本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是從海洋動物肉芝軟珊瑚中分離得到的一種新型四萜類化合物及其在抗腫瘤方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
肉芝軟珊瑚(Sarcophyton)屬于八放珊瑚亞綱(Octocorallia)、軟珊瑚目(Alcyonacea)、軟珊瑚科(Alcyoniidae)動物。對其研究可以追溯到1974年，從S.glaucum中分離得到的sarcophine標(biāo)志著肉芝軟珊瑚屬珊瑚中二萜類化合物研究的開始〔Ne′emanI,FishelsonL,KashmanY.Sarcophine.NewtoxinfromthesoftcoralSarcophytonglaucum(Alcyonaria).Toxicon,1974,12(6):593-598.〕。在此后的近40年的時間里，此類化合物因其豐富的化學(xué)多樣性和顯著的生物活性逐步成為天然產(chǎn)物研究的熱點之一。相關(guān)研究在NaturalProductReports海洋天然產(chǎn)物年度綜述中有連續(xù)報道，印度學(xué)者于1997年對于肉芝軟珊瑚屬動物之前的研究概況進(jìn)行了較為詳細(xì)的綜述〔AnjaneyuluASR,RaoGV.ChemicalconstituentsofthesoftcoralspeciesofSarcophytongenus:areview.JournalofIndianChemitrySociety,1997,74(4):272-278.〕，我國蘭州大學(xué)學(xué)者在2006年出版的專著中又對1970年到1998年該屬珊瑚中的西松烷型二萜化合物研究也給予了總結(jié)〔LiangXiao-tian,FangWei-shuo.Medicalchemistryofbioactivenaturalproducts.Hoboken:JohnWiley&SonsInc,2006:257-300.〕，最近郭躍偉小組又詳細(xì)綜述了1982年至2013年肉芝軟珊瑚屬中西松烷型二萜二聚化合物的化學(xué)和生物活性以及1995年至2011年肉芝軟珊瑚屬中萜類化合物化學(xué)和生物活性〔LiYu-fen,LiangLin-fu,GuoYue-wei,etal.ProgressinthestudyofbiscembranoidesfromthesoftcoralsofthegenusSarcophyton.ChineseJournalofOrganicChemistry,2013,33:1157-1166.；LiangLin-Fu,GuoYue-Wei.TerpenesfromthesoftcoralsofthegenusSarcophyton:chemistryandbiologicalactivities.Chemistry&Biodiversity,2013,10(12):2161-2196.〕，本發(fā)明人所在的課題組綜述了1988年至2013年肉芝軟珊瑚屬中西松烷型二萜的化學(xué)和生物活性〔俞慶,劉寶姝,張文,等.肉芝軟珊瑚屬中二萜類化合物的化學(xué)及生物活性.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報.2014,35(2):206-215.〕。對于肉芝軟珊瑚屬中的Sarcophytonsubviride種動物，到目前僅有一篇文獻(xiàn)于1992年對來自印度該種軟珊瑚的報道，并發(fā)現(xiàn)了9個甾體類化合物，其中4個為新甾體，但未報道活性〔RajuBL,SubbarajuGV,ReddyMC,etal.PolyhydroxysterolsfromthesoftcoralSarcophytonsubvirideofandamanandnicobarcoasta[J].JournalofNaturalProducts,1992,55(7):904-911.〕。肉芝軟珊瑚作為珊瑚家族的重要成員之一，其中的次生代謝產(chǎn)物主要有萜類(尤其西松烷型二萜)、甾體類和稀少的類胡籮卜素類、前列腺素類等，它們在珊瑚的防御、競爭、繁殖等方面可能發(fā)揮著重要的生態(tài)學(xué)功能，這些化合物在體外活性篩選中表現(xiàn)出抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒和保護(hù)骨骼等多種生物學(xué)活性，具有重要的藥用研究價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種從肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride中分離得到的一種新型四萜類化合物bissubvilidesA和B；本發(fā)明的第二目的在于提供以肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride為原料制備化合物bissubvilidesA和B的方法；本發(fā)明的第三目的在于提供化合物bissubvilidesA和B在制備抗腫瘤中的應(yīng)用。本發(fā)明從生長于中國南海西沙群島的肉芝軟珊瑚中提取分離到一種四萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：本發(fā)明的化合物bissubvilideA和bissubvilideB的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(ⅠA)、式(ⅠB)所示，中文名為肉芝軟珊瑚四萜素A和B：本發(fā)明化合物的制備方法和結(jié)構(gòu)鑒定如下：(1)bissubvilideA(1)和bissubvilideB(2)的制備A.