本發(fā)明涉及用于連作花生土傳真菌性病害的菌株及其菌劑制備方法等，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
，專用于克服連作花生土傳真菌病害高發(fā)問題。
背景技術(shù)：
：花生是我國的重要油料作物，常年播種面積占油料作物總播種面積的35％左右。南方紅壤丘陵區(qū)是我國的花生主產(chǎn)區(qū)之一，相對與華北主產(chǎn)區(qū)相比，南方紅壤區(qū)花生產(chǎn)量較低(平均產(chǎn)量僅為華北產(chǎn)區(qū)的60％左右)，這既與花生品種、氣候條件、土壤肥力等有關(guān)，也與南方紅壤區(qū)花生連作障礙嚴(yán)重有一定關(guān)系。由于紅壤旱坡地肥力較低，季節(jié)性干旱嚴(yán)重，花生連作現(xiàn)象普遍?；ㄉB作重茬往往導(dǎo)致土傳真菌性病害加劇，隨連作年限增加，花生根腐病發(fā)病率成倍上升，立枯病和白絹病持續(xù)增多。因此，有效防治連作地花生土傳真菌性病害成為花生可持續(xù)生產(chǎn)緊迫的現(xiàn)實需求。目前常用的治理方法有施用化學(xué)殺菌劑和施用含有生防菌的生物有機肥?；瘜W(xué)菌劑或高效熏蒸劑可以有效殺滅土壤病原菌基數(shù)，暫時減輕病害發(fā)生，但同時也抑制了土壤有益菌，從長遠(yuǎn)角度來看，化學(xué)滅菌將會進一步惡化土壤生態(tài)功能，不利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。生防菌的篩選是生物有機肥制備的關(guān)鍵，目前生防菌劑的篩選主要從促生、代謝產(chǎn)物抑菌性的角度開展，并且通常采用與有機肥進行混合發(fā)酵后使用。但鑒于生防菌是一種活體生物，不經(jīng)過強化誘導(dǎo)很難直接在有機肥持續(xù)存活等，導(dǎo)致田間防治效果不穩(wěn)定。此外，目前已有的生物防治有機肥一般用量較大(>200公斤/畝)、應(yīng)用成本較高。一般情況下，連作地土傳病原真菌豐度相對較高(>30％)，這些病原真菌的細(xì)胞壁是由有幾丁質(zhì)構(gòu)成。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于防治由病原真菌引起的花生土傳病害的生防菌劑有效制備方法及其應(yīng)用，從而有效降低連作花生根際病原真菌基數(shù)，達到抑制土傳病原菌侵染花生根部的目的，本發(fā)明方法?；詮?，效果穩(wěn)定。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種假單胞菌(Pseudomonasprotegens)WXX-1，保藏編號為CGMCCNo.11539。所述菌株為革蘭氏染色陰性細(xì)菌，菌株的16srDNA堿基序列如SEQIDNo：1所示。本發(fā)明還公開了所述的菌株在防治土傳真菌性病害中的應(yīng)用。特別是在防治紅壤連作花生土傳真菌性病害中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了菌株在制備防治土傳真菌性病害菌劑中的應(yīng)用。一種防治土傳真菌性病害的菌劑，該菌劑由假單胞菌WXX-1制得。進一步地，該菌劑中假單胞菌WXX-1經(jīng)真菌菌絲體誘導(dǎo)強化，有效存活于腐熟的有機糞肥中，WXX-1的含量為1×109cfu/g以上。菌劑田間適用性強，可直接應(yīng)用于防治南方紅壤連作花生土傳真菌性病害。本發(fā)明提供假單胞菌WXX1菌劑制備技術(shù)為：1)滅活腐生真菌菌絲誘導(dǎo)體獲得：配置PD培養(yǎng)液(馬鈴薯20％(g/ml)，葡萄糖1.5％(g/ml)，蒸餾水1000ml)，并滅菌處理；然后接種被孢霉(Mortierellasp.)，置于恒溫?fù)u床黑暗培養(yǎng)(28℃、120rpm)，7d后，濾紙過濾獲得菌絲，蒸餾水洗滌2次，抽濾后高溫滅菌(121℃，20min)備用。