技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥化工領域，涉及一種黃酮乙酸類衍生物、其藥物組合物、其制備方法及用途。

背景技術：

腫瘤需要依靠功能性的血管網(wǎng)絡為其提供氧氣、養(yǎng)料并及時清除代謝產(chǎn)物。除了可以通過與宿主血管整合而獲得部分血管，腫瘤還必須通過形成新生血管網(wǎng)構建自己的血管系統(tǒng)才能持續(xù)地生長和發(fā)展。如果沒有血管系統(tǒng)提供氧氣和養(yǎng)料，實體瘤的增長不會超過1mm³。鑒于其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，腫瘤血管已成為抗腫瘤治療的一個重要靶點。

腫瘤血管破壞劑是可以快速并有選擇性地破壞腫瘤血管的藥物。它利用腫瘤血管和正常組織血管存在的差別選擇性地破壞腫瘤血管，或借助能夠特異結合腫瘤血管的配體將毒素、凝血誘導劑、凋亡誘導分子等運送到腫瘤血管,從而快速而有選擇性地損壞或堵塞已構建完成的腫瘤血管。對于治療血管已形成腫瘤，腫瘤血管破壞劑有顯著的療效。小分子腫瘤血管破壞劑可以快速，廣泛地破壞已經(jīng)形成的腫瘤血管，成為了研究的熱點。目前已被普遍研究的腫瘤血管破壞劑包括秋水仙素、考布他汀A-4P、黃酮乙酸類等等，已應用于非小細胞肺癌、乳腺癌等實體瘤的治療(Disrupting Tumour Blood Vessels，Nature Reviews，June 2005Volume 5：423-435)。

黃酮類腫瘤血管破壞劑是小分子腫瘤血管破壞劑的一種，目前普遍認為它是通過直接破壞腫瘤血管內(nèi)皮細胞和促進腫瘤組織細胞釋放腫瘤壞死因子α(TNF-α)等間接發(fā)揮破壞腫瘤血管的作用。黃酮乙酸(FAA)是最早被發(fā)現(xiàn)的黃酮類腫瘤血管破壞劑，它通過誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TNF-α，顯著升高腫瘤微環(huán)境中的TNF-α的濃度，使腫瘤局部的血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡發(fā)揮作用，并且還能夠避免TNF-α的全身毒性反應。但是FAA僅在小鼠腫瘤模型中有效，在臨床試驗中并沒有抗癌作用。

5,6-二甲基呫噸酮-4-乙酸(DMXAA)是具有較高活性的FAA衍生物，活性強于FAA(研究發(fā)現(xiàn)FAA只在動物水平有效)，但是研究表明其僅有輕微的劑量可逆毒性。此外，在III期臨床試驗中DMXAA未能顯著延長患者的存活時間。

目前尚需要開發(fā)新的抗腫瘤化合物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動，得到了一種新的黃酮乙酸類衍生物。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該類化合物是有效的腫瘤血管破壞劑，具有較強的誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TNF-α作用，以及對雞胚絨毛尿囊膜當中血管的破壞作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。由此提供了下述發(fā)明：

本發(fā)明的一個方面涉及式I所示的化合物，或其可藥用鹽或酯，

其中：

R₁選自H、C₁-C₆烷基；

當母環(huán)上的乙酸基團位于R₁位置時，R₁不存在；

R₂選自苯基、一個或多個(例如2、3、4或5個)羥基取代的苯基，以及選自如下的基團：

具體地，對于R₂為除苯環(huán)之外的上述其它取代基，R₂與母環(huán)的連接位置為R2中的苯環(huán)上的未被取代的任意位點；

R₃選自H、-OH。

本發(fā)明的另一方面涉及式II所示的化合物，或其可藥用鹽或酯，

其中：

R₁選自H、C₁-C₆烷基；

當母環(huán)上的乙酸基團位于R₁位置時，R₁不存在；

R₂選自苯基、一個或多個(例如2、3、4或5個)羥基取代的苯基，以及選自如下的基團：

具體地，對于R₂為除苯環(huán)之外的上述其它取代基，R₂與母環(huán)的連接位置為R2中的苯環(huán)上的未被取代的任意位點；

R₃選自H、-OH；

表示單鍵或雙鍵。

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的式I或式II化合物，或其可藥用鹽，其中，

R₁獨立地選自H、C₁-C₃烷基；具體地，所述C₁-C₃烷基為甲基、乙基、丙基或異丙基；優(yōu)選地，R₁獨立地為H或甲基。

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的式I或式II化合物，或其可藥用鹽，其中，

R₂獨立地選自其中虛線表示R₂與母環(huán)的連接位置。

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的式I或式II化合物，或其可藥用鹽，其中，優(yōu)選地，所述式I或式II化合物不包括以下4個化合物：

以及

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的式I或式II化合物，其中，所述酯為母環(huán)上的乙酸基團形成的酯；具體地，為所述乙酸基團與C₁－C₆飽和一元醇(烷醇)形成的酯；具體地，所述C₁－C₆飽和一元醇為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、戊醇或己醇。

本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的酯亦是有效的腫瘤血管破壞劑，具有較強的誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TNF-α作用，以及對雞胚絨毛尿囊膜當中血管的破壞作用，可以用于制備抗腫瘤藥物。

