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水稻典敗型和染敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的PCR鑒別方法與流程

文檔序號(hào):11838345閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.鑒別水稻典敗型和染敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的特異引物,其特征在于:所述特異引物由引物atp6-orf79、orWA352和LD29組成;所述引物atp6-orf79由上游引物atp6-orf79F和下游引物atp6-orf79R組成,上游引物atp6-orf79F的堿基序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物atp6-orf79R的堿基序列如SEQ ID NO:2所示,目標(biāo)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1592bp;所述引物orWA352由上游引物orWA352F和下游引物orWA352R組成,上游引物orWA352F的堿基序列如SEQ ID NO:3所示,下游引物orWA352R的堿基序列如SEQ ID NO:4所示,目標(biāo)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1432bp;所述引物L(fēng)D29由上游引物L(fēng)D29F和下游引物L(fēng)D29R組成,上游引物L(fēng)D29F的堿基序列如SEQ ID NO:5所示,下游引物L(fēng)D29R的堿基序列如SEQ ID NO:6所示,目標(biāo)產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為905bp或2555bp。

2.一種水稻典敗型和染敗型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的PCR鑒別方法,特征在于包括以下步驟:

(1)從水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系材料提取總DNA樣品,每個(gè)DNA樣品分成三份,第一份用權(quán)利要求1中所述的引物atp6-orf79進(jìn)行PCR反應(yīng),第二份用權(quán)利要求1中所述的引物orWA352進(jìn)行PCR反應(yīng),第三份用權(quán)利要求1中所述的引物L(fēng)D29進(jìn)行PCR反應(yīng);

(2)PCR反應(yīng):

A.引物atp6-orf79對(duì)每個(gè)DNA樣品的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL,其中Taq PCR Master Mix 12.5μL,20pmol/L上游引物atp6-orf79F 0.25μL,20pmol/L下游引物atp6-orf79R 0.25μL,模板DNA 1μL,無(wú)菌雙蒸水11μL,完成PCR反應(yīng)后,放入EppendorfPCR儀中,設(shè)置引物atp6-orf79的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min,循環(huán)內(nèi)94℃變性30s,55℃退火30s,72℃復(fù)性2min,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min;

B.引物orWA352對(duì)每個(gè)DNA樣品的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL,其中Taq PCR Master Mix 12.5μL,20pmol/L上游引物orWA352F 0.25μL,20pmol/L下游引物orWA352R 0.25μL,模板DNA 1μL,無(wú)菌雙蒸水11μL,完成PCR反應(yīng)后,放入EppendorfPCR儀中,設(shè)置引物orWA352PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min,循環(huán)內(nèi)94℃變性30s,55℃退火30s,72℃復(fù)性1min30s,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min;

C.引物L(fēng)D29對(duì)每個(gè)DNA樣品PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25μL,其中Taq PCR Master Mix 12.5μL,20pmol/L上游引物L(fēng)D29F 0.25μL,20pmol/L下游引物L(fēng)D29R 0.25μL,模板DNA 1μL,無(wú)菌雙蒸水11μL,完成PCR反應(yīng)后,放入EppendorfPCR儀中,設(shè)置引物L(fēng)D29的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min,循環(huán)內(nèi)94℃變性30s,55℃退火30s,72℃復(fù)性3min,20個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min;

(3)待上述3個(gè)PCR擴(kuò)增完成后,同時(shí)各取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物,分別采用2%的瓊脂糖凝膠分離,溴化乙錠染色,在電壓120V下電泳30分鐘,凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照,電泳分離PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物,如果引物orWA352和引物L(fēng)D29的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1432bp和2555bp的單一條帶,且引物atp6-orf79無(wú)擴(kuò)增條帶,則確定所檢材料為典敗型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系;如果引物atp6-orf79和LD29的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別為1592bp和905bp的單一條帶,且引物orWA352為無(wú)擴(kuò)增條帶,則確定所檢材料為染敗型水稻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。

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