本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種燈盞花乙素苷元衍生物及其制備方法、制劑與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)，特別是中老年人健康的常見(jiàn)病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居各種死因首位。目前，我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2.7億人，我國(guó)每年死于心腦血管疾病近300萬(wàn)人，占我國(guó)每年總死亡病因的51%。心腦血管疾病已成為人類(lèi)死亡病因最高的頭號(hào)殺手，也是人們健康的“無(wú)聲兇煞”。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多” ，即“四高一多”的特點(diǎn)。即使應(yīng)用目前最先進(jìn)、完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，而幸存下來(lái)的患者75%不同程度喪失勞動(dòng)力，40%重殘，由此導(dǎo)致的家庭、醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)已成為不可小覷的社會(huì)問(wèn)題。因此研制更多療效顯著、安全的心腦血管疾病治療藥物是極為迫切的事情。
在中國(guó)血栓性疾病已經(jīng)成為了各種疾病中最主要至殘和致死的的病因之一。這些疾病包括：急性冠脈綜合征：包括不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死，心臟猝死，外周動(dòng)脈阻塞，缺血性中風(fēng)，深靜脈血栓(DVT)，肺動(dòng)脈栓塞等。盡管目前對(duì)以上血栓性疾病的治療手段和藥物上有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但由于這些藥物均存在不同程度的缺陷，如抗血栓作用不強(qiáng)或因完全阻斷了機(jī)體的抗凝機(jī)制而觸發(fā)內(nèi)出血現(xiàn)象。因此臨床上可以選擇的治療手段和藥物仍然十分有限，急需更有效而且安全性更高的抗血栓新藥來(lái)替代現(xiàn)有的治療方法，以滿足目前日益增長(zhǎng)的臨床需求。
分子病理學(xué)研究顯示體內(nèi)血栓的形成過(guò)程主要有血小板聚集激活和血液凝固反應(yīng)激活兩大機(jī)制參與。兩個(gè)機(jī)制各有不同的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。阿司匹林和雷比格雷是強(qiáng)烈的血小板聚集抑制劑，在臨床上常用于血栓防治。而肝素鈉，磺達(dá)肝素和法華林則屬于抗凝劑，作用于血液凝集通路，在臨床上也廣泛使用于各種血栓性疾病的預(yù)防與治療。但上述兩大常規(guī)抗血栓藥物的一個(gè)主要副作用就是部分患者使用之后引發(fā)內(nèi)出血。
血液凝固即液體狀態(tài)血液變成固體凝膠或凝塊的過(guò)程。其主要機(jī)制為凝血酶將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性鉸鏈狀纖維蛋白絲，這是復(fù)雜的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的最后一步。凝血酶主要通過(guò)兩條激活通路形成：1、內(nèi)源性通路：引發(fā)于因子十二(XIIa)的活化；2、外源性通路：引發(fā)于分布在血管內(nèi)壁細(xì)胞表面的組織因子與因子七的結(jié)合。凝血因子X(jué)a是一種絲氨酸蛋白酶, 位于血液凝集級(jí)聯(lián)的上游, 處在連接內(nèi)源性和外源性激活途徑共同通路的中心位置, 它既能阻斷內(nèi)源性凝血亦能抑制外源性凝血的發(fā)生，是當(dāng)今抗血栓藥物研究的的最新靶點(diǎn)。研究表明在凝集通路中一個(gè)分子的Xa可以激活并產(chǎn)生出數(shù)百個(gè)分子的凝血酶，因此抗Xa活性是一種比抑制凝血酶更有效的阻止纖維蛋白形成的手段。已有大量的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明Xa抑制對(duì)阻止纖維蛋白的形成比抑制凝血酶的作用要強(qiáng)，而且持續(xù)時(shí)間要長(zhǎng)得多。此外Xa特異性抑制劑對(duì)凝血酶無(wú)抑制作用，因而不會(huì)影響到已經(jīng)形成的凝血酶的活性，從而減少了患者使用后潛在的內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn)。因此針對(duì)Xa抑制劑的研究已經(jīng)成為當(dāng)代抗血栓新藥研究公認(rèn)的潮流。例如2008年上市的利伐沙班、2011年上市的依杜沙斑以及2012年上市的阿哌沙班。其他新的Xa因子抑制劑如 letaxaban， darexaban，eribaxaban LY517717等相繼進(jìn)入了不同階段的試驗(yàn)。
燈盞花乙素苷元，又叫野黃芩苷元，金黃紫堿（Scutellarein,CAS:529-53-3,分子式C15H10O6,分子量：286.24），其結(jié)構(gòu)式如下：
燈盞花乙素苷元具有較強(qiáng)的生物活性。由于燈盞花乙素苷元水溶性和脂溶性都十分差，難透過(guò)生物膜，故吸收較差，生物利用度極低，另外，燈盞花乙素苷元分子中含有4個(gè)酚羥基，易氧化變性。因此，藥物設(shè)計(jì)家紛紛合成大量的新化合物，以期在藥理作用不變的情況下，增強(qiáng)新化合物的水溶性或脂溶性，降低氧化性從而提高藥物穩(wěn)定性，最終發(fā)現(xiàn)藥理活性更強(qiáng)、更穩(wěn)定的藥物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一目的在于提供一種燈盞花乙素苷元衍生物；第二目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生的制備方法；第三目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生物的制劑；第四目的在于提供所述燈盞花乙素苷元衍生物的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有下述結(jié)構(gòu)：
其中，R為具有生物活性的化合物殘基。
本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶與原料氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)得到目標(biāo)物燈盞花乙素苷元衍生物。
該反應(yīng)的反應(yīng)式為：
。
