本發(fā)明屬皮革檢測領域，確切地說是一種實時熒光PCR檢測用引物、探針以及利用該引物探針鑒定天然鱷魚皮革的方法。

背景技術：

皮革是經(jīng)脫毛和鞣制等物理、化學加工所得到的已經(jīng)變性不易腐爛的動物皮。皮革的價格相對較高，影響其價格的因素除了加工工藝外，主要在于所采用的皮革或毛皮的種類。其中，鱷魚皮堪稱皮革中的鉑金，以奢華稀有著稱。這不僅是因為鱷魚數(shù)量稀少，更是由于鱷魚生長的速度慢而且養(yǎng)殖成本極高，而可使用的鱷魚皮僅限于鱷魚腹部的狹長部分。鱷魚皮具有天然漸變的方格紋路且結(jié)實耐用，只要保養(yǎng)得當會越用越光澤，越用越柔韌，所以鱷魚皮的價格在皮革交易中久居不下。鱷魚皮與鉆石同理，大小、色澤、產(chǎn)地的不同決定了它們懸殊的價值。其中，最優(yōu)等級的鱷魚皮來自于灣鱷(Crocodylus porosus)，其次以暹羅鱷(Crocodylus siamensis)和尼羅鱷(Crocodylus niloticus)為佳，此外還有美洲鱷(Crocodylus acutus)、古巴鱷(Crocodylus rhombifer)和奧瑞納克鱷(Crocodylus intermedius)等不同鱷魚皮革來源。

近年來，諸多產(chǎn)品標準都對皮革材質(zhì)標識提出了明確的要求，例如QB/T 1333-2010《背提包》要求面層材料90％以上使用頭層皮革，才可以標識“真皮”，而頭層皮革如果采用移膜工藝，也不能標識“真皮”；使用多種成分復合制成的材料，其中皮革基體厚度不大于總厚度的60％，也不能標注“皮革”。QB/T 1002-2005《皮鞋》產(chǎn)品標準中針對材質(zhì)名稱提到“應注明主要鞋幫材料，如：牛皮、豬皮、羊皮、二層革、合成(人造)革、織物或革與非革混合幫面等”。因此，皮革的材質(zhì)鑒定日趨成為皮革測試中需求量較大的測試項目。

國際上現(xiàn)行的皮革鑒定方法是顯微鏡法，采用的標準是ISO 17131：2012。但該方法中只提供了包括牛、羊、豬、山羊等皮革的標本切面鏡像圖。除顯微鏡法外，目前行業(yè)內(nèi)采用較多是感官鑒定法，該方法主要依賴鑒定人員對動物毛皮的認知和經(jīng)驗，檢測結(jié)果的主觀性較大，尚未出臺具體的參考標準。

除顯微鏡法和感官鑒定法外，行業(yè)內(nèi)也在開發(fā)紅外光譜法和DNA鑒定法。紅外光譜法是利用皮革中氨基酸種類和組成比例的不同，用連續(xù)波長的紅外光照射皮革樣品表面，引起分子振動和能級之間的躍遷，在紅外吸收光譜圖中獲得不同的圖譜，但目前僅見有常見的豬、牛、羊、馬等皮革的檢測方法。另外，皮革在加工中會添加較多的化學試劑，且皮革表面的涂飾面對紅外光譜產(chǎn)生較大干擾，所以該方法在成品皮質(zhì)鑒定中仍處于探索階段。

DNA鑒定法是通過提取皮革制品中動物源的DNA，針對物種的特異基因序列設計引物，通過特異基因的PCR擴增，獲得目標物種的基因序列，根據(jù)擴增產(chǎn)物用實時熒光PCR方法或測序比對等分子生物技術判定皮革動物源性成分，但是目前并沒有使用DNA鑒定法對天然鱷魚皮革進行鑒定的報道。因為組織成分和加工工藝等原因，再生革、人造革和合成革等非天然皮革中不再含有DNA成分，根據(jù)這一點，本發(fā)明提供了一種方法，通過提取皮革制品中的DNA，針對鱷魚物種的特異基因序列設計引物，經(jīng)過實時熒光PCR法來對鱷魚物種的特異基因進行擴增并進行分析，最終對鑒定待測皮革是否為天然鱷魚皮革。本方法較顯微鏡法、感官鑒定法和紅外光譜法具有準確性高、特異性強的檢測周期短等特點，可用于快速鑒定皮革是否為天然鱷魚皮革。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術所存在的上述技術問題，提供了一種實時熒光PCR法鑒定天然鱷魚皮革的引物探針及方法。

