本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及一種海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682及其在制備那西肽中的應用。

背景技術：
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近年來，動物養(yǎng)殖領域?qū)股氐臒o節(jié)制添加以及臨床領域?qū)股亻L期、反復、大劑量的濫用，加劇了各大類耐藥致病菌迅速產(chǎn)生和蔓延，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)、多耐藥結(jié)核分枝桿菌(multidrug-resistant tuberculosis,MDRMT)，以及近年來新出現(xiàn)的被稱為“超級細菌”的“產(chǎn)NDM-1耐藥細菌(新德里-金屬-β-內(nèi)酰胺酶，New Delhi metallo-β-lactamase)”。與此形成鮮明對比，新型抗菌抗生素的發(fā)現(xiàn)數(shù)量卻急劇下降，近10年來，只有達托霉素和替加環(huán)素等幾個新抗生素上市，遠遠不能滿足人類對感染性疾病防治的需要。因此，開發(fā)新型抗生素顯得尤為緊迫。

那西肽(nosiheptide)屬于硫肽類(thiopeptide)抗生素，那西肽最早由法國學者在鏈霉菌Streptomyces actuosus 40037中發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構式如式(I)所示。那西肽具有出色的抗感染活性，其對革蘭氏陽性菌有顯著的抑制作用，最小抑菌濃度(MIC)平均值為0.008μg/mL，其中對金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌的抑菌濃度為0.001μg/mL，對小球菌屬(Micrococcus)、八疊球菌屬(Sarcina)、梭菌屬(Clostridium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、雙球菌屬(Pneumococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、桿菌屬(Bacillus)細菌的MIC為0.0001～0.01μg/mL；此外，那西肽還具有抗病毒活性，對乙肝病毒HBSAg和HBEAg的50％抑菌濃度(IC₅₀)分別小于12.5μg/mL和41.6μg/mL，治療指數(shù)分別大于16和4.8，在12.5μg/mL濃度下對細胞內(nèi)HBV DNA的抑制率為26.4％。因此，那西肽有望開發(fā)成為新一代抗感染抗生素，在抗感染藥物研究開發(fā)中極具研究開發(fā)價值。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供一種能夠產(chǎn)生那西肽的海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，該菌于2016年6月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢市武漢大學，其保藏編號為：CCTCC NO：M 2016307。

本發(fā)明的第二個目的是提供海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682在制備那西肽中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供那西肽的制備方法，所述的那西肽是從海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備得到的。

優(yōu)選，所述的那西肽是從海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備得到的，具體包括以下步驟：

(a)制備海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物，將該發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵上清液和菌絲體分開，發(fā)酵上清液用丁酮萃取，丁酮相經(jīng)濃縮后得到浸膏A，菌絲體用丙酮浸泡萃取，丙酮浸提液經(jīng)濃縮后得到浸膏B；

(b)將浸膏A和浸膏B合并，采用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇作為洗脫劑，從體積比100:0、95:5進行梯度洗脫，收集氯仿-甲醇體積比為95:5洗脫的餾分Fr2；餾分Fr2經(jīng)純化后得到那西肽。

所述的制備海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物是通過以下方法制備：

將海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682接入種子培養(yǎng)基中，發(fā)酵得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液接入到發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵得到發(fā)酵培養(yǎng)物，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配方均為：大豆粉10g/L，淀粉5g/L，細菌學蛋白胨2g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCO₃ 2g/L，海鹽30g/L，余量為水。

本發(fā)明提供了一株能夠產(chǎn)生那西肽的海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，利用該菌可以制備那西肽，從而為那西肽的生產(chǎn)制備提供了生物制備方法，具有廣闊的應用前景。

本發(fā)明的海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682于2016年6月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址：中國武漢市武漢大學，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016307。

附圖說明：

圖1是海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的系統(tǒng)進化樹，其中SCSIO 1682代表海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682；

圖2是海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682發(fā)酵生產(chǎn)那西肽的HPLC圖譜。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的分離與鑒定

本發(fā)明的海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682是從我國三亞鹿回頭海域(109°48'E，18°23′N)水深45m的沉積物樣品中分離得到的。

該菌株的分類學特征是：

1、形態(tài)學特征：

菌落干燥，單菌落一般呈圓形，較小，較緊密，不易擴散，中間凸起，基內(nèi)菌絲與氣生菌絲結(jié)合緊密不易挑起，末期產(chǎn)孢子后，孢子易刮取。在ISP4培養(yǎng)基上形成淺褐色的氣生菌絲和黃色的基質(zhì)菌絲。

2、分子生物學分離特征：

提取上述分離的菌株的基因組DNA，通過常規(guī)方法PCR擴增其16S rDNA序列，并測序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，構建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹(如圖1所示)，顯示菌株SCSIO 1682與Streptomyces wuyuanensis FX61T 16S rDNA的序列相似性為99％，表明菌株SCSIO 1682屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)的一個種。

綜上所述，鑒定菌株SCSIO 1682屬于鏈霉菌屬的一個種，命名為海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682，該菌于2016年6月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址為中國武漢市武漢大學，保藏編號為：CCTCC NO：M 2016307。

實施例2：那西肽的分離鑒定

1、制備海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物：

(1)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：

a)種子培養(yǎng)基的配制：每升種子培養(yǎng)基中含有10g大豆粉，5g淀粉，2g細菌學蛋白胨，20g葡萄糖，2g酵母膏，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，2g CaCO₃，30g海鹽，余量為自來水，將上述組份混合均勻，調(diào)節(jié)pH至7.0。配制1L種子培養(yǎng)基，然后平均分裝于20個250mL錐形瓶中，每個裝有50mL種子培養(yǎng)基，121℃滅菌30min備用。

b)發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：每升發(fā)酵培養(yǎng)基中含有10g大豆粉，5g淀粉，2g細菌學蛋白胨，20g葡萄糖，2g酵母膏，0.5g K₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，2g CaCO₃，30g海鹽，余量為自來水，將上述組份混合均勻，調(diào)節(jié)pH至7.0。配制1L發(fā)酵培養(yǎng)基，然后平均分裝于5個1000mL錐形瓶中，121℃滅菌30min備用。

