本發(fā)明涉及植物有效成分提取領(lǐng)域，特別是一種采用罐組裝動態(tài)逆流法提取鐵皮石斛中石斛酚的工藝。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛為蘭科石斛屬多年生草本植物。石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛在《中國藥典》2015年版有收載。鐵皮石斛為藥食兩用珍貴植物資源。鐵皮石斛因表皮呈鐵綠色而得名，為石斛之極品，以其莖入藥，嫩莖扭成螺旋狀或彈簧狀后曬干，商品稱為耳環(huán)石斛，又名楓斗，屬補益藥中的補陰藥。從中醫(yī)學角度總結(jié)鐵皮石斛主要的十大功效有：1、滋養(yǎng)陰津，2、增強體質(zhì)，3、補益脾胃，4、護肝利膽，5、強筋降脂，6、降低血糖，7、抑制腫瘤，8、明亮眼睛，9、滋養(yǎng)肌膚，10、延年益壽。
鐵皮石斛中多糖含量一般在20-30％之間，其多糖成分與增強機體免疫機能、抗腫瘤、抗衰老、抗疲勞、降血糖等藥理作用有著密切聯(lián)系。鐵皮石斛中不僅具有豐富的多糖成分通過抗氧化作用或增強機體細胞免疫功能間接抗腫瘤作用，還具有直接的抗癌活性物質(zhì)基礎(chǔ)是其含有的菲類和聯(lián)芐類化合物，對腫瘤細胞的細胞周期以及細胞周期蛋白表達有影響，使癌細胞的增殖受到抑制。
特別目前，很多產(chǎn)品集中于開發(fā)鐵皮石斛中的多糖，對于提取多糖后的藥渣，尚不能得到充分、合理、有效高效的利用。本發(fā)明針對于多糖提取后的鐵皮石斛藥渣，對其中的有效聯(lián)芐類有效小分子—石斛酚進行高效富集和純化。
其中聯(lián)芐類化合物石斛酚((4-(3-羥基-5-甲氧基苯乙基)-2-甲氧基苯酚)具有抗誘變活性，可阻滯由脂多糖誘導的誘導型一氧化氮合酶和環(huán)氧合酶-2的表達。另據(jù)研究表明石斛酚是石斛中抗白內(nèi)障的有效成分，它能有效抑制AR(醛糖還原酶)，改善糖尿病患者多元醇代謝通路異常，預防和延遲糖尿病及其并發(fā)癥白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展。
目前，尚未見關(guān)于石斛酚富集純化工藝研究報道，其有關(guān)含量測定法，主要采用包括浸漬法、滲漉法、水提煎煮法、回流提取法等傳統(tǒng)方法進行提取。隨著技術(shù)的不斷改進以及新型提取設(shè)備的研制，越來越多先進的提取分離手段被開發(fā)出來，本發(fā)明采用罐組裝動態(tài)逆流法提取的鐵皮石斛中石斛酚。
罐組式罐組裝動態(tài)逆流提取工藝，是將兩個以上的動態(tài)提取罐機組串聯(lián)，提取溶劑沿著罐組內(nèi)各罐藥料的溶質(zhì)濃度梯度逆向地由低向高順次輸送通過各罐，并與藥料保持一定提取時間并多次套用。此技術(shù)主要利用了固液(藥材與溶劑)兩相中有效成分的濃度梯度差，逐級將藥材中有效成分擴散至起始濃度較低的提取溶劑中，達到最大限度轉(zhuǎn)移藥材中有效成分的目的。采用罐組式逆流提取工藝，能有效地利用固液兩相的濃度梯度，增大濃度差，提取速率快，提取液的濃度增高，提取周期短，提取的同時利用藥材本體作濾層，可提高澄明度。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的主要在于開發(fā)高效富集純化鐵皮石斛中石斛酚的工藝，采用罐組式罐組裝動態(tài)逆流提取方式，通過合理排列各個提取單元之間提取液的濃度差，以及對鐵皮石斛藥材提取時間、提取溶劑、料液比等因素的優(yōu)選，最終實現(xiàn)一種以盡量少的溶劑、時間、能耗最大限度的提取鐵皮石斛中石斛酚的切實可行的實施方案。采用活性碳脫色、大孔樹脂吸附和正相柱色譜以及重結(jié)晶等現(xiàn)代提取分離手段對石斛酚進行純化精制。
為達到目的，本發(fā)明工藝步驟包括：
