本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速均一化或等比例DNA樣本的方法，適用于PCR、熒光定量PCR、測(cè)序、高通量測(cè)序儀等核酸檢測(cè)。

背景技術(shù)：

基于DNA的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于臨床、科研、進(jìn)出口檢疫、食品安全、疾病控制等領(lǐng)域。在多種應(yīng)用場(chǎng)景中，需要控制不同檢測(cè)樣本的起始樣本量，以使不同樣本檢測(cè)處于同一水平或產(chǎn)生同樣的數(shù)據(jù)，比如高通量測(cè)序。常規(guī)的均一化方法，通過(guò)吸光度值高低計(jì)算含有DNA量的高低，從而來(lái)吸取等量或等比例的樣本，實(shí)現(xiàn)均一化的目的；也可以通過(guò)熒光定量PCR結(jié)果計(jì)算樣本含有的模板數(shù)，再通過(guò)吸取等量或等比例的樣本達(dá)到均一化的目的。然而通過(guò)吸光值的方法，會(huì)受其他同樣吸收特定光譜如蛋白、各種類型核酸或各種雜質(zhì)的影響；熒光定量PCR方法可以精準(zhǔn)定量分子模板，但是費(fèi)力費(fèi)時(shí)費(fèi)錢，還需要購(gòu)置昂貴的熒光定量PCR儀器。

現(xiàn)有的均一化過(guò)程可以定義成定量-計(jì)算-吸取三個(gè)步驟。定量96個(gè)樣本的操作時(shí)間由于各種儀器平臺(tái)的不同，由幾分鐘到3個(gè)小時(shí)不等；計(jì)算環(huán)節(jié)，需要找到最低濃度的樣本，以該樣本為基準(zhǔn)線計(jì)算具體的吸取樣本量，需要耗時(shí)約1個(gè)小時(shí)；調(diào)整移液器，從每個(gè)樣本中獨(dú)立吸取相應(yīng)計(jì)算量的樣本，實(shí)現(xiàn)樣本之間均一化，隨后可以混合多個(gè)樣本，也可以按照實(shí)際設(shè)計(jì)需要操作，此過(guò)程需要1個(gè)小時(shí)。因此按照現(xiàn)有的技術(shù)流程，整個(gè)均一化的過(guò)程需要5個(gè)小時(shí)時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述缺陷，本發(fā)明提供了一種快速均一化或等比例DNA樣本的方法

一種快速均一化或等比例DNA樣本的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)在不同的待檢DNA樣本中引入含有生物素標(biāo)記的核苷酸；

2)將步驟1所得標(biāo)記生物素的DNA樣本與包被有等量或等比例量鏈霉親和素的材料結(jié)合；

3)清洗去除未能和鏈霉親和素材料結(jié)合的DNA樣本；

4)把與鏈霉親和素結(jié)合的DNA洗脫下來(lái)。

DNA樣本引入生物素標(biāo)記的脫氧核苷酸，通過(guò)和等量的鏈霉親和素包被的材料結(jié)合，過(guò)量的DNA被清洗掉，等量的DNA被從鏈霉親和素材料上最終洗脫下來(lái)，用于后續(xù)的檢測(cè)。

進(jìn)一步地，步驟1在DNA樣本中引入含有生物素標(biāo)記的核苷酸的方法為：在DNA樣本處理過(guò)程中或在DNA樣本PCR環(huán)節(jié)加入含有生物素標(biāo)記的一種或多種核苷酸，或?qū)NA樣本與標(biāo)記有生物素的通用DNA接頭連接。

步驟2包被有等量或等比例的鏈霉親和素的材料磁性顆粒、玻璃界面、移液器吸頭、二氧化硅材料、微流體芯片或封閉管道。

步驟3用PBS、dH₂O或70％乙醇清洗去除未能和鏈霉親和素材料結(jié)合的DNA樣本。

步驟4洗脫下來(lái)的DNA適用于后續(xù)的PCR、熒光定量PCR、一代測(cè)序或高通量測(cè)序。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速均一化或等比例DNA樣本的試劑盒，幫助DNA樣本實(shí)現(xiàn)快速均一化、等比例DNA樣本的目的。所述試劑盒包括：生物素標(biāo)記的脫氧核苷酸或生物素標(biāo)記的DNA接頭、鏈霉親和素材料、Tris結(jié)合液、Tris清洗液、堿性洗脫液和中和液。

本發(fā)明創(chuàng)新性地在DNA樣本處理過(guò)程中引入生物素標(biāo)記的脫氧核苷酸，比如高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的過(guò)程。處理完成后，待檢樣本中已經(jīng)帶有生物素標(biāo)記的核苷酸，隨后可以使用等量或等比例鏈霉親和素包被的材料進(jìn)行結(jié)合。鏈霉親和素結(jié)合生物素的能力有限，每個(gè)鏈霉親和素分子可以結(jié)合4個(gè)分子的生物素，但結(jié)合力極強(qiáng)。這樣等量或等比例的鏈霉親和素包被的材料就能吸附等量或等比例的DNA樣本，剩余的不能結(jié)合的DNA被洗脫掉，從而達(dá)到快速實(shí)現(xiàn)樣本之間均一化的目的，整個(gè)方法只有結(jié)合、清洗、洗脫步驟，96個(gè)樣本的均一化可以在30分鐘內(nèi)完成。