提取：將肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride樣品剪碎，經(jīng)丙酮和甲醇超聲提取，乙醚-水、正丁醇-水和正己烷-90％甲醇水溶液萃取，將90％甲醇水溶液萃取液濃縮至干，得總提取物浸膏。B.分離：將上述總提取物浸膏進(jìn)行硅膠柱層析、SephandexLH-20凝膠柱層析、C18反相柱層析和高效液相色譜分離純化，薄層層析檢測，收集含有四萜類化合物的流分，濃縮至干，得到bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)。本發(fā)明化合物的制備方法具體為：將采自中國南海西沙群島的肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride切碎后，用丙酮和甲醇溶劑提取，所得的提取物濃縮后得到粗浸膏，將粗浸膏溶于水溶液，混懸均勻后用乙醚萃取，乙醚萃取液濃縮后混懸于90％甲醇溶液中，用正己烷萃取，所得90％甲醇溶液濃縮得紅褐色浸膏；浸膏干法上樣進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷/甲醇混合溶液從100:1到1:1為流動相梯度洗脫，得到16個組分Fr.A-P；其中Fr.I進(jìn)行SephadexLH-20凝膠柱分離，用甲醇/氯仿1:1的流動相洗脫，TLC點板合并成7個組分Fr.I1～I(xiàn)7；Fr.I1用半制備型HPLC分離，獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)式如(I)所示的化合物。所述的浸膏干法上樣，可參見文獻(xiàn)：孫文基，張登科，黨治穩(wěn)，天然藥物成分提取分離與制備，中國醫(yī)藥科技出版社，1999。所述的半制備型HPLC分離，條件為：78％甲醇-水溶液，流速：1.5mL/min。(2)bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)的結(jié)構(gòu)鑒定經(jīng)多種現(xiàn)代光譜分析，特別是綜合應(yīng)用多種先進(jìn)的二維核磁共振波譜的解析，確定了bissubvilidesA(1)和B(2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明還提供了上述化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。所述的腫瘤，具體為人骨肉瘤、肺癌等。本發(fā)明從海洋動物肉芝軟珊瑚中分離得到的一種新型四萜類化合物，為抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，對開發(fā)利用中國的海洋藥用生物資源具有重要意義。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。本發(fā)明所涉及的肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride，由宮俊于2012年6月采集自中國西沙群島永興島附近海域，樣品標(biāo)本保存于第二軍醫(yī)大學(xué)海域藥物研究室(編號GE-15)，經(jīng)中科院南海海洋研究所助理研究員李秀保鑒定為八放珊瑚亞綱、軟珊瑚目、軟珊瑚科、肉芝軟珊瑚屬、Sarcophytonsubviride種。實施例1：bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)的分離制備選擇中國西沙群島采集的肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride樣品(濕重4.1kg)，將其剪碎，再用機器粉碎，丙酮超聲提取7次，再用甲醇超聲提取3次，每次5L，30分鐘，至提取液基本無色。合并丙酮及甲醇提取液，減壓濃縮得粗浸膏，將粗浸膏用1L的蒸餾水超聲混懸，用乙醚萃取5次(1L/次)，合并乙醚萃取液，減壓濃縮，得棕色乙醚層浸膏110g。乙醚層浸膏用0.5L的90％甲醇-水溶液超聲混懸，用正己烷萃取5次(0.5L/次)，合并正己烷層萃取液，減壓濃縮得棕色浸膏100g，濃縮90％甲醇-水溶液得紅褐色浸膏10g。將90％甲醇-水溶液的10g，于20g硅膠(300-400目)拌樣，經(jīng)300g正相硅膠柱層析(柱內(nèi)徑約5.8cm，柱高約27.5cm，200-300目硅膠)，以二氯甲烷/甲醇梯度洗脫(100:1-1:1)，根據(jù)HSGF254薄層板監(jiān)測，并由10％的硫酸香草醛顯色，分別按流份極性大小收集，共收集合并得16個流份Fr.A～Fr.P。將Fr.I(116.0mg)經(jīng)過SephandexLH-20凝膠柱色譜層析(柱內(nèi)徑約2cm，柱高約143cm)，流動相為甲醇:氯仿＝1:1，由自動接收器收集，薄層板監(jiān)測，分為7個流分Fr.I1～I(xiàn)7，其中Fr.I1用半制備型HPLC進(jìn)行分離純化(78％甲醇-水溶液，流速：1.5mL/min)，獲得化合物1(3.5mg,tR＝45.1min)和化合物2(1.8mg,tR＝61.2min)。實施例2：bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)的結(jié)構(gòu)鑒定本發(fā)明從中國南海西沙群島肉芝軟珊瑚Sarcophytonsubviride中分離得到的2種新化合物，命名為bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)。