根據(jù)灣鱷(Crocodylus porosus)、暹羅鱷(Crocodylus siamensis)、尼羅鱷(Crocodylus niloticus)、美洲鱷(Crocodylus acutus)、古巴鱷(Crocodylus rhombifer)、奧瑞納克鱷(Crocodylus intermedius)等不同品種鱷魚的同源特異性序列，設計出鱷魚特異基因檢測引物以及相應檢測探針，分別為：

上游引物P1：GGATGAACAGTCTAYCCA

下游引物P2：GCCGTGGTAATAAARTTAA

帶有熒光染料的探針序列為：CCACGCCGGACCATCAGTAG

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

通過實時熒光PCR中檢測18SrRNA基因?qū)ζじ镏刑崛〉腄NA質(zhì)量進行評估，用于實時熒光PCR檢測18SrRNA基因的引物探針，分別為：

上游引物P1：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA

下游引物P2：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

帶有熒光染料的探針序列為：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR法鑒定天然鱷魚皮革的方法，其步驟如下：

1、提取待檢皮革的DNA；

2、將用于檢測18SrRNA和鱷魚特異基因的上游引物、下游引物和探針分別稀釋至10μmol/L，以所提取的DNA作為模板，加入上述引物對和熒光染料標記的探針以及PCR預混液進行實時熒光PCR反應，記錄樣品反應的Ct值。上述實時熒光PCR反應體系為：

3、上述實時熒光PCR反應條件為95℃10min，1個循環(huán)；95℃，15s，58℃30s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的58℃/30s時收集熒光，設立FAM通道。

4、上述實時熒光PCR方法設有空白對照、陰性對照、陽性對照，用于判定樣品是否為天然皮革的標準為：

空白對照：以ddH₂O為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陰性對照：以非天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因Ct值小于36、鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陽性對照：以天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均小于36；

待測皮革18SrRNA基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定；待測皮革18SrRNA基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；18SrRNA基因在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后18SrRNA基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；再次擴增后18SrRNA基因Ct值小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定。

5、上述18SrRNA基因檢測結(jié)果結(jié)合鱷魚特異基因Ct值判定待測皮革是否為天然鱷魚皮革的判定標準為：

待測皮革鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；再次擴增后鱷魚特異基因Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革。

本發(fā)明提供了一種實時熒光PCR技術鑒定天然鱷魚皮革的引物、探針及具體檢測方法，具有良好的靈敏性和特異性，結(jié)合發(fā)明提供的判定方法可對皮革是否為天然鱷魚皮革進行快速準確的鑒定。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1檢測天然鱷魚皮革陽性樣品18SrRNA基因和鱷魚特異基因的熒光PCR擴增圖；其中，1為天然灣鱷皮革；2為天然暹羅鱷皮革；3為天然尼羅鱷皮革。

圖2是本發(fā)明實施例2檢測天然鱷魚皮革、天然牛皮革、天然羊皮革、天然豬皮革、天然馬皮革樣品18SrRNA基因和鱷魚特異基因的熒光PCR擴增圖；其中，1為天然鱷魚皮革；2為天然牛皮革；3為天然羊皮革；4為天然豬皮革；5為天然馬皮革；6為人造革。

具體實施方式：

下面對本發(fā)明做進一步詳細說明。

實施例1：鱷魚特異基因檢測引物和探針的準確性驗證

1.設計鱷魚特異基因檢測引物和探針：

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)對灣鱷(Crocodylus porosus)、暹羅鱷(Crocodylus siamensis)、尼羅鱷(Crocodylus niloticus)、美洲鱷(Crocodylus acutus)、古巴鱷(Crocodylus rhombifer)和奧瑞納克鱷(Crocodylus intermedius)進行生物信息學分析，選擇合適的鱷魚特異基因作為對象，設計并合成實時熒光PCR特異性擴增引物和探針，分別為：