所述的式I或式II化合物，或其可藥用鹽或酯，其中，所述式I或式II化合物選自下面的表1：

表1：本發(fā)明的部分化合物

本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項所述的式I化合物的制備方法，包括下述步驟：

(1)A片段的制備：

(2)B2、B3、B4、B5、B6片段的制備：

(3)以乙醇為溶劑，在60％氫氧化鉀水溶液的作用下，將A片段分別與B₁片段即B₂片段、B₃片段、B₄片段、B₅片段或B₆片段反應得到式I化合物；

其中，虛線部分代表R₁。

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的制備方法，其中，所述步驟(1)包括：

a)以為原料與多聚甲醛和濃鹽酸反應得到

b)在有機溶劑(例如甲苯)中，在試劑(例如四丁基溴化銨)存在下，使與氰化鈉反應，得到的進一步水解，得到A片段(例如

根據(jù)本發(fā)明任一項所述的制備方法，其中，所述步驟(2)包括：

c)B₁片段與B₂片段可以直接購買；

d)B₂片段與溴代異戊烯在碳酸鉀溶液條件下反應，得到時B₃片段

e)使B₃片段與甲氧基甲基氯反應，得到B₄片段

f)將B₄片段分別與對甲苯磺酸、2,3-二氯-5,6-二氰基-對苯二醌，得到B₅片段B₆片段

根據(jù)本發(fā)明的詳細教導以及已有的合成化學知識，本領域技術人員可以容易地合成本發(fā)明的式I化合物。

本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中任一項所述的式II化合物的制備方法，其包括本發(fā)明中任一項所述的制備式I化合物的方法，并且還包括：

(4)由式I化合物制得式II化合物；具體地包括下述步驟：

由式I化合物經(jīng)DMSO/I₂/微波條件下反應得到黃酮類化合物(例如參考實施例17)；在TFA/微波條件下反應得到黃酮烷類化合物(例如參考實施例35)；在雙氧水/NaOH條件下反應得到式II化合物(例如參考實施例53)。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備通式I、式II所示的化合物的制備方法。具體地說，本發(fā)明提供了制備通式I、式II所示的化合物的方法，包括以下步驟：

1)A片段的合成

如反應路線，以鄰羥基苯乙酮起始原料，將其與多聚甲醛和濃鹽酸反應得到2-羥基-3-氯甲基-苯乙酮以及2-羥基-5-氯甲基-苯乙酮，將2-羥基-3-氯甲基-苯乙酮溶于甲苯中，在四丁基溴化銨存在下與氰化鈉反應得到2-羥基-3-氰基-苯乙酮，將其與濃硫酸反應得到A₁片段2-(3-乙?；?2-羥苯基)乙酸，同樣方法得到A₂片段2-(3-乙?；?4-羥苯基)乙酸。

以2-羥基-5-甲基-苯乙酮為原料，操作方法同上，得到A₃片段2-(3-乙酰基-2-羥基-5-甲苯基)乙酸。

2)B片段的合成

如反應路線，B₂片段與溴代異戊烯在碳酸鉀水溶液中反應，得到B₃片段；以丙酮為溶劑，B₃片段與甲氧基甲基氯反應，得到B₄片段；以甲苯為溶劑，B₄片段分別與2,3-二氯-5,6-二氰基-對苯二醌、對甲苯磺酸反應，分別得到B₅片段、B₆片段。

c)以乙醇為溶劑，在60％氫氧化鉀水溶液的作用下，A₁片段、A₂片段、A₃片段分別與B₁片段、B₂片段、B₃片段、B₄片段、B₅片段、B₆片段反應得到式I化合物，式I化合物通過相應的反應得到式II化合物。

關于制備通式I、II化合物更詳盡的資料還可見實施例。

本發(fā)明的再一方面涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明中任一項所述的式I或式II化合物或其可藥用鹽，以及任選的藥學上可接受的輔料；可選地，其還包含脂多糖。

術語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。

通常本發(fā)明藥物組合物含有0.1－90重量％的本發(fā)明化合物和/或其藥學上可接受的鹽。藥物組合物可根據(jù)本領域已知的方法制備。用于此目的時，如果需要，可將本發(fā)明化合物和/或其藥學上可接受的鹽與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔劑結合，制成可作為人用的適當?shù)氖┯眯问交騽┝啃问健?/p>

本發(fā)明的化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等。給藥劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將給藥單元制成栓劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分化合物或其可藥用鹽與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明明膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分化合物或其可藥用鹽制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中或制成注射劑應用。為了將給藥單元制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。

此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。

本發(fā)明的化合物，或其可藥用鹽的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體化合物，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。

可改變本發(fā)明藥物組合物中各活性成分的實際劑量水平，以便所得的活性化合物量能有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應。劑量水平須根據(jù)具體化合物的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴重程度以及待治療患者的病況和既往病史來選定。但是，本領域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

本發(fā)明的再一方面涉及中任一項所述的式I或式II化合物或其可藥用鹽或者本發(fā)明的藥物組合物在制備如下任一項所述的藥物中的用途：

1)調(diào)節(jié)例如上調(diào)腫瘤壞死因子α水平的藥物；

2)誘導腫瘤細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α的藥物‘

3)破壞腫瘤血管或者抑制腫瘤血管形成的藥物；

4)抑制腫瘤細胞或者血管內(nèi)皮細胞的藥物；以及

5)治療和/或預防和/或輔助治療腫瘤的藥物中的用途；

具體地，所述腫瘤細胞為結腸癌細胞(例如DLD-1人結腸癌細胞)、RAW 264.7巨噬細胞、乳腺癌細胞(例如MDA-MB-231乳腺癌細胞)或?qū)m頸癌細胞(例如Hela宮頸癌細胞)。