本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物中加入藥學(xué)上接受的輔料制備成片劑、膠囊劑、注射液或凍干粉針劑。
本發(fā)明的第四目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的燈盞花乙素苷元衍生物在制備深靜脈血栓、肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和血液凝集疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物具有明顯的抗凝血作用，可用于作為潛在的先導(dǎo)化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物中運(yùn)用。本發(fā)明所述的燈盞花苷元衍生物的制備方法簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好，環(huán)境污染小，可用于所述的燈盞花苷元衍生物的大量制備。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有下述結(jié)構(gòu)：
其中，R為具有生物活性的化合物殘基。
R為、、、或。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制備方法，是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶與原料氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)得到目標(biāo)物燈盞花乙素苷元衍生物。
所述的制備方法是以原料4-氟苯硼酸、3-氟苯硼酸、4-苯基苯硼酸、4-三氟基苯硼酸或4-硼酸吡啶在鈀催化劑和有機(jī)溶劑存在下，與氯代三甲氧基色原酮發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)得到目標(biāo)物燈盞花乙素苷元衍生物。
該反應(yīng)的反應(yīng)式為：
催化劑是指能提高化學(xué)反應(yīng)速率，而本身結(jié)構(gòu)不發(fā)生永久性改變的物質(zhì)。
所述的鈀催化劑為三苯基磷鈀。
有機(jī)溶劑是指溶劑中包含碳原子的能溶解不溶于水的物質(zhì)的一類(lèi)有機(jī)化合物，包括鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化物、含氮化合物及含硫化合物等多類(lèi)物質(zhì)，在常溫常壓下呈液態(tài)，具有較大的揮發(fā)性，在溶解過(guò)程中，溶質(zhì)與溶劑的性質(zhì)均無(wú)改變。
所述的有機(jī)溶劑為鏈烷烴、烯烴、醇、醛、胺、酯、醚、酮、芳香烴、氫化烴、萜烯烴、鹵代烴、雜環(huán)化合物、含氮化合物或含硫化合物。
所述的有機(jī)溶劑為二氧六環(huán)、叔丁基甲基醚或四氫呋喃。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制劑為所述的燈盞花乙素苷元衍生物中加入藥學(xué)上接受的輔料制備成片劑、膠囊劑、注射液或凍干粉針劑。
本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的應(yīng)用為所述的燈盞花乙素苷元衍生物在制備深靜脈血栓、肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和血液凝集疾病藥物中的應(yīng)用。
纖維蛋白原在凝血酶的作用下可以轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）是反映凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的時(shí)間，常用于檢測(cè)藥物對(duì)于外源性凝血系統(tǒng)的影響。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明參照Markwardt的凝血酶滴定方法考察本發(fā)明所述化合物對(duì)凝血酶時(shí)間的影響。結(jié)果顯示不加藥物時(shí)，纖維蛋白原與凝血酶作用，約25s發(fā)生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纖維蛋白原與凝血酶作用約40.5s發(fā)生凝固。而本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物在各濃度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可顯著延長(zhǎng)纖維蛋白原的凝結(jié)時(shí)間（p<0.05）。表明本發(fā)明所述燈盞花乙素苷元衍生物對(duì)于外源性凝血系統(tǒng)的影響顯著，具有明顯的抗凝血作用。
在本發(fā)明的另一具體實(shí)施例中，建立凝血因子十（FXa）抑制劑活性檢測(cè)的反應(yīng)體系，根據(jù)凝血因子十（FXa）水解底物的熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光，來(lái)檢測(cè)化合物對(duì)凝血因子十（FXa）的抑制活性。結(jié)果顯示KPC-4000001號(hào)化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.14uM，KPC-4000002號(hào)化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.21uM，KPC-4000003號(hào)化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.15uM，KPC-4000004號(hào)化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.19uM，KPC-4000005號(hào)化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）的IC50值為0.36uM，利伐沙班的IC50值為0.23nM。表明本發(fā)明所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）對(duì)凝血因子十（FXa）具有明顯的抑制作用。
綜上所述，本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物具有明顯的抗凝血的作用，可用于作為潛在的先導(dǎo)化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物中運(yùn)用。
本發(fā)明所述的化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）可以和常規(guī)的輔料組合制成治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物，包括口服液、顆粒劑、片劑、丸劑、散劑、膠囊劑和滴丸劑等。