上游引物P1：GGATGAACAGTCTAYCCA

下游引物P2：GCCGTGGTAATAAARTTAA

帶有熒光染料的探針序列為：CCACGCCGGACCATCAGTAG

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

用于實時熒光PCR檢測18SrRNA基因的引物探針，分別為：

上游引物P1：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA

下游引物P2：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

帶有熒光染料的探針序列為：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

2.樣品DNA的提取與純化按以下步驟進行：

(1)分別稱取1g天然灣鱷皮革、天然暹羅鱷皮革和天然暹羅鱷皮革，剪碎，加入10mL磷酸鹽緩沖液浸泡過夜，然后將浸泡后的樣品攪拌破碎；

(2)取3mL破碎的樣品，加入50μL蛋白酶K，加入3mL2％的十六烷基三甲基溴化銨裂解緩沖液，振蕩懸浮后65℃溫浴60min，期間不斷晃動，取出后加入1mL飽和氯化鈉溶液，劇烈振蕩5min，0℃靜置5min，12000rpm離心10min；

(3)取上清950μL加入2mL離心管中，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕柔混勻靜置5min，12000rpm離心15min；

(4)取上清750μL加入2mL離心管中，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕柔混勻靜置5min，12000rpm離心15min；

(5)取上清500μL加入1.5mL離心管中，加入300μL異丙醇，50μL乙酸鉀溶液，輕輕顛倒混勻，室溫靜置30min，12000rpm離心15min，棄上清；

(6)加入1.0mL70％乙醇溶液，將沉淀懸浮浸泡，并將離心管傾斜，輕輕轉(zhuǎn)動數(shù)圈后室溫靜置2min，12000rpm離心10min，棄上清，如沉淀多重復此步驟一次；

(7)小心棄去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100μL ddH₂O，65℃溶解DNA。

也可使用等效的商品化試劑盒提取皮革DNA。

3.建立實時熒光PCR擴增反應體系

將檢測鱷魚特異基因和18SrRNA基因的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L，實時熒光PCR反應體系為：

在各設定的實時熒光PCR反應管中分別加入制備的模板DNA溶液，蓋緊管，瞬離5s-10s。

將加好樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測系統(tǒng)內(nèi)，記錄樣本擺放順序。

循環(huán)條件設置：95℃/10min，1個循環(huán)；95℃/15s，58℃/30s，40個循環(huán)，設立FAM通道，在每次循環(huán)的58℃/30s時收集熒光，檢測完畢后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果。

4.所述確定質(zhì)量控制指標

空白對照：以ddH₂O為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陰性對照：以非天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因Ct值小于36、鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陽性對照：以天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均小于36；

5.結(jié)果判定：

待測皮革18SrRNA基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定；待測皮革18SrRNA基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；18SrRNA基因在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后18SrRNA基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；再次擴增后18SrRNA基因Ct值小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定。

待測皮革鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；再次擴增后鱷魚特異基因Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革。

6.檢測結(jié)果：

本發(fā)明實施例1使用發(fā)明提供的鱷魚特異基因和18SrRNA基因檢測引物和探針對天然灣鱷皮革、天然暹羅鱷皮革和天然暹羅鱷皮革樣品進行檢測，將待檢皮革樣品提取DNA后，進行實時熒光PCR檢測，天然灣鱷皮革、天然暹羅鱷皮革和天然暹羅鱷皮革樣品的18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均小于36，顯示如圖1所示的陽性擴增曲線，均判定為天然鱷魚皮革。實施例1表明發(fā)明提供的鱷魚特異基因檢測引物和探針能對天然鱷魚皮革樣品進行良好擴增。

實施例2：鱷魚特異基因檢測引物和探針的特異性驗證

1.所用引物和探針：

實時熒光PCR檢測鱷魚特異基因的引物探針，分別為：

上游引物P1：GGATGAACAGTCTAYCCA

下游引物P2：GCCGTGGTAATAAARTTAA

帶有熒光染料的探針序列為：CCACGCCGGACCATCAGTAG

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

實時熒光PCR檢測18SrRNA基因的引物探針，分別為：

上游引物P1：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA

下游引物P2：AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT

帶有熒光染料的探針序列為：CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC

上述熒光染料5‘端為FAM標記，3’端為TAMRA標記。

2.樣品DNA的提取與純化按以下步驟進行：

(1)分別稱取1g天然鱷魚皮革、天然牛皮革、天然羊皮革，天然豬皮革、天然馬皮革和人造革，剪碎，加入10mL磷酸鹽緩沖液浸泡過夜，然后將浸泡后的樣品攪拌破碎；

(2)取3mL破碎的樣品，加入50μL蛋白酶K，加入3mL2％的十六烷基三甲基溴化銨裂解緩沖液，振蕩懸浮后65℃溫浴60min，期間不斷晃動，取出后加入1mL飽和氯化鈉溶液，劇烈振蕩5min，0℃靜置5min，12000rpm離心10min；