具體地，所述腫瘤為肺癌、乳腺癌、宮頸癌或結腸癌。

本發(fā)明的再一方面涉及一種選自如下任一項所述的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任一項所述的式I或式II化合物或其可藥用鹽或者本發(fā)明的藥物組合物的步驟：

1)在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)例如上調(diào)腫瘤壞死因子α水平的方法；

2)在體內(nèi)或體外誘導腫瘤細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α的方法；以及

3)在體內(nèi)或體外抑制腫瘤細胞例如抑制腫瘤細胞增殖和/或遷移的方法。

在本發(fā)明的一個實施方案中，上述的在體外的方法是非治療目的的。

本發(fā)明的再一方面涉及一種治療和/或預防和/或輔助治療腫瘤的方法，包括使用有效量的本發(fā)明中任一項所述的式I或式II化合物或其可藥用鹽或者本發(fā)明的藥物組合物的步驟；具體地，所述腫瘤為肺癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌。

術語“有效量”是指可在受試者中實現(xiàn)治療、預防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的劑量。

術語“受試者”可以指患者或者其它接受本發(fā)明組合物以治療、預防、減輕和/或緩解本發(fā)明所述疾病或病癥的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。

術語“疾病和/或病癥”是指所述受試者的一種身體狀態(tài)，該身體狀態(tài)與本發(fā)明所述疾病和/或病癥有關。

但應認識到，本發(fā)明化合物或藥物組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時間；與所采用的具體化合物組合使用或同時使用的藥物；及醫(yī)療領域公知的類似因素。例如，本領域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說來，本發(fā)明的化合物用于哺乳動物特別是人的劑量可以介于0.001-1000mg/kg體重/天，例如介于0.01-100mg/kg體重/天，例如介于0.01-10mg/kg體重/天。

根據(jù)本發(fā)明的化合物可以有效地預防和/或治療本發(fā)明所述的各種疾病或病癥。

本發(fā)明的再一方面涉及選自如下中間體化合物：

以及

本發(fā)明的再一方面涉及本發(fā)明中所述的任一中間體化合物在制備抗腫瘤藥物或者在制備本發(fā)明任一項所述的式I或式II化合物中的用途。

發(fā)明的有益效果

本發(fā)明的化合物僅有較強的誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TNF-α的作用，以及對雞胚絨毛尿囊膜當中血管的破壞作用，是有效的腫瘤血管抑制劑或者破壞劑，具有用于制備抗腫瘤藥物的前景。此外，本發(fā)明的化合物不依賴LPS途徑也具有TNF-α促分泌作用。

附圖說明

圖1：control(對照)、DMXAA、實施例2化合物的瘤體圖片。上方刻度尺可讀出瘤體大小。

圖2：瘤體體積變化。*P<0.05.n＝3-5只鼠/組。mean±SEM。

圖3：對血管破壞作用(Hoshest 33342染色)。圖3A，control(對照)；圖3B，DMXAA；圖3C，實施例2化合物。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

化合物的熔點由RY-1熔點儀測定，溫度計未較正。質(zhì)譜由Micromass ZabSpec高分辨率質(zhì)譜儀(分辨率1000)測定。¹H-NMR由JNM-ECA-400超導NMR儀測定，工作頻率¹H-NMR 400MHz。

在本發(fā)明的上下文中，使用如下縮略語：

MOM:-甲氧基甲基

DMSO：二甲基亞砜

DDQ:2,3-二氯-5,6-二氰基-對苯二醌

TsOH:對甲苯磺酸

下面通過制備例1-7來制備中間體。

制備例1：2-羥基-3-氯甲基-苯乙酮的制備

反應流程：

步驟1：鄰羥基苯乙酮衍生物的制備

機械攪拌下，鄰羥基苯乙酮178g(1.30mol)、多聚甲醛39.5g(1.30mol)與濃鹽酸800mL在50-60℃下反應7小時。分出有機相、水相，以甲苯200mL提取水相，用甲苯600mL溶解反應體系下層油狀物，合并有機相，有機相依次用飽和NaHCO₃水溶液300mL×2次，飽和食鹽水300mL洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸出溶劑后，對殘余油狀物進行減壓蒸餾，得到主餾分有211.4g，是2-羥基-3-氯甲基-苯乙酮和2-羥基-5-氯甲基-苯乙酮的混合物。按照1g～5mL的比例向其中加入正己烷，加熱溶解。冷卻后析出晶體為2-羥基-5-氯甲基-苯乙酮155.1g；過濾后濾液冷藏(4℃)即有油狀物析出，傾出上清液，濃縮約一半后放置即可析出大量晶體，此晶體為2-羥基-3-氯甲基-苯乙酮38.3g?？偸章?0.8％。

制備例2：2-羥基-5-氰基甲基-苯乙酮的制備

反應流程：

2-羥基-5-氯甲基-苯乙酮37g(0.2mol)溶解在500mL甲苯當中(加熱促溶)，加入四丁基溴化銨3.2g(20mmol)，室溫攪拌下，向其中滴加氰化鈉12.5g(0.255mol)溶解在80mL水當中的溶液。20分鐘滴完，70℃反應1小時。