2)配置抑菌性強化培養(yǎng)基：牛肉膏3％(g/ml)，蛋白胨8％(g/ml)，滅活腐生真菌菌絲體3％(g/ml)；3)菌株穩(wěn)定性強化：將所述菌株加入上述培養(yǎng)基中，發(fā)酵通氣量10L/m，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值5.5-6.5，發(fā)酵溫度為26℃，發(fā)酵時間72h，測得菌液OD值為1.0左右；4)所述菌劑制備：以腐熟的豬糞堆肥為基質(zhì)，將上述WXX1抑菌性強化發(fā)酵液按5％比例接種到上述基質(zhì)，放置恒溫箱(28℃)培養(yǎng)5d；經(jīng)過第二步對所述菌株對真菌菌絲寄生的強化，所述菌劑可高效定殖于含有大量腐生真菌的有機基質(zhì)中，所述菌量達到1×109cfu/g。最后獲得WXX1抑菌性能強化的固體混合菌劑。本發(fā)明所述菌劑的施用方法，是按1:2比例(重量比)將花生種子與菌劑混拌，菌劑用量20-30公斤/畝；田塊開溝后，將與菌劑拌勻后的花生種子一起播于預(yù)先開好的播種溝中，然后覆土。這樣一方面所述菌株可有效定殖于花生根際，另一方面可有效在花生根圈附近形成防護墻，達到抑制土傳病原菌侵染花生根部的目的。本發(fā)明可有效防治連作地花生根腐病、立枯病、莖基腐病、白絹病，防效達55％以上，具有田間防治效果穩(wěn)定、抑菌譜廣。本發(fā)明的優(yōu)點是：菌株WXX1產(chǎn)幾丁質(zhì)酶(降解病原菌菌絲細(xì)胞壁)活性較高，對鐮刀菌、絲核菌、輪枝菌等多種土傳真菌性病原菌菌絲體均有顯著降解能力，經(jīng)過強化誘導(dǎo)可以有效在有機肥中腐生類微生物上寄生生存；接種到腐熟有機糞肥中制備成固體菌劑；是用于防治連作花生土傳真菌性病害的生防細(xì)菌，菌劑用量少、成本低、增產(chǎn)效果顯著。土傳真菌病害是農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)中出現(xiàn)的主要病害，可引起作物枯萎死亡，減產(chǎn)嚴(yán)重。如果把按上述方法制備的菌劑施入連作花生根際，就可在花生生長期內(nèi)穩(wěn)定生存，從而有效形成抑制病原菌侵染的防護墻，并有效降低花生根圍病原菌基數(shù)，最終以微生物之間的“競爭”達到有效防治連作花生土傳真菌病害的目的。附圖說明圖1為假單胞菌WXX1在培養(yǎng)基(含2％的幾丁質(zhì))上的生長及透明圈。圖2為假單胞菌WXX1對尖孢鐮刀菌的實驗效果圖。注：圖中1為尖孢鐮刀菌，2為假單胞菌WXX1圖3為假單胞菌WXX1對茄腐鐮刀菌的實驗效果圖。注：圖中1為茄腐鐮刀菌，2為假單胞菌WXX1圖4為假單胞菌WXX1對立枯絲核菌的實驗效果圖。注：圖中1為立枯絲核菌，2為假單胞菌WXX1圖5為假單胞菌WXX1對輪枝菌的實驗效果圖。注：圖中1為輪枝菌，2為假單胞菌WXX1圖6為假單胞菌WXX1對病原菌真菌菌絲破壞的電鏡圖。圖7為假單胞菌WXX1菌劑田間應(yīng)用效果圖。本發(fā)明中的菌株WXX-1，所述菌株的分類命名為：假單胞菌(Pseudomonasprotegens)，保藏編號為CGMCCNo.11539，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2015年10月26日。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例1：采集紅壤地區(qū)一塊連作花生地的花生根際土壤進行相關(guān)的試驗，其具體步驟為：(1)土樣處理：準(zhǔn)備滅菌的富集培養(yǎng)基(成份：細(xì)粉幾丁質(zhì)2.5g，MgSO4·7H2O0.5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，蒸餾水1000ml)，分裝20ml于無菌三角瓶中，并取1.0g新鮮土樣加入三角瓶中，混勻，室溫下150r/min培養(yǎng)48h，得到富集的培養(yǎng)液。(2)涂布分離：吸取1mL濾液加入9.0mL無菌水，連續(xù)稀釋3次獲得稀釋度為10-4的樣品液，進行梯度稀釋，土壤稀釋液0.02mL涂布于平板分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4-7d，觀察、挑取產(chǎn)透明圈的細(xì)菌菌株。(3)培養(yǎng)與純化：挑取單個菌落在平板分離培養(yǎng)基上畫線純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后得到的菌株作為供試菌株，接種到牛肉膏蛋白胨斜面暫時保藏。