(3)取上清950μL加入2mL離心管中，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕柔混勻靜置5min，12000rpm離心15min；

(4)取上清750μL加入2mL離心管中，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕柔混勻靜置5min，12000rpm離心15min；

(5)取上清500μL加入1.5mL離心管中，加入300μL異丙醇，50μL乙酸鉀溶液，輕輕顛倒混勻，室溫靜置30min，12000rpm離心15min，棄上清；

(6)加入1.0mL70％乙醇溶液，將沉淀懸浮浸泡，并將離心管傾斜，輕輕轉(zhuǎn)動數(shù)圈后室溫靜置2min，12000rpm離心10min，棄上清，如沉淀多重復此步驟一次；

(7)小心棄去上清液，干燥DNA沉淀，加入50-100μL ddH₂O，65℃溶解DNA。

也可使用等效的商品化試劑盒提取皮革DNA。

3.建立實時熒光PCR擴增反應體系

將檢測鱷魚特異基因和18SrRNA基因的上游引物、下游引物和探針稀釋至10μmol/L，實時熒光PCR反應體系為：

在各設定的實時熒光PCR反應管中分別加入制備的模板DNA溶液，蓋緊管，瞬離5s-10s。

將加好樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測系統(tǒng)內(nèi)，記錄樣本擺放順序。

循環(huán)條件設置：95℃/10min，1個循環(huán)；95℃/15s，58℃/30s，40個循環(huán)，設立FAM通道，在每次循環(huán)的58℃/30s時收集熒光，檢測完畢后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果。

4.所述確定質(zhì)量控制指標

空白對照：以ddH₂O為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陰性對照：以非天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因Ct值小于36、鱷魚特異基因Ct值均大于或等于40；

陽性對照：以天然鱷魚皮革提取的DNA為模板，按照2和3所述條件，進行實時熒光PCR反應，18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均小于36；

5.結(jié)果判定：

待測皮革18SrRNA基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定；待測皮革18SrRNA基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；18SrRNA基因在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后18SrRNA基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然皮革；再次擴增后18SrRNA基因Ct值小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，則結(jié)合鱷魚特異基因Ct值進行天然鱷魚皮革判定。

待測皮革鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值小于36，陰性對照、陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革；

待測皮革鱷魚特異基因Ct值在36-40之間，應重做實時熒光PCR擴增，再次擴增后鱷魚特異基因Ct值大于或等于40，且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為非天然鱷魚皮革；再次擴增后鱷魚特異基因Ct值仍小于40且陰性對照，陽性對照和空白對照結(jié)果正常，判定該皮革為天然鱷魚皮革。

6.檢測結(jié)果：

本發(fā)明實施例2使用發(fā)明提供的鱷魚特異基因和18SrRNA基因檢測引物和探針分別對天然鱷魚皮革、天然牛皮革、天然羊皮革，天然豬皮革天然馬皮革和人造革進行實時熒光PCR檢測，結(jié)果顯示如圖2所示的擴增曲線。具體結(jié)果為天然鱷皮革樣品的18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均小于36，判定為天然鱷魚皮革；天然牛皮革、天然羊皮革，天然豬皮革和天然馬皮革樣品18SrRNA基因Ct值小于36，鱷魚特異基因Ct值大于40，未出現(xiàn)非特異擴增，判定為非天然鱷魚皮革；人造革18SrRNA基因和鱷魚特異基因Ct值均大于40，判定為非天然皮革。通過實施例2表明本發(fā)明的提供的鱷魚特異基因檢測引物和探針具有良好的特異性。

上述實施例僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明專利的限制；應當指出的是，對于本領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍；因此，凡跟本發(fā)明權利要求范圍所做的均等變化與修飾，均應屬于本發(fā)明權利要求的覆蓋范圍。