本發(fā)明還提供了一種藥物制劑，包括治療有效量的本發(fā)明所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）和藥學(xué)上可接受的輔料。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將所述化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）直接或間接加入制備不同劑型時(shí)所需的藥學(xué)上可接受的各種常用輔料，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用制劑如片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。其中，填充劑如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解劑如瓊脂，碳酸鈣，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉，低取代羥丙基纖維素；潤(rùn)滑劑如滑石粉，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂硫酸鈉；粘合劑如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯膠。
本發(fā)明所述的化合物（燈盞花乙素苷元衍生物）是全新結(jié)構(gòu)的化合物，具有明顯的抗凝血作用，可用于作為潛在的先導(dǎo)化合物，在制備治療深靜脈血栓和肺血栓栓塞、心腦血管疾病、中風(fēng)和其他與血液凝集相關(guān)的疾病的藥物中運(yùn)用。本發(fā)明所述的燈盞花乙素苷元衍生物的制備方法簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好，環(huán)境污染小，可用于燈盞花乙素苷元衍生物的大量制備。
下面以具體實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：
實(shí)施例1 KPC-4000001的制備
在一反應(yīng)瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物8(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮?dú)?。反?yīng)在100 ℃下進(jìn)行5小時(shí)，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機(jī)層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體200 mg，收率：55%。1H NMR : 7.87 (dd, J = 5.3, 8.8 Hz, 2 H), 7.19 (t, J = 8.6 Hz, 2 H), (400MHz , CDCl3) 6.80 (s, 1 H), 6.62 (s, 1 H), 3.98 (s, 3 H), 3.97 (s, 3 H), 3.91 (s, 3 H)
實(shí)施例2 KPC-4000002的制備
在一反應(yīng)瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物9(186.0 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮?dú)?。反?yīng)在100 ℃下進(jìn)行5小時(shí)，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機(jī)層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體280 mg，收率：76%。1H NMR : 7.65 (d, J = 8.3 Hz, 1 H), 7.62 - 7.57 (m, 1 H), 7.48 (dt, (400MHz , CDCl3) J =5.9, 8.0 Hz, 1 H), 7.22 (dt, J = 2.4, 8.2 Hz, 1 H), 6.82 (s, 1 H), 6.67 (s, 1 H), 3.99 (s, 6 H), 3.92 (s, 3 H).
實(shí)施例3 KPC-4000003的制備
在一反應(yīng)瓶中加入化合物7(250.0 mg, 0.93 mmol), 化合物10(210.5 mg, 1.11 mmol),碳酸鈉(195.8 mg, 1.85 mmol),四(三苯基膦)鈀(53.4 mg, 0.046mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮?dú)?。反?yīng)在100 ℃下進(jìn)行5小時(shí)，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機(jī)層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體210 mg，收率：60%。1H NMR (400MHz , CDCl3)：7.99 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.76 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 6.83 (s, 1 H), 6.71 (s, 1 H), 3.99 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.92(s, 3 H)
實(shí)施例4 KPC-4000004的制備
在一反應(yīng)瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物11(198.3 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮?dú)?。反?yīng)在100 ℃下進(jìn)行5小時(shí)，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機(jī)層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體266 mg，收率：62%。1H NMR : 7.96 (d, J = 8.3 Hz, 2 H), 7.74 (d, J = 8.6 Hz, 2 H), 7.65 (400MHz , CDCl3) (d, J = 7.7 Hz, 2 H), 7.53 - 7.46 (m, 2 H), 7.44 - 7.36 (m,1 H), 6.85 (s, 1 H), 6.73 (s, 1 H), 4.01 (s, 3 H), 4.00 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
實(shí)施例5 KPC-4000005的制備