表1是上述兩種化合物的核磁數(shù)據(jù)，具體理化數(shù)據(jù)如下：BissubvilideA(1):白色無定型粉末；旋光度電子圓二色譜ECD(MeOH,c3.0×10-4)λmax(Δε)＝202(+10.48),233(-2.91)nm；紫外吸收數(shù)據(jù)UV(MeOH)λmax(logε)203(4.35),230(3.93)nm；紅外吸收數(shù)據(jù)IR(film)νmax＝3417,2957,2931,1682,1651,1621,1446,1347cm-1；1Hand13CNMR數(shù)據(jù)見表1；高分辨質(zhì)譜HRESIMS[M+H]+m/z651.4263(calcdforC40H59O7,651.4255).BissubvilideB(2):白色無定型粉末；旋光度電子圓二色譜ECD(MeOH,c2.0×10-4)λmax(Δε)＝203(+9.70),240(-1.29)nm；紫外吸收數(shù)據(jù)UV(MeOH)λmax(logε)205(4.59),238(4.35)nm；紅外吸收數(shù)據(jù)IR(film)νmax＝3427,2929,2857,1713,1674,1451,1374,1238cm-1；1Hand13CNMR數(shù)據(jù)見表1；高分辨質(zhì)譜；HRESIMS[M+H]+m/z649.4109(calcdforC40H57O7,649.4099).表1.bissubvilidesA(1)和B(2)的13CNMR與1HNMR數(shù)據(jù)aInCDCl3,500MHzfor1Hand125MHzfor13C.實施例3：本發(fā)明的四萜類化合物bissubvilidesA和bissubvilidesB的抗腫瘤實驗一、實驗方法采用常規(guī)的MTT法對本發(fā)明化合物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗。(MTT法參見如呂秋軍主編《新藥藥理學(xué)研究方法》，化學(xué)工業(yè)出版社，2007：242-243)。1.實驗用細(xì)胞株：MG63(人骨肉瘤細(xì)胞)和A549(人肺癌細(xì)胞)。實驗用細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院細(xì)胞所。2.實驗試劑、耗材和儀器：DMEM培養(yǎng)液(Invitrigen)；1640培養(yǎng)液(Invitrigen)；McCoy's5a(Invitrigen)；血清(Invitrigen)；胰酶(Invitrigen)；DMSO(sigma)；MTT(sigma)；CCK8(日本同仁)；培養(yǎng)皿(Corning)；移液管(Corning)；96孔板(Corning)；CO2孵箱(SANYO)；酶標(biāo)儀(Biotek76833)3.實驗用藥：本發(fā)明化合物bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)陽性對照藥：阿霉素(Adriamycin)。4.細(xì)胞培養(yǎng)MG63細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)，用含有10％胎牛血清的McCoy's5a培養(yǎng)液中，37℃5％CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到106左右時，1000rpm5min離心傳代，調(diào)整細(xì)胞密度至105個/ml，以每孔100μl接種于96孔板中，于18～24h后進(jìn)行實驗。A549細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌細(xì)胞(A549)用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃5％CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底70％～80％后，用0.25％的胰酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞密度至105個/ml，以每孔100μl接種于96孔板中，于18～24h后進(jìn)行實驗。5.細(xì)胞活力檢測實驗A549和MG63細(xì)胞活力檢測實驗：于實驗前24h以104個/孔的細(xì)胞濃度接種96孔板。每孔分別給藥1μl，終濃度分別達(dá)到30μg/ml，設(shè)立三個重復(fù)組、及DMSO陰性對照組和阿霉素(30μg/ml)陽性對照組。給藥后，37℃5％CO2條件下孵育24h。每孔加入10μl5mg/mlMTT(噻唑藍(lán))，37℃5％CO2條件下孵育4h。吸去培養(yǎng)板中的細(xì)胞培養(yǎng)液。每孔加入150μlDMSO溶液，于37℃下?lián)u床震蕩15min。用酶標(biāo)儀檢測570nm下的OD值。二、實驗結(jié)果通過MTT法測定化合物bissubvilidesA(1)和bissubvilidesB(2)的體外細(xì)胞毒活性，各化合物的腫瘤細(xì)胞抑制率見表2。表2化合物bissubvilidesA和B(1-2)的腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(μM)化合物MG63A549bissubvilideA(1)43.933.5bissubvilideB(2)32.728.1阿霉素2.22.9由表2可見，化合物bissubvilidesA和B(1-2)對MG63(人骨肉瘤細(xì)胞)和A549(人肺癌細(xì)胞)均有不同程度的抑制作用。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式不受上述實施例的限制。其他任何不脫離本發(fā)明之精神和原理下所作的變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。