冷卻，有機相以500mL×2水洗滌，有機相干燥，過濾，減壓濃縮得到大量固體。用石油醚/乙酸乙酯(5:1)重結晶，得到純品31.6g，收率89.2％。

2-羥基-3-氰基甲基-苯乙酮的制備參照上述操作。

制備例3：2-(3-乙?；?4-羥苯基)乙酸的制備

反應流程：

2-羥基-5-氰基-苯乙酮8.7g(34.5mmol)，加入33％的硫酸75mL(1:2體積比稀釋得到)，回流反應1.5小時。冷卻，加入冷水100mL，放置，析出大量黃色固體。過濾水洗，粗品用熱水重結晶，熱濾去除雜質(zhì)，濾液析出大量淡黃色固體，過濾得到純產(chǎn)物8.3g。收率87.7％。

2-(3-乙酰基-2-羥苯基)乙酸的制備參照上述操作。

制備例4：4-羥基-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛的制備

反應流程：

碳酸鉀140g(1mol)溶解于200g水中，待放熱結束后，加入對羥基苯醛61.0g(0.5mol)，攪拌至完全溶解。再滴加溴代異戊烯60.0mL(0.51mol)，5分鐘內(nèi)滴完。室溫下反應，TLC檢測12小時。

反應液以乙醚250mL×2萃取，水相棄去；乙醚層合并，以5％碳酸鈉水溶液200mL×3洗滌，水相棄去；再用0.5N氫氧化鈉水溶液200mL×3洗滌，有機相棄去；水相用濃鹽酸酸化后，以乙醚200mL×3萃取，干燥，層析柱分離，石油醚/乙酸乙酯(5:1)，得到14.1g無色油狀物，放置緩慢固化。收率14.8％。

制備例5：4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛的制備

反應流程：

4-羥基-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛1.9g(10mmol)，溶解在50mL丙酮當中，加入碳酸鉀2.0g，冰浴攪拌下加入甲氧基甲基氯2.0mL(20mmol)，10分鐘滴完，然后撤去冰浴，在常溫下反應8小時。減壓旋干溶劑，加入乙醚30mL，分別以水20mL、0.5N氫氧化鈉溶液20mL、飽和食鹽水20mL洗滌，干燥，過濾，層析柱分離，石油醚/乙酸乙酯(8:1)，得無色油狀物2.1g，放置逐漸固化，收率83.1％。

制備例6：2，2-二甲基-2H-苯并吡喃-6-甲醛的制備

反應流程：

4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛1.90g(10mmol)溶解在30mL甲苯當中，加入DDQ(2,3-二氯-5,6-二氰基-對苯二醌)2.70g(12mmol)，加熱回流5小時。冷卻后過濾，濾餅用甲苯10mL洗滌，濾液依次用15mL水、飽和碳酸鉀溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌。有機相干燥，過濾，層析柱分離，石油醚/乙酸乙酯(10:1)，得到產(chǎn)物0.80g，收率44.4％。

制備例7：2，2-二甲苯并吡喃-6-甲醛的制備

反應流程：

4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛1.90g(10mmol)溶解在甲苯30mL當中，加入對甲苯磺酸0.20g，回流3小時。冷卻后過濾，濾餅用甲苯10mL洗滌，濾液依次用15mL水、飽和碳酸鉀溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌。有機相干燥，過濾，層析柱分離，石油醚/乙酸乙酯(10:1)，得到產(chǎn)物1.58g,收率83.2％。

實施例2：2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯?；?苯基)乙酸

將2-(3-乙?；?2-羥苯基)乙酸1.00g(5.18mmol)和對羥基苯醛0.63g(5.18mmol)混合，加入乙醇6mL溶解，加入60％氫氧化鉀水溶液8mL，室溫反應4小時。用冰水50mL稀釋，用乙醚20mL萃取，乙醚相棄去。冰浴攪拌下，水相用鹽酸酸化至pH≈2，有大量明黃色固體析出，過濾干燥，得0.89g產(chǎn)物，收率92.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.586(2H，s，-CH₂-COOH)，6.843-6.981(3H，m，Ar-H×3)，7.498-7.517(1H，dd，Ar-H)，7.806-7.893(4H，m，Ar-H×4),8.253-8.273(1H，m，Ar-H)，10.232(1H，s，-OH)，12.292(1H，s，-OH)，13.492(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:299.1。

實施例3：2-(4-羥基-3-(3-(4-(羥基苯基)丙烯?；?苯基)乙酸

參照實施例2的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(3-乙?；?4-羥苯基)乙酸1.00g(5.18mmol)代替相應起始原料，得到產(chǎn)品1.45g，收率94.1％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.603(2H，s，-CH₂-COOH)，6.778-7.018(3H，m，Ar-H×3),7.326-7.465(2H，m，Ar-H×2)，7.658-7.823(3H，m，Ar-H×3)，8.143-8.148(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，10.231(1H，s，-OH)，12.367(1H，s，-OH)，12.729(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:298.0。

實施例4：2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯?；?-5-甲基苯基)乙酸

參照實施例2的合成方法制備本實施例化合物，不同的是2-(3-乙?；?2-羥基-5-甲苯基)乙酸1.00g(4.83mmol)代替相應起始原料，得到產(chǎn)品1.43g，收率88.5％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：2.325(3H，s，-CH₃)，3.552(2H，s，-CH₂-COOH)，6.855-6.877(2H，d，J＝8.8Hz，Ar-H×2),7.336-7.340(1H，d，J＝1.6Hz，Ar-H)，7.818-7.934(4H，m，Ar-H×4),8.093-8.096(1H，d，J＝1.2Hz，Ar-H)，10.235(1H，s，-OH)，12.280(1H，s，-OH)，13.310(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:313.0。