(4)活性篩選：采用搖瓶復(fù)篩方法進行活性篩選，將分離的菌株接入培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分：細(xì)粉幾丁質(zhì)10g，蛋白胨5g，酵母膏5g，K2HPO40.7g，KH2PO40.3g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g，ZnSO40.01g，蒸餾水1000ml)，28℃、150r/min振蕩培養(yǎng)3-4d，發(fā)酵液離心得到粗酶液，測定酶活力，然后選取產(chǎn)酶活力高的菌株進行復(fù)篩(圖1)。復(fù)篩方法同上，測定酶活力，進一步選取產(chǎn)酶活力高的菌株。(5)活性檢驗：用分離純化的高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌，以供試病原菌為標(biāo)靶，采用平板對峙培養(yǎng)法直接測定菌株對病原真菌的抑制率。方法是首先將待篩選菌株活化，在PDA平板中心先接種病原真菌，用直徑5mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打孔制成菌餅，并接到PDA平板中央，然后在培養(yǎng)皿四周距病原菌2.5cm左右接種待測的細(xì)菌菌株，每株細(xì)菌三個重復(fù)，28℃培養(yǎng)一周，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，用十字交叉法測定病原真菌菌落直徑，計算抑制率。(6)分類地位的確定：提取供試菌株的DNA，進行16SrRNA測序確定菌株的分類地位。(7)通過以上實驗篩選出抗菌效果最好的一株菌株(WXX1)，并擴大培養(yǎng)，提取其DNA，通過16SrNA克隆測序確定了分類地位，該菌株隸屬于變形菌門-γ變形菌綱-假單胞菌目-假單胞菌科-假單胞菌屬。并于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏時間為2015年10月26日，保藏編號為CGMCCNo.11539。保藏號為：CGMCCNO.11539的菌株的生物學(xué)特征為：該菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，需氧型，桿狀，微黃，細(xì)菌的大小范圍：1.5-3μm；該菌最適合生長溫度為28-30℃，pH為5-7。實施例2：對各種土傳真菌型病原菌的抑菌實驗利用保藏編號為CGMCCNO.11539的菌株進行抗菌實驗：首先將所述菌株活化，在PDA平板中心先接種病原真菌，用直徑5mm的打孔器在病原菌菌落邊緣打孔制成菌餅，并接到PDA平板中央，然后在培養(yǎng)皿四周距病原菌2.5cm左右接種待測的細(xì)菌菌株，每株細(xì)菌三個重復(fù)，28℃培養(yǎng)一周，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，用十字交叉法測定病原真菌菌落直徑，計算抑制率。所選病原菌為：立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.diath)、黑白輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)，如圖2—圖5，發(fā)現(xiàn)所述菌株對上述土傳病原真菌均具有很好的抑菌作用(表1)。然后通過掃描電鏡對真菌菌絲進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲細(xì)胞原生質(zhì)收縮，出現(xiàn)空泡；菌絲畸形膨大成球狀；菌絲細(xì)胞壁破損、消解，原生質(zhì)外溢(圖6)。表1菌株離體抑菌率的測定實施例3：溫室活體防治實驗在PDA培養(yǎng)基中活化花生根腐病原菌(茄腐鐮刀菌)28℃下培養(yǎng)7d，用無菌水分別沖洗培養(yǎng)基上病原菌孢子，菌液用已滅菌的濾紙過濾以除去菌絲，病原菌將濾液加適當(dāng)蒸餾水稀釋成孢子濃度為1×107個/mL的懸浮液，備用。將供試生防菌株加入不含真菌菌絲誘導(dǎo)體培養(yǎng)液(牛肉膏3％，蛋白胨8％)進行液體發(fā)酵(26℃、72h、200rpm)，然后再以按5％比例接種腐熟的豬糞堆肥基質(zhì)，放置恒溫箱(28℃)培養(yǎng)5d，作為菌劑A備用。