(1)提?。簩⒚撝蟮蔫F皮石斛藥渣，加入體積為鐵皮石斛藥渣質(zhì)量的10倍乙酸乙酯作提取溶劑，采用罐組式罐組裝動態(tài)逆流方式進行提取，濃縮至相對密度為1.10-1.15，得乙酸乙酯提取浸膏，備用；
(2)堿水處理：以浸膏與飽和碳酸溶液質(zhì)量體積比1g:15-25ml，加入飽和碳酸鈉溶液，攪拌反應(yīng)2-3小時后，3000r/min轉(zhuǎn)速離心，得上清液；
(3)除雜：往步驟(2)所得上清液中加入活性碳，攪拌1小時后，靜置3-24小時后，收集上清液，將殘留物濃縮至相對密度為1.10-1.15得浸膏；
(4)酸中和：往步驟(3)所得上清液中充二氧化碳氣體，以30mL/min氣體流速，連續(xù)充二氧化碳氣體1-2小時，得白色絮狀沉淀，離心，棄上清液，得沉淀，并用蒸餾水清洗兩遍；
(5)RP-C18反相硅膠純化：將沉淀用最小量無水乙醇溶解，制成濃溶液，供上反相硅柱膠層析分離；層析過程包括：①RP-C18反相硅膠預處理：使用95％乙醇充分浸泡，然后使用乙醇水梯度洗脫②上樣吸附：將含有石斛酚的浸膏乙醇水液抽濾后，上預先處理好的反相硅膠進行上樣吸附；③層析洗脫，上樣后，先以水，再以乙醇-水系統(tǒng)作為流動相梯度洗脫，薄層色譜法跟蹤監(jiān)測，收集含有石斛酚洗脫液；
(6)精制：將收集到的含有石斛酚洗脫液，反復重結(jié)晶得到白色結(jié)晶狀石斛酚樣品。
提取流程：該提取方式以3罐為一組，每罐依次循環(huán)提取3次，其步驟為：首先，將鐵皮石斛藥材粉末置第一罐，利用低極性溶劑進行罐組裝動態(tài)逆流脫脂；將第一罐脫脂后的藥材均分為三份，分別放入第二、三罐，第二罐第二次提取的藥液作為第三罐第一次提取的溶劑，提取后將藥液過濾儲備，第三次提取的藥液作為第二罐第二次提取的溶劑，即每罐第N次提取所加溶劑均為上一罐第N+1次的提取液，每罐第三次提取時所加溶劑為純?nèi)軇谝还匏幉慕?jīng)三次提取后，排出藥渣，作為第二罐的新藥材，再第二罐中加入第三罐第二次的提取液進行第一次提取，作為該罐組下一輪循環(huán)提取的最末罐，以后各步驟按上述方法一次循環(huán)。
提取的具體工藝參數(shù)為：第一罐藥材第一次提取加入5～10倍量提取溶劑，第二次、三次分別加入3～6倍量進行脫脂；將第一罐脫脂后的藥材放入第二罐，并往第二罐中加入6～10倍量提取溶劑，第三罐藥材第一次提取在加入上一罐藥液的基礎(chǔ)上分別補充1～3倍量溶劑；每罐藥材共提取3次，每次提取時間均為1～2小時；提取溫度為80℃；動態(tài)提取的攪拌頻率為120～200轉(zhuǎn)/分鐘，通過電機驅(qū)動的機械攪拌實現(xiàn)，使提取罐內(nèi)各處溫度一致的同時增加物料與溶劑的接觸面積，提高提取率。
其中，步驟(5)層析洗脫中乙醇-水系統(tǒng)可為20％、40％、60％、80％、95％。
其中，步驟(6)重結(jié)晶中乙醇-水重結(jié)晶系統(tǒng)可為40％、50％、60％、70％。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
1、采用罐組式罐組裝動態(tài)逆流提取代替了傳統(tǒng)的單罐式多次提取，確保罐組間較大的有效成分濃度差，大大增加了提取推動力，加快了提取速率；常溫提取節(jié)省熱能，縮短了提取周期；罐組式提取通過溶劑的反復利用，提高了最終溶劑中有效成分的濃度，降低后續(xù)濃縮耗能。此外，每罐藥材最后一次提取均加入純?nèi)軇?，可有效控制藥渣中石斛酚的含量，確保鐵皮石斛中石斛酚被提凈，具有有效成分提取率高的優(yōu)點。經(jīng)實驗，與傳統(tǒng)的提取工藝相比，本發(fā)明可使提取溶劑用量至少減少45％，相應(yīng)的節(jié)約熱能約60％，提取率提高20％，而且隨著罐組數(shù)的增加，這種優(yōu)勢愈加明顯；
2、采用攪拌式動態(tài)提取代替了傳統(tǒng)的靜態(tài)提取，可以有效避免鐵皮石斛粉末的粘鍋糊化，此外，動態(tài)提取提高了石斛酚從藥材表面到溶劑的擴散，實現(xiàn)快速平衡，縮短提取時間；