實施例9：2-(3-(3-(2,2-二甲基-6-基)丙烯?；?-2-羥基苯基)乙酸

參照實施例2的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(3-乙?；?4-羥苯基)乙酸1.65g(8.55mmol)和4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛2.00g(8.55mmol)代替相應起始原料，得到產(chǎn)品1.30g，收率37.14％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.688-1.730(6H，d，J＝16.8Hz，-CH₃×2)，3.323(1H,s，-CH₂之一)，3.391(3H，s,-CH₃)，3.618(2H，s，-CH₂-COOH)，5.276-5.317(3H，m，-OCH₂；-CH)，6.943-6.964(1H，d，J＝8.4Hz,Ar-H)，7.111-7.133(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，7.444-7.471(1H，dd，Ar-H)，7.713-7.775(2H，m，Ar-H×2)，7.814-7.893(2H，m，Ar-H×2)，8.110-8.115(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，12.591(2H，s，-OH；-COOH)。ESI-MS[M+1]:411.5。

實施例10：2-(2-(2-羥基-3-(3-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)-5-甲基苯基)乙酸

參照實施例2的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(3-乙?；?2-羥基-5-甲苯基)乙酸1.77g(8.55mmol)和4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-亞甲基-2-烯)苯甲醛2.00g(8.55mmol)代替相應起始原料，得到產(chǎn)品1.71g，收率47.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.695-1.741(6H，d，J＝18.4，-CH₃×2)，2.341(3H，s，-CH₃)，3.334-3.415(5H，m，-CH₂-CH；-OCH₃)，3.562(2H，s，-CH₂-COOH)，5.287-5.326(3H，m，-OCH₂；-CH₂-CH)，7.116-7.139(1H，d，J＝9.2Hz，Ar-H)，7.357-7.360(1H，d，J＝1.2Hz，Ar-H),7.776-7.859(3H，m，Ar-H×3)，7.943-7.982(1H，d，J＝15.6Hz，Ar-H)，8.089(1H，s，Ar-H)，12.296(1H，s，-OH)，13.245(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:425.2。

實施例1、5、6、7、8、11、12、13、14、15、16、68的合成參照實施例2，如下面的表2。

表2：參照實施例2合成的部分化合物

實施例17：2-(2-(4-羥基苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-8-基)乙酸

將2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯酰基)苯基)乙酸89.4mg(0.3mmol),溶于2mL DMSO當中，加入3mg I₂，微波反應10分鐘，設定溫度150℃。用乙酸乙酯15mL和水15mL萃取，有機相干燥，過濾，濃縮，層析柱分離，二氯甲烷/甲醇(20:1)，得到黃色固體67mg，收率54.4％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.987(2H，s，-CH₂-COOH)，6.859-6.943(3H，m，Ar-H×3),7.400-7.438(1H，t，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.714-7.732(1H，dd，Ar-H)，7.920-7.961(3H，m，Ar-H×3)，10.284(1H，s，-OH)，12.544(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:297.1。

實施例18：2-(3-羥基-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-8-基)乙酸

參照實施例17的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(4-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯?；?苯基)乙酸0.3g(1.01mmol)

為起始原料，得到產(chǎn)品0.16mg，收率60.4％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.757(2H，s，-CH₂-COOH)，6.862-6.955(3H，m，Ar-H×3)，7.699-7.701(2H，d，J＝0.8Hz，Ar-H×2)，7.922-7.975(3H，m，Ar-H×3)，10.318(1H，s，-OH)，12.444(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:297.1。

實施例20：2-(2-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-8-基)乙酸

參照實施例17的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)苯基)乙酸0.25g(0.68mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品135mg，收率54.4％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.719(6H，s，-CH₃×2)，3.981(2H，s，-CH₂-COOH)，5.340-5.378(1H，t，J＝7.6Hz，-CH₂-CH)，6.851-6.951(2H，m，Ar-H×2)，7.402-7.439(1H，t，J＝7.2Hz，Ar-H)，7.711-7.804(3H，m，Ar-H×3),7.933-7.956(1H，dd，Ar-H)，10.266(1H，s，-OH)，12.585(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:365.2。

實施例22：2-(2-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)-6-甲基-4-氧代-4H-苯并吡喃-8-基)乙酸

參照實施例17的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)-5-甲基苯基)乙酸0.26g(0.68mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品134mg，收率51.8％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.715(6H，S，-CH₃×2)，2.410(3H，S，Ar-CH₃)，3.335(2H，S，-CH₂-CH)，3.929(2H，S，-CH₂-COOH)，5.350-5.356(1H，t，J＝1.2Hz，-CH₂-CH)，6.808-6.943(2H，m，Ar-H×2)，7.538-7.543(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，7.737-7.779(3H，m，Ar-H×3),10.245(1H，s，-OH)，12.580(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:379.1。

實施例26：2-(2',2'-二甲基-4-氧代-2'H,4H-2,6'-苯并吡喃-8-基)乙酸

參照實施例17的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(3-(3-(2,2-二甲基-2H-苯并吡喃-6-基)-2-丙烯?；?-2-羥基苯)乙酸110mg(0.3mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品54.4mg，收率49.8％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.318-2.222(6H，m，-CH₃×2)，2.852-2.918(1H，m，-CH₂之一)，3.056-3.091(1H，m，-CH₂之一)，3.230-3.319(3H，m，-CH；-CH₂)，4.003(2H，s，-CH₂-COOH)，6.891-6.927(2H，d，J＝5.2Hz，Ar-H×2)，7.431-7.450(1H，t，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.892-7.961(4H，m，Ar-H×4),12.646(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:365.1。