(2)種子的培養(yǎng)：

將活化的海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682(保藏編號為：CCTCC NO：M 2016307)接入到裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于28℃、200rpm的搖床上培養(yǎng)24h，得到種子培養(yǎng)液。

(3)規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)：

將上述錐形瓶中的50mL種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1L錐形瓶中，于28℃、200r/min的搖床上培養(yǎng)7天，獲得海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物。

2、海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682所產(chǎn)那西肽的分離

(1)發(fā)酵培養(yǎng)物的萃取

將海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物進行離心分離(3800～4000r/min，10～15min)使發(fā)酵上清液與菌絲體分開；發(fā)酵上清液使用丁酮進行等體積萃取3次，丁酮相經(jīng)旋蒸冷凝濃縮之后得到浸膏A；菌絲體使用丙酮(2L)浸泡萃取，超聲處理得到丙酮浸提液，丙酮浸提液經(jīng)旋蒸冷凝濃縮后得到浸膏B。

(2)那西肽的提取

經(jīng)HPLC分析，浸膏A和浸膏B的成分類似，將浸膏A和浸膏B合并，經(jīng)正相硅膠柱層析，用氯仿-甲醇作為流動相，從體積比100:0、95:5、92:8、90:10、8:2、7:3、1:1、0:100進行梯度洗脫，100％氯仿梯度下洗脫下來的餾分記為Fr1，氯仿-甲醇體積比為95:5梯度下洗脫下來的餾分記為Fr2，氯仿-甲醇體積比為92:8梯度下洗脫下來的餾分記為Fr3，氯仿-甲醇體積比為90:10梯度下洗脫下來的餾分記為Fr4，氯仿-甲醇體積比為8:2梯度下洗脫下來的餾分記為Fr5，氯仿-甲醇體積比為7:3梯度下洗脫下來的餾分記為Fr6，氯仿-甲醇體積比為1:1梯度下洗脫下來的餾分記為Fr7，100％甲醇梯度下洗脫下來的餾分記為Fr8。

對上述餾分Fr1-8進行高效液相分析，發(fā)現(xiàn)Fr2餾分中含有那西肽，F(xiàn)r2餾分經(jīng)反相ODS(YMC-Pack ODS-A column，250×20mm,5μm)半制備高效液相色譜分離純化(CH₃CN/H₂O體積分數(shù)60％～100％梯度洗脫30min，流速2.5mL/min)(如圖2所示)，得到30mg化合物1(保留時間15.3min)，即為那西肽。

(3)那西肽的鑒定

通過結(jié)構分析，對本發(fā)明的從海洋鏈霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 1682的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備的化合物1鑒定結(jié)果如下：

化合物1為淺黃色粉末，分子式C₅₁H₄₄N₁₃O₁₂S₆，ESIHRMS m/z 1222.1565([M+H]⁺)。¹H NMR譜中低場中顯示五個單峰烯氫質(zhì)子信號δ8.65，8.59，8.30，8.17和7.91；兩個端烯質(zhì)子信號δ6.36和5.75，對應的碳信號為δ103.6；一個烯氫質(zhì)子信號δ6.45；δ7.61，7.28和7.13為苯環(huán)上相鄰的三個質(zhì)子氫信號。高場區(qū)存在三個甲基氫信號δ0.90，1.72，2.63。其NMR數(shù)據(jù)為：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.65(Thz(1)5,s)；8.59(Thz(5)5，s)；8.30(Thz(3)5，s)；8.17(Thz(2)5，s)；7.91(Thz(4)5，s)；7.83(Pyr 4，s)；7.61(Ind 7，d)；7.28(Ind 6，dd，J＝7.16,8.32)；7.13(Ind 5，d，J＝7.15)；6.45(But 3，q，J＝6.79)；6.36(Deala 3，E(s))，5.75(Deala 3，Z(s))；5.86(Cys 2，m)；5.70(Glu2，dd)；5.57，5.42(Ind4')；4.58(Thz 2，m)；4.08(Glu 4，dd,J＝2.24，11.89)；4.00(Thr 3，m)；3.83(Cys 3，dd，J＝4.89，13.86)，3.51(Cys 3，dd，J＝5.49，13.95)；2.63(Ind CH₃，s)；2.44S(Glu 3，m)，1.90R(Glu 3，m)；1.72(But CH₃，d，J＝6.74)；0.90(Thr CH₃，d，J＝6.43)；¹³C NMR(125MHz，DMSO-d6)δ181.8，172.6，170，169，167.7，167.1，166.3，165，163.9，159，159.6，159.5，158.2，153.1，150.8，149.8，149.6，148.7，147.6，142.5，137.6，135，134.3，130.4，129.9，129.3，129.2，128.9，127.1，126.8，126，125.3，124.9，124.7，124.5，123.2，120，118.4，114.4，103.6，66.5，66.4，65.9，56.6，49.1，45.2，37.6，29.5，18.3，13.5，12.2。查閱文獻，化合物1的NMR數(shù)據(jù)與文獻[Mocek U,Chen L C,Keller P J,et al.¹H and ¹³C NMR assignments of the thlopeptide antibiotic nosiheptide[J].J Antibiot,1986,42(11):1643-1648.]報道的那西肽NMR數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物1為那西肽，其結(jié)構如式(I)所示。