3、通過強堿成鹽反應(yīng)和酸中和還原，可大大提高鐵皮石斛中石斛酚的提取效率；
4、應(yīng)用醇沉、活性碳脫色、RP-C18硅膠分離純化石斛酚，分離效果理想，有機溶劑使用少，工藝簡單，樹脂可重復再生利用、成本低、設(shè)備簡單、投資少、工業(yè)化前景較好；
5、采用重結(jié)晶技術(shù)獲得含量高達98％石斛酚純品。
附圖說明
圖1為本發(fā)明工藝流程圖
具體實施方式
實施例1
取干燥鐵皮石斛藥材，粉碎，過60目篩，稱取200g。將鐵皮石斛粉末置提取罐1內(nèi)。第一罐藥材第一次提取加入10倍量石油醚脫脂，脫脂兩遍后，將第一罐脫脂后的藥材均分為三份，分別放入第一、二、三罐，三罐中分別加入8倍量的乙酸乙酯，進行第一次提取。第二次、三次提取分別加入5倍量的乙酸乙酯，第二罐第二次提取的藥液作為第三罐第一次提取的溶劑，提取后將藥液過濾儲備，第三次提取的藥液作為第二罐第二次提取的溶劑，即每罐第N次提取所加溶劑均為上一罐第N+1次的提取液，每罐第三次提取時所加溶劑為純?nèi)軇?。第一罐藥材?jīng)三次提取后，排出藥渣，作為第二罐的新藥材，再第二罐中加入第三罐第二次的提取液進行第一次提取，作為該罐組下一輪循環(huán)提取的最末罐，以后各步驟按上述方法一次循環(huán)。每罐藥材共提取3次，每次提取時間為1.5小時。得粗浸膏19.8g。加入300ml飽和碳酸鈉溶液，攪拌反應(yīng)3小時；將活性炭粉末加入飽和碳酸鈉溶液中，繼續(xù)攪拌充分吸附3小時，活性炭的加入量為物料的8倍W/V。攪拌結(jié)束后，放置24小時，收集上清液，將殘留物濃縮至相對密度為1.13得浸膏，往上清液中充入二氧化碳2小時，攪拌1小時后，3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘；將上述得到的石斛酚富集物3.2g用5ml乙醇溶解，以3BV/h上預處理過的RP-C18硅膠柱進行吸附分離，先用水洗脫，再以水-乙醇系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測，收集石斛酚段洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后往里面加入等體積無水乙醇，使之成為50％乙醇溶液，加熱使充分溶解，溶解后靜置析出結(jié)晶，重結(jié)晶兩次，得白色晶體，即石斛酚，經(jīng)HPLC測定產(chǎn)物純度為98％，提取率為0.02％。
實施例2
取干燥鐵皮石斛藥材，粉碎，過60目篩，稱取100g。將鐵皮石斛粉末置提取罐1內(nèi)，第一罐藥材第一次提取加入10倍量石油醚脫脂，脫脂兩遍后，將第一罐脫脂后的藥材均分為三份，分別放入第一、二、三罐，三罐中分別加入10倍量的乙酸乙酯，進行第一次提取，第二次、三次提取分別加入3倍量的乙酸乙酯，第二罐第二次提取的藥液作為第三罐第一次提取的溶劑，提取后將藥液過濾儲備，第三次提取的藥液作為第二罐第二次提取的溶劑，即每罐第N次提取所加溶劑均為上一罐第N+1次的提取液，每罐第三次提取時所加溶劑為純?nèi)軇５谝还匏幉慕?jīng)三次提取后，排出藥渣，作為第二罐的新藥材，再第二罐中加入第三罐第二次的提取液進行第一次提取，作為該罐組下一輪循環(huán)提取的最末罐，以后各步驟按上述方法一次循環(huán)。每罐藥材共提取3次，每次提取時間為1.5小時，得粗浸膏9.8g，將粗提物用240ml飽和碳酸鈉溶液充分混懸，攪拌反應(yīng)3小時；將活性炭粉末加入飽和碳酸鈉溶液中，繼續(xù)攪拌充分吸附3小時，活性炭的加入量為物料的8倍W/V。