在一反應(yīng)瓶中加入化合物7(300.0 mg, 1.11 mmol), 化合物12(163.5 mg, 1.33 mmol),碳酸鈉(234.9 mg, 2.22 mmol),四(三苯基膦)鈀(64.0 mg, 0.055mmol),1,4-二氧六環(huán)(5.0 mL)和水(0.5 mL)，置換氮?dú)狻７磻?yīng)在100 ℃下進(jìn)行5小時(shí)，TLC(石油醚：乙酸乙酯=6:4)顯示反應(yīng)完全，將反應(yīng)液倒入冰水(10 mL)中，用乙酸乙酯(5 mL× 3),合并有機(jī)層，用10 mL飽和氯化鈉洗滌一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋干得到粗產(chǎn)品用柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:4)純化，得到白色固體52 mg，收率：15%。1H NMR :8.84 - 8.75 (m, 2 H), 7.77 - 7.70 (m, 2 H), 6.83 (s, 1 H), (400MHz , CDCl3) 6.77 (s, 1 H), 4.00 (s, 3 H), 3.99 (s, 3 H), 3.93 (s, 3 H)
上述實(shí)施例1～5制得的化合物見(jiàn)表1：
表1 實(shí)施例1-5制得的化合物
實(shí)施例6 本發(fā)明所述化合物對(duì)凝血酶時(shí)間的影響
凝血酶時(shí)間是反映凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明所述化合物對(duì)凝血酶時(shí)間影響的測(cè)定參照Markwardt的凝血酶滴定方法進(jìn)行。具體方法為于酶標(biāo)板小孔中加入200μL，0.5%人纖維蛋白原，再加入1μL樣品液，充分混勻。用微量進(jìn)樣器吸取5μL凝血酶溶液（100U/mL）迅速混勻并計(jì)時(shí)，記錄纖維蛋白原發(fā)生凝固的時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表2：
表2 對(duì)凝血酶時(shí)間（TT）的影響
注：所有結(jié)果均為3次試驗(yàn)結(jié)果的平均值
由表2結(jié)果可見(jiàn)，不加藥物時(shí)，纖維蛋白原與凝血酶作用，約25s發(fā)生凝固，加入肝素（Heparin，0.725mg/mL)后，纖維蛋白原與凝血酶作用約40.5s發(fā)生凝固。而本發(fā)明所述化合物在各濃度（0.725 mg/mL，1.25 mg/mL和2.5mg/mL）均可顯著延長(zhǎng)纖維蛋白原的凝結(jié)時(shí)間（p<0.05）。
實(shí)施例7 本發(fā)明所述化合物對(duì)凝血因子十（FXa）的影響
實(shí)驗(yàn)試劑：成套pH校準(zhǔn)緩沖劑，上海市愛(ài)建試劑廠出品，批號(hào)920515；Tris-base，Purity≥99.9%，Amresco產(chǎn)品，Exp2012/12；濃HCl，云南汕滇藥業(yè)有限公司，批號(hào)20090420；NaOH，云南汕滇藥業(yè)有限公司，批號(hào)20091001；二甲基亞砜（DMSO）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20110816；KH2PO4 ，汕頭市達(dá)豪精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)20090304；K2PO4.3H2O，天津市風(fēng)帆化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)0100722；KOH，云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20110223； Xa因子Factor X Activated，Sigma，F(xiàn)9302－50UG；FXa熒光底物，hyphen biomed公司合成；利伐沙班原料；純化水，現(xiàn)取現(xiàn)用，存放不超過(guò)3d。
實(shí)驗(yàn)設(shè)備：HS-25型pH計(jì)，上海雷磁科學(xué)儀器廠；超聲波清洗器，SK8200H，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；SYNERGY HT酶標(biāo)儀，BioTek；0.5～10單道微量移液器，F(xiàn)innpipette；0.5～10ul單道微量電子移液器， 10～100ul單道微量移液器，10～300單道微量電子移液器，50～1000單道微量電子移液Eppendorf。
供試品按以下方法配制：
KPC-4000001號(hào)化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000002號(hào)化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000003號(hào)化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000004號(hào)化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
KPC-4000005號(hào)化合物用DMSO配制成1mM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10uM、3.33uM、1.11uM、0.37uM、0.123uM、0.041uM。
利伐沙班用DMSO配制成1uM，之后3倍稀釋，對(duì)應(yīng)的體系終濃度為10nM、3.33nM、1.11nM、0.37nM、0.12nM、0.041nM、0.0137nM、0.0045nM。
取上述配制好的供試品1ul加入至100ul反應(yīng)體系中（PH7.8，去離子水、0.2mM的熒光底物、1M的Tris-HCl加1.6M的NaCl緩沖液），室溫孵育10min，再加入0.25mg/L的FXa，調(diào)節(jié)酶標(biāo)儀激發(fā)光為342nM，發(fā)射光440nM，反應(yīng)5min（時(shí)間間隔為60s），測(cè)定熒光強(qiáng)度，以利伐沙班作為陽(yáng)性對(duì)照，不加FXa的作為陰性對(duì)照，計(jì)算抑制率。用抑制率對(duì)供試品濃度的對(duì)數(shù)做圖，得到KPC-4000001號(hào)化合物的IC50值為0.14uM，KPC-4000002號(hào)化合物的IC50值為0.21uM，KPC-4000003號(hào)化合物的IC50值為0.15uM，KPC-4000004號(hào)化合物的IC50值為0.19uM，KPC-4000005號(hào)化合物的IC50值為0.36uM，利伐沙班的IC50值為0.23nM。
以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。