行富集和純化處理的工藝。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂的磷脂含量為69.7%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（二十碳四烯酸，二十碳五烯酸,二十二碳六烯酸,二十二碳五烯酸之和）為79%。
實(shí)施例2
以微球藻作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含二十碳五烯酸的微生物菌體的發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)處理后獲得富含二十碳五烯酸的干菌體;
(2) 取1kg上述干菌體用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎破壁，加入1kg含量為 95%的乙醇作為夾帶劑，用超臨界CO2在溫度為40℃，壓力為30Mpa的條件下提取2h，提取次數(shù)為2次。將得到的提取液用1um濾棒過濾，然后在40℃，25Mpa的條件下分離得到357g微生物油脂;
(3) 取300g上述微生物油脂，用超臨界CO2萃取，在溫度50℃，壓力35Mpa條件下萃取5h，然在50℃，28MPa的條件分離得到19g富含磷脂型花生四烯酸的微生物油脂。此步驟為同時(shí)對(duì)磷脂進(jìn)行富集和純化處理的工藝。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂中磷脂含量為41.8%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（花生四烯酸和二十碳五烯酸之和 ）為38.1%。
實(shí)施例3
以雙鞭甲藻作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含二十二碳六烯酸的微生物發(fā)酵液;
(2) 將上述發(fā)酵液離心，得到含水量為73%的濃縮發(fā)酵液，取50L該濃縮發(fā)酵液，加入50ml堿性蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值至8.0，升溫至50℃保溫3h進(jìn)行破壁，再用100L正己烷進(jìn)行提取，提取液用1um濾棒過濾，脫溶得到共計(jì)4168g微生物油脂;
(3) 取3kg上述微生物油脂，加入9000ml正己烷，加入200g純水，在35-40℃，0.15MPa的環(huán)境下，用0.2um孔徑陶瓷膜微濾，將膜截留得到的半固體經(jīng)薄膜蒸發(fā)得到230g富含磷脂型二十二碳六烯酸的微生物油脂。此步驟為同時(shí)對(duì)磷脂進(jìn)行富集和純化處理的工藝。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂的磷脂含量為58%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸之和）為43.1 %。
實(shí)施例4
以高山被孢霉作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含花生四烯酸的微生物菌體的發(fā)酵液，對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行處理后，獲得含花生四烯酸的干菌體;
(2) 取4kg干菌體，加入25L正己烷，用膠體磨循環(huán)剪切破壁提取，提取液用1um濾棒過濾，脫溶得到共計(jì)2128g微生物油脂;
(3) 取2000g 上述微生物油脂置于-10℃的環(huán)境下靜置4h，然后常溫解凍，倒出上層清油，得到205g粗濃縮磷脂。此步驟即為富集微生物油脂中磷脂的過程；
(4) 將上述205g 粗濃縮磷脂升溫至65℃，加入4g濃度為30%的食品級(jí)H2O2攪拌反應(yīng)30min，然后升溫至85-90℃，在真空度為-0.095Mpa的環(huán)境中脫除殘留水分和H2O2。待水分小于0.5%后，降溫至50℃以下，得到193g 富含磷脂型花生四烯酸的微生物油脂。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂的磷脂含量為38%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（亞麻酸與花生四烯酸之和）為59.1 %。
實(shí)施例5
以產(chǎn)亞麻酸的酵母菌作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含亞麻酸的微生物菌體的發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)處理后獲得富含亞麻酸的干菌體;
(2) 取9kg干菌體，用超聲粉碎，加入90L正己烷，提取液用1um濾棒過濾，脫溶得到共計(jì)3978g微生物;
(3) 取3600g 上述微生物油脂，通入水蒸氣至105℃處理5min，然后降溫至80℃離心得到918g粗濃縮磷脂。此步驟即為富集微生物油脂中的磷脂。
(4) 將850g粗濃縮磷脂于85-90℃，真空度-0.095Mpa脫除粗磷脂中的水分。待粗磷脂中水分小于1%后，降溫至65℃。然后加入1800ml正己烷，25g活性炭，控溫50℃脫色30min。抽濾得到的濾液用薄膜蒸發(fā)器脫溶，得到396g富含磷脂型亞麻酸的微生物油脂。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂中磷脂含量為63.7%。且磷脂中多不飽和脂肪酸（即亞麻酸）的含量為30%。
實(shí)施例6
以杜氏鹽藻作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含亞麻酸的微生物菌體的發(fā)酵液，對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行處理后，獲得含亞麻酸的干菌體;
(2) 取50kg干菌體，加入250L正己烷，用手持式剪切機(jī)剪切破壁提取，提取液用1um濾棒過濾，脫溶得到共計(jì)12.9kg微生物油脂;
(3) 取10kg上述微生物油脂，升溫至80℃，加入1kg純水進(jìn)行水化反應(yīng)30min，然后離心得到2.81kg粗濃縮磷脂。此步驟即為富集微生物油脂中的磷脂的工藝。
(4) 將2.75kg粗濃縮磷脂于85-90℃，在真空度-0.095Mpa的環(huán)境下脫除粗磷脂中的水分。待粗磷脂中水分小于1%后，降溫至65-70℃，加入10ml濃度為30%的食品級(jí)H2O2攪拌反應(yīng)30min，然后升溫至85-90℃，在真空度-0.095Mpa的環(huán)境下脫除殘留水分和H2O2，待水分小于0.5%后，降溫至50℃以下，得到1.97kg富含磷脂型亞麻酸的微生物油脂。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂中磷脂含量為61.1%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（亞麻酸）為39.4%。
實(shí)施例7
以裂殖壺菌作為發(fā)酵菌種，依次按下列步驟操作：
(1) 發(fā)酵獲得富含二十二碳六烯酸的微生物菌體的發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)處理后獲得富含二十二碳六烯酸的干菌體;
(2) 取500kg干菌體用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎破壁，加入2500L正己烷提取，提取液用1um濾棒過濾，然后經(jīng)真空脫溶得到共計(jì)247.3kg微生物油脂，加入800L的冷丙酮脫除油脂，重復(fù)2次。得到的濕固體經(jīng)真空干燥，除去丙酮，得到7.7kg粉末磷脂，本實(shí)施例的粉末磷脂為富含磷脂型多不飽和脂肪酸的微生物油脂的一種特殊形態(tài)。此步驟為純化步驟，主要目的是去除油脂、溶劑等雜質(zhì)。經(jīng)檢測(cè)，該微生物油脂中磷脂含量為96.7%，且磷脂中多不飽和脂肪酸的總含量（二十碳四烯酸、二十碳五烯酸,二十二碳六烯酸,二十二碳五烯酸之和）為59.9%。