實施例19、21、23、24、25、27、28、29、30、31的合成參照實施例17，如下面的表3。

表3：參照實施例17合成的部分化合物

實施例35：2-(2-(4-羥基苯基)-4-氧代苯并二氫吡喃-8-基)乙酸

將2-(2-羥基-3-(3-4-羥基苯基)丙烯?；?苯基)乙酸0.25g(0.84mmol),溶于2mL三氟乙酸當中，微波反應10分鐘，設定溫度80℃。用乙酸乙酯20mL稀釋后，用水15mL×2洗滌，有機相干燥，過濾濃縮，層析柱分離，二氯甲烷/甲醇(35:1)，得到黃色固體0.11g，收率44％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：2.796-2.846(1H,dd，-CH₂之一)，3.120-3.195(1H，m，-CH₂之一)，3.580(1H，s，-CH₂-COOH)，5.482-5.521(1H，s，-CH)，6.772-6.801(2H，m，Ar-H×2)，7.016-7.054(1H，t，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.305-7.327(2H，d，J＝8.6Hz，Ar-H)，7.506-7.529(1H，dd，Ar-H)，7.690-7.715(1H，dd，Ar-H)，9.579(1H，s，-OH)，12.335(1H，s，-COOH)ESI-MS[M+1]:299.1。

實施例38：2-(2-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)-4-氧代苯并二氫吡喃-8-基)乙酸

參照實施例35的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)苯基)乙酸120mg(0.33mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品83mg，收率69.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.284(6H，s，-CH₃×2)，1.758-1.791(2H，t，J＝6.8Hz，-CH₂-CH)，2.811-2.853(2H，dd，-CH₂)，3.118-3.193(1H，m，-CH₂-CH)，3.586(2H，s，-CH₂-COOH)，5.475-5.507(1H，dd，-OH)，6.722-6.743(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H)，7.019-7.057(1H，m，Ar-H)，7.189-7.232(2H，m，Ar-H×2)，7.509-7.527(1H，dd，Ar-H)，7.694-7.713(1H，dd，Ar-H)，12.276(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:367.1。

實施例39：2-(2-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)-4-氧代苯并二氫吡喃-6-基)乙酸

參照實施例35的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(4-羥基-3-(3-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯?；?苯基)乙酸120mg(0.33mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品81mg，收率67.8％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.283(6H，s，-CH₃×2)，1.756-1.988(2H，t，J＝6.8Hz，-CH₂-CH)，2.739-2.755(3H，m，-CH₂，-CH)，3.227-3.316(1H，m，-CH₂-CH)，3.592(2H，s，-CH₂-COOH)，5.484-5.516(1H，dd，-OH)，6.727-6.748(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H)，7.001-7.023(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，7.215-7.264(2H，m，Ar-H×2)，7.447-7.474(1H，dd，Ar-H)，7.669-7.674(1H，d，J＝2Hz，Ar-H).ESI-MS[M+1]:367.2。

實施例40：2-(2-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基-6-甲基-4-氧代苯并二氫吡喃-8-基)乙酸

參照實施例35的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)-5-甲基苯基)乙酸125mg(0.33mmol)為起始原料，得到產(chǎn)品84.2mg，收率67.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.173(6H，s，-CH₃×2)，1.753-1.786(2H，t，J＝6.8Hz，-CH₂-CH)，2.273(3H，S，Ar-CH₃)，2.743-2.820(3H，m，-CH，-CH₂)，3.081-3.156(1H，m，-CH₂-CH)，5.419-5.452(1H，dd，Ar-OH)，6.715-6.736(1H，d，J＝8.4Hz，Ar-H)，7.176-7.222(2H，m，Ar-H×2),7.341-7.346(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，7.497-7.500(1H，d，J＝1.2Hz，Ar-H)，12.311(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:381.2。

實施例36、37、44、45、46、47、48、49的合成參照實施例35的合成，如下面的表4。

表4：參照實施例35合成的部分化合物：

實施例41：2-(2-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基-4-氧代苯并二氫吡喃-8-基)乙酸

2-(2-羥基-3-(3-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯酰基)苯基)乙酸123mg(0.3mmol)，溶于6mL乙醇當中，加入乙酸鈉180mg，滴入幾滴水使乙酸鈉完全溶解。回流反應2天。加入乙酸乙酯20mL稀釋，用水15mL×2洗滌，有機相干燥，過濾濃縮，層析柱分離，二氯甲烷/甲醇(35:1)，得到黃色固體33mg，收率26.8％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.684-1.690(6H，d，J＝2.4Hz，-CH₃×2)，2.886-2.893(1H，dd，-CH₂之一)，3.105-3.137(1H，m，-CH₂之一)，3.283-3.383(7H，m，-CH₂×3，-CH)，3.599(2H，s，-CH₂-COOH)，5.244-5.272(3H，t，J＝6.4Hz，-OCH₃)，5.537-5.569(1H，dd，-CH₂-CH)，7.044-7.069(2H，t，J＝7.6Hz，Ar-H×2)，7.276-7.296(2H，t，J＝8.0Hz，Ar-H×2),7.518-7.537(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.692-7.711(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，12.329(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:411.1。

實施例42：2-(2-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基-4-氧代苯并二氫吡喃-6-基)乙酸