同時按上述同樣方法，只是在液體培養(yǎng)基中添加滅活真菌菌絲誘導(dǎo)體(3％)進行抑菌強化液體發(fā)酵，制備的菌劑B備用。采集的紅壤旱地農(nóng)田土壤，粉碎過篩后，與121℃，濕熱滅菌3h，以制備無菌土。按5％比例添加病原菌孢子液與無菌土拌勻，裝盆。然后按1:2比例將花生種子和菌劑A/B進行混勻，待用。實驗共設(shè)4個處理：CK1，滅菌土壤，不含病原菌和菌劑；CK2，添加病原菌，獲得帶菌土壤；A，含有病原菌土壤+菌劑A；B，含有病原菌土壤+菌劑B。每處理10盆，栽種后定時澆水觀察發(fā)病情況。30d后調(diào)查花生根部發(fā)病程度。花生根腐病病害分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無可見癥狀；1級，黑腐面積占整個主根面積的5％以下；2級，黑腐面積占整個主根面積5％～25％；3級，黑腐面積占整個主根面積的25％～50％；4級，黑腐面積占整個主根面積的50％～75％；5級，黑腐面積占整個主根面積的75％以上。表2菌株WXX1不同菌劑類型處理對土傳病害的防治效果處理類型病情指數(shù)防治效果(與CK2相比)CK10/CK263.50A34.445.8％B21.266.7％不同菌劑對花生生長都具有很好的促進作用，株高及根系發(fā)達程度均顯著高于對照組。防效測定結(jié)果表明，制備的2種菌劑針對花生根腐病的活體防效分別為45.8％、66.7％，其中菌劑B對土傳病菌的防效最好，顯著降低了腐爛褐變，防效非常顯著。實施例4：田間連作花生地實驗將保藏編號為CGMCCNO.11539的菌株轉(zhuǎn)為連作花生田間試驗，連續(xù)3年在田間自然栽培條件下驗證該菌株制備的菌劑對連作花生土傳真菌性病害的抑制效果，具體如下：(1)供試土壤基本情況：試驗安排于江西余江縣紅壤旱地花生種植區(qū)的連作障礙土壤，試驗區(qū)常年根腐發(fā)病率在40％－70％，并隨連作年限延長發(fā)病率不斷攀升，有的片區(qū)土壤已不能耕種，發(fā)病率高達80％以上。2012年試驗選用了區(qū)域已連作5年的紅壤花生田塊進行效果驗證，2013年選用了已連作7年的花生田塊進行效果驗證，2014年選用了已連作4年的花生田塊進行效果驗證，每年分別設(shè)置4組對比試驗，除試驗處理差異外，保持試驗區(qū)土壤條件及栽培管理技術(shù)統(tǒng)一。(2)試驗處理與方法：試驗共設(shè)12個小區(qū)，每個小區(qū)長10m，寬5m小區(qū)之間設(shè)1m溝距，隨機區(qū)組排列花生株距為18-20cm，行距為45-50cm，每穴播2粒種子。設(shè)4組實驗，分別：CK:常規(guī)NPK施肥，在播種前基施尿素150kghm-2、氯化鉀225kghm-2、鈣鎂磷1125kghm-2；A:用不含菌絲誘導(dǎo)體制備的菌劑A與花生種子拌勻(2:1)，常規(guī)NPK施肥量同CK處理；B：用含菌絲誘導(dǎo)體制備的菌劑B與花生種子拌勻(2:1)，常規(guī)NPK施肥量同CK處理；C：50％多菌靈可濕性粉劑800倍，常規(guī)NPK施肥量同CK處理。每個處理設(shè)3次重復(fù)。(3)試驗結(jié)果：連續(xù)3年對不同連作花生田塊的防效試驗結(jié)果表明(表3)：WXX1生防菌劑對連作花生地中的土傳真菌病害均具有較好的防治效果(圖7)，其中本發(fā)明制備菌劑B的防效最高，對花生立枯病、根腐病和白絹病的防效分別為53.0～60.7％、53.2～58.8％、65.0～66.7％，其效果與50％多菌靈可濕性粉劑防效相當(dāng)，但增產(chǎn)效果更為顯著。因此，本發(fā)明以保藏編號為CGMCCNO.11539的菌株制備的菌劑對抑制紅壤連作花生土傳真菌性病害的發(fā)生及蔓延具有較好的作用功效，且防治效果穩(wěn)定，是南方紅壤區(qū)花生連作障礙的生物修復(fù)產(chǎn)品。表3WXX1生防菌不同菌劑防治連作土壤花生土傳真菌病害的田間防效分析(2012年)表4WXX1生防菌不同菌劑防治連作土壤花生土傳真菌病害的田間防效分析(2013年)表5WXX1生防菌不同菌劑防治連作土壤花生土傳真菌病害的田間防效分析(2014年)當(dāng)前第1頁1 2 3