攪拌結(jié)束后，放置24小時，吸濾上部清液，再用6倍量清水洗滌，離心或吸濾，合并清液，往濾液中充入二氧化碳2小時，充分攪拌反應(yīng)，攪拌1小時后，3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘；將上述得到的石斛酚富集物1.56g用5ml乙醇溶解，以3BV/h上預處理過的RP-C18硅膠柱進行吸附分離，先用水洗脫，再以水-乙醇系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測，收集石斛酚段洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后往里面加入等體積無水乙醇，使之成為50％乙醇溶液，加熱使充分溶解，溶解后靜置析出結(jié)晶，重結(jié)晶兩次，得白色晶體，即石斛酚，經(jīng)HPLC測定產(chǎn)物純度為97％，提取率為0.02％。
實施例3
取干燥鐵皮石斛藥材，粉碎，過60目篩，稱取100g。將鐵皮石斛粉末置提取罐1內(nèi)。將鐵皮石斛粉末置2升圓底燒瓶中，使用10倍量石油醚90℃水浴回流兩遍，每遍3小時。將石油醚脫脂后藥材，抽濾后重新至2升圓底燒瓶中，加入600mL乙酸乙酯，90℃水浴回流提取3遍，每次3小時。得粗浸膏6.6克。將浸膏混懸于水中，依次使用石油醚、乙酸乙酯萃取浸膏，得乙酸乙酯部位4.2克。將420克MCI樹脂使用甲醇浸潤24小時，裝柱，使用3柱體積(BV)的10％甲醇水平衡柱子；將4.2克浸膏混懸于10mL10％甲醇水中，濕法上柱。依次使用3BV的10％甲醇水、30％甲醇水、50％甲醇水、70％甲醇水和90％甲醇水洗脫，通過薄層色譜法將含有石斛酚的部位濃縮，得富集物1.2g。將該富集物上ODS反相色譜柱，依次使用2BV的20％甲醇水、40％甲醇水、60％甲醇水、80％甲醇水。通過薄層色譜法跟蹤檢測，收集石斛酚段洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后往里面加入等體積無水乙醇，使之成為50％乙醇溶液，加熱使充分溶解，溶解后靜置析出結(jié)晶，重結(jié)晶兩次，得白色晶體，即石斛酚，經(jīng)HPLC測定產(chǎn)物純度為97％，提取率為0.01％。
實施例4
取干燥鐵皮石斛藥材，粉碎，過60目篩，稱取100g。將鐵皮石斛粉末置提取罐1內(nèi)，第一罐藥材第一次提取加入5倍量石油醚脫脂，脫脂1遍后，將第一罐藥材平均分為三份，分別置三個提取罐中。三罐中分別加入11倍量的乙酸乙酯，進行第一次提取，第二次、三次分別加入7倍量的乙酸乙酯，第二、三罐藥材是上一罐藥液的基礎(chǔ)上補充1倍量溶劑；每罐藥材共提取3次，每次提取時間為1小時。得粗浸膏7.8g，將粗提物用飽和碳酸鈉溶液充分混懸，攪拌反應(yīng)3小時；將活性炭粉末加入飽和碳酸鈉溶液中，繼續(xù)攪拌充分吸附3小時，活性炭的加入量為物料的8倍W/V。攪拌結(jié)束后，放置24小時，吸濾上部清液，再用6倍量清水洗滌，離心或吸濾，合并清液，往濾液中充入二氧化碳2小時，充分攪拌反應(yīng)，攪拌1小時后，3000轉(zhuǎn)每分鐘離心10分鐘。將上述得到的石斛酚富集物1.06g用5ml乙醇溶解，以3BV/h上預處理過的RP-C18硅膠柱進行吸附分離，先用水洗脫，再以水-乙醇系統(tǒng)梯度洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測，收集石斛酚段洗脫液，減壓濃縮至無醇味，然后往里面加入等體積無水乙醇，使之成為60％乙醇溶液，加熱使充分溶解，溶解后靜置析出結(jié)晶，重結(jié)晶兩次，得白色晶體，即石斛酚，經(jīng)HPLC測定產(chǎn)物純度為97％，提取率為0.008％。
上述實施例1和實施例2為本發(fā)明方法，實施例3為采用傳統(tǒng)的回流方法即非罐組裝提取方法結(jié)合柱層析法，實施例4所采用工藝為為本發(fā)明工藝參數(shù)范圍之外。由石斛酚得量可以知，實施例1和實施例2得率均超過了實施例3和實施例4。其中，實施例3相比之下，高耗能，且富集過程遠復雜，消耗有機溶劑要多，而且得率低。實施例4芪類物質(zhì)得量遠少于實施例1和實施例2。由此可見，本發(fā)明石斛酚提取純化方面具有顯著的優(yōu)勢。