參照實施例41的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(4-羥基-3-(3-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯?；?苯基)乙酸123mg(0.3mmol)為起始原料，得到產(chǎn)物31mg，收率25.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.683(6H，s，-CH₃×2)，2.746-2.795(1H，dd，-CH₂-CH)，3.286-3.380(6H，m，-CH₂×3)，3.591(2H，S，-CH₂-COOH)，5.237-5.256(3H，S，-CH₃)，5.542-5.567(1H，dd，-CH₂-CH)，7.008-7.029(2H，m，Ar-H×2)，7.305-7.318(2H，m，Ar-H×2)，7.451-7.478(1H，dd，Ar-H)，7.664-7.669(1H，d，J＝2Hz，Ar-H)，12.291(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:411.1。

實施例43的合成參照實施例41的合成。

實施例53：2-(3-羥基-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-8-基)乙酸

2-(2-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯酰基)苯基)乙酸0.25g(0.84mmol),溶于6mL甲醇當中。室溫攪拌下，加入16％氫氧化鈉水溶液(約為5N)1.2mL，體系顏色由黃變紅。再加入30％雙氧水0.15mL，體系顏色逐漸褪去，反應1小時，紫外365nM處顯示強吸收。用冰水20mL稀釋，然后酸化至pH 2，有大量明黃色固體析出，過濾，得到產(chǎn)物0.18g，收率69.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.989(2H，s，-CH₂-COOH),6.924-6.947(2H，m，Ar-H×2)，7.387-7.426(1H，t，Ar-H)，7.696-7.717(1H，dd，Ar-H)，8.012-8.094(3H，m，Ar-H×3),9.399(1H，s，-OH)，10.126(1H，s，-OH)，12.632(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:313.1。

實施例54：2-(3-羥基-2-(4-羥基苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-6-基)乙酸

參照實施例53的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(4-羥基-3-(3-(4-羥基苯基)丙烯?；?苯基)乙酸200mg(0.67mmol)為起始原料，得到產(chǎn)物0.16g，收率76.2％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：3.771(2H，s，-CH₂-COOH)，6.936-6.958(2H，d，J＝2Hz，Ar-H×2)，7.671-7.681(2H，t，J＝2Hz，Ar-H×2)，8.089-8.120(3H，d，J＝8.4Hz，Ar-H×3)，9.337(1H，s，Ar-OH)，10.084(1H，s，-OH)，12.433(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:313.0。

實施例59：2-(3-羥基-2-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基-4-氧代-4H-苯并二氫吡喃-8-基)乙酸

參照實施例53的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(2-羥基-3-(3-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯?；?苯基)乙酸200mg(0.5mmol)為起始原料，得到產(chǎn)物133.7mg,產(chǎn)率64.7％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.717-1.738(6H，d，J＝8.4Hz，-CH₃×2)，3.350-3.414(5H，m，-CH₂-CH；-OCH₃)，3.990(2H，s，-CH₂-COOH)，5.324-5.341(3H，m，-OCH₂；-CH₂-CH)，7.193-7.215(1H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，7.397-7.435(1H，t，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.708-7.730(1H，dd,Ar-H)，8.019-8.061(3H，m，Ar-H×3)，9.491(1H，s，-OH)，12.617(1H，s，-COOH)。ESI-MS[M+1]:425.1。

實施例60：2-(3-羥基-2-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)-4-氧代-4H-苯并吡喃-6-基)乙酸

參照實施例53的合成方法制備本實施例化合物，不同的是使用2-(4-羥基-3-(3-(4-(甲氧基甲氧基)-3-(3-甲基丁-2-烯基)苯基)丙烯?；?苯基)乙酸200mg(0.5mmol)為起始原料，得到產(chǎn)物132.9mg，收率64.3％。

¹H-NMR(DMSO-d⁶,400MHz)：1.707-1.733(6H，d，J＝10.4Hz，-CH₃×2)，3.314-3.410(5H，m，-CH₂×2，-CH)，3.773(2H，s，-CH₂-COOH)，5.275-5.326(3H，s，-OCH₃)，7.198-7.221(1H，d，Ar-H)，7.686(2H，s，Ar-H×2)，7.991-8.043(3H，m，Ar-H×3)，9.404(1H，s，-OH)，12.366(1H，s，-COOH).ESI-MS[M+1]:425.1。

實施例50、51、52、55、56、57、58、61、62、63、64、65、66、67的合成參照實施例53，如下面的表5。

表5：參照實施例53合成的部分化合物

藥理學試驗及活性數(shù)據(jù)

如下面的試驗例1-3。

試驗例1：AlphaLISA法檢測RAW 264.7細胞培養(yǎng)上清內(nèi)TNF-α濃度

實驗方法如下：取對數(shù)生長期的RAW 264.7細胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔100μl(含2500個RAW264.7細胞)，置于37℃，5％CO₂溫箱內(nèi)，加入目標化合物作用一定時間后，將96孔板離心2000r、10min，之后每孔取150μl上清，分裝到三個EP中，每支50μl，于-20℃凍存?zhèn)溆?。隨后按照AlphaLISA TNF-α試劑盒說明，配制標準曲線溶液，并取5μl上清接種于White OptiPlate-384孔板中，然后每孔加入AlphaLISA Anti-Analyte Acceptor beads(終濃度10μg/ml)和Biotinylated Antibody Anti-Analyte(終濃度1nM)混合液20μl(Acdeptor beads：Biotinylated Antibody Anti-Analyte：1X buffer＝1:2:198)，23℃孵育60min后加入Donor beads(終濃度為40μg/ml)25μl(Donor beads：1X buffer＝1:61.5)，23℃避光孵育30min后利用EnVision檢測。