因此本發(fā)明，針對(duì)需要做均一化或等比例化的DNA樣本檢測(cè)，通過(guò)引入生物素標(biāo)記的脫氧核苷酸，利用鏈霉親和素和生物素的結(jié)合能力，迅速實(shí)現(xiàn)樣本之間的均一化，大大加快了檢測(cè)流程，特別適用于高通量測(cè)序、PCR、熒光定量PCR、一代測(cè)序。

本發(fā)明具有以下技術(shù)特點(diǎn)：

1)快速：本發(fā)明可以在30分鐘內(nèi)，完成96個(gè)樣本的均一化、等比例，手工操作時(shí)間少于5分鐘。而常規(guī)的均一化、等比例過(guò)程，需要定量、計(jì)算、混合三個(gè)步驟，每一步都有多步試驗(yàn)操作，處理96個(gè)樣本總耗時(shí)約5個(gè)小時(shí)，同時(shí)耗費(fèi)大量的人工。

2)廉價(jià)：本發(fā)明不需要昂貴的設(shè)備，只需要用于鏈霉親和素材料分離的介質(zhì)，如果采用鏈霉親和素磁珠，只需要磁力架即可。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的試劑，相對(duì)于熒光定量PCR試劑，也具有極高的性價(jià)比。

附圖說(shuō)明

圖1所示是在DNA樣本PCR環(huán)節(jié)引入生物素標(biāo)記的流程圖。

圖2所示是將DNA樣本與標(biāo)記有生物素的通用DNA接頭連接而引入生物素標(biāo)記的流程圖。

圖3是標(biāo)記了生物素的DNA和鏈霉親和素磁珠結(jié)合、清洗掉過(guò)量的DNA，從而實(shí)現(xiàn)均一化或等比例化的流程圖。

具體實(shí)施方式

以下具體實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明提供的方法與技術(shù)方案的進(jìn)一步說(shuō)明，但不應(yīng)理解成對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法能快速均一化高通量測(cè)序文庫(kù)。

1. 1ml孕婦血漿，經(jīng)由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血漿游離DNA

2.加入2單位/ul末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃20分鐘，然后無(wú)需純化，直接升溫75℃變性末端補(bǔ)平酶。

3.直接在試管中加入DNA連接試劑：100單位/ul的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成，此接頭含有生物素標(biāo)記。反應(yīng)條件是25℃20分鐘，純化DNA，完成文庫(kù)構(gòu)建。

4.每個(gè)文庫(kù)20ul加入等量的、不足量的鏈霉親和素磁珠5ul(ThermoFisher)，室溫混合5分鐘。

5.用磁力架分離磁珠，去除上清，用PBS沖洗磁珠兩次，用磁力架分離，并棄上清。

6. 3N NaOH 40ul加入磁珠混勻5分鐘，用磁力架分離，取上清。

7.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即為均一化的文庫(kù)。

8.文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法能快速等比例高通量測(cè)序文庫(kù)。

1. 1ml孕婦血漿，經(jīng)由QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提血漿游離DNA

2.加入2單位/ul末端補(bǔ)平酶(T4DNA聚合酶或和Klenowexo-)、490uM的dNTPs，55mM的Tris緩沖液組成，反應(yīng)條件是37℃20分鐘，然后無(wú)需純化，直接升溫75℃變性末端補(bǔ)平酶。

3.直接在試管中加入DNA連接試劑：100單位/ul的DNA連接酶，3.5mM的ATP，55mM的Tris緩沖液，30mM的二硫蘇糖醇及DNA接頭組成，此接頭含有生物素標(biāo)記。反應(yīng)條件是25℃20分鐘，純化DNA，完成文庫(kù)構(gòu)建。

4.每個(gè)文庫(kù)20ul加入等比例的、不足量的鏈霉親和素磁珠(ThermoFisher)，室溫混合5分鐘。比如樣本A加入5ul，樣本B加入10ul，最終樣本濃度樣本B就比A高一倍。

5.用磁力架分離磁珠，去除上清，用PBS沖洗磁珠兩次，用磁力架分離，并棄上清。

6. 3N NaOH 40ul加入磁珠混勻5分鐘，用磁力架分離，取上清

7.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即為等比例的文庫(kù)。

8.文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的快速均一化。

1.PCR過(guò)程中加入含有一種或多種生物素標(biāo)記的dNTP。

2.每個(gè)PCR產(chǎn)物20ul加入等量的、不足量的鏈霉親和素磁珠5ul(ThermoFisher)，室溫混合5分鐘。

3.用磁力架分離磁珠，去除上清，用PBS沖洗磁珠兩次，用磁力架分離，并棄上清。

4. 3N NaOH 40ul加入磁珠混勻5分鐘，用磁力架分離，取上清。

5.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即為均一化的文庫(kù)。

6.文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用于說(shuō)明本方法實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的快速等比例。

1.PCR過(guò)程中加入含有一種或多種生物素標(biāo)記的dNTP。

2.每個(gè)文庫(kù)20ul加入等比例的、不足量的鏈霉親和素磁珠(ThermoFisher)，室溫混合5分鐘。比如樣本A加入5ul，樣本B加入10ul，最終樣本濃度樣本B就比A高一倍。

3.用磁力架分離磁珠，去除上清，用PBS沖洗磁珠兩次，用磁力架分離，并棄上清。

4. 3N NaOH 40ul加入磁珠混勻5分鐘，用磁力架分離，取上清。

5.上清中加入40ul 0.1N醋酸中和上清，即為等比例的文庫(kù)。

文庫(kù)可用于illuminaHiSeq、NextSeq、MiSeq、MiniSeq測(cè)序儀檢測(cè)。