實驗結果如表6。

試驗例2：MTS法測定化合物的細胞毒作用

實驗方法如下：取對數(shù)生長期的小鼠單核巨噬細胞株RAW 264.7細胞，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100μl(含2500個腫瘤細胞)，置于37℃，5％CO₂溫箱內(nèi)。加入目標化合物后作用一定時間后，每孔加入MTS溶液10μl，37℃孵育4小時。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光值。

細胞存活率(％)＝(給藥組OD-空白組OD)/對照組OD×100％

實驗結果如表6。

表6：部分化合物活性實驗結果

“－”表示未進行檢測。

目標化合物濃度為30μg/ml，LPS濃度為2.5ng/ml，以DMSO或DMSO與LPS為對照；“a”表示目標化合物單獨作用促進RAW 264.7細胞分泌TNF-α的分泌率；“b”表示與LPS(脂多糖2.5ng/ml)合用時目標化合物與LPS合用促進RAW 264.7細胞分泌TNF-α的分泌率；“c”表示目標化合物單獨作用對RAW 264.7細胞的生長抑制作用；“d”表示目標化合物與LPS合用對RAW 264.細胞的生長抑制作用。

結果顯示，式I、式II化合物具有抗腫瘤活性，因此式I、式II化合物可作為抗腫瘤藥物用于抗腫瘤的研究中，具有開發(fā)成為抗腫瘤藥物的潛力。

此外，一般的促TNF-α分泌都是通過LPS途徑，實驗結果顯示，本發(fā)明的化合物不依賴LPS途徑也能夠產(chǎn)生TNF-α促分泌作用。

試驗例3：雞胚絨毛尿囊膜模型考察化合物對血管的影響

實驗方法如下：在無菌條件下，將10μl相應濃度目標化合物溶液均勻涂布于Whatman濾紙上，陰性對照涂布相同體積的0.3％DMSO溶液，將受精種蛋置于37℃、60％相對濕度的恒溫孵育箱中進行孵化，6天后，將蛋胚下層的CAM膜暴漏。將載樣濾紙置于CAM和卵黃囊膜處血管較多部位，然后用滅菌透明膠封口，繼續(xù)培養(yǎng)至8天，除去覆蓋在雞胚上的透明膠布。對給藥部位進行拍攝，處理圖片，統(tǒng)計給藥組和對照組血管面積，計算兩組血管面積占CAM總面積的百分比(采用Adobe Photoshop CS5、Image-Pro Plus 6.0軟件對雞胚尿囊膜血管進行可視化和后續(xù)的面積定量，n＝2)。

血管破壞率(Distrupting Ratio，％)＝[1-(實驗組血管面積/溶劑對照組血管面積)]×100％。

實驗結果如表7。

表7：目標化合物對雞胚絨毛尿囊膜血管的影響

目標化合物的濃度為10μg/雞胚，以DMSO為對照。

實驗結果顯示，本發(fā)明的化合物可以促進腫瘤細胞分泌TNF-α，同時還能顯著的減少雞胚絨毛尿囊膜血管數(shù)目。因此，本發(fā)明的化合物能夠用于制備抗腫瘤藥物。

試驗例4：對肺癌荷瘤小鼠腫瘤血管的破壞作用

實驗步驟：

(1)小鼠LLC皮下荷瘤模型的建立

將實驗室內(nèi)Lewis肺癌細胞荷瘤的C₅₇BL/6小鼠脫頸處死，75％酒精中浸泡消毒1～2min。之后在無菌操作臺內(nèi)分離其皮下瘤塊，生理鹽水沖洗2遍，放在事先經(jīng)過高溫滅菌的150～200目不銹鋼篩網(wǎng)上，剪刀剪碎后充分研磨。篩網(wǎng)下置盛有適量無菌生理鹽水的玻璃培養(yǎng)皿收集研碎后的細胞，并將收集到的所有細胞液合并于離心管中，1500rpm離心5min。棄上清，用適量無菌生理鹽水重懸制成細胞懸液，充分吹打均勻，轉(zhuǎn)移至25cm²培養(yǎng)瓶中，封口膜封口待用。

用75％酒精棉球擦拭消毒C₅₇BL/6小鼠右側(cè)腋下皮膚，1ml注射器吸取配好的細胞懸液注入小鼠腋下皮下，每只0.2ml(每只鼠在吸取細胞液時都注意充分混勻)，停針2～3s后翻轉(zhuǎn)針頭拔針。接種完畢后，隔天記錄各組小鼠的體重變化和瘤體生長情況。按公式V＝D(長徑)×d²(短徑)/2計算瘤體體積。若動物發(fā)生死亡，記錄其存活時間并視情況解剖觀察其體內(nèi)腫瘤侵染情況。

(2)給藥與檢測

待瘤體直徑長至約10mm時，除去未成瘤動物。剩余所有成瘤鼠按瘤體大小進行適當調(diào)整，使每組樣本盡量平均分配。試藥組相應腹腔注射DMXAA(20mg/kg)、實施例2化合物(20mg/kg)，對照組腹腔注射相應體積的1％DMSO。所有小鼠于給藥3h后尾靜脈注射熒光染料Hoechst 33342(800μg/mouse,0.1ml)。注射1min后將小鼠脫頸處死，剝離瘤體拍照、稱重，計算瘤體體積，并迅速用錫箔紙包好，凍存于液氮中進行冷凍切片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

實驗結果：如附圖1、2、3(3A、3B、3C)所示。

結果表明，實施例2化合物能破壞腫瘤血管，減少腫瘤血液灌注。

盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。