本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別雜交水稻細胞質(zhì)雄性不育系花粉敗育類型為典敗型(敗育花粉為不規(guī)則形狀，不可被碘染色)與染敗型(敗育花粉為圓形，可被碘部分染色)的PCR方法。

背景技術(shù)：

作為提高水稻產(chǎn)量的有效措施，雜交水稻已在我國得到廣泛應(yīng)用。長期以來廣泛應(yīng)用的三系雜交水稻技術(shù)體系的核心是細胞質(zhì)雄性不育系。

用1％的I₂-KI溶液對花粉染色鏡檢可將生產(chǎn)上應(yīng)用的細胞質(zhì)雄性不育系分為典敗型、圓敗型和染敗型不育系(李炳澤等，雜交水稻的研究與實踐，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1982,18-103)。顯微鏡下，花粉粒為梭形、菱形或其他不規(guī)則形狀，不被I₂-KI溶液染色，為典敗型花粉；花粉粒為圓形且不被I₂-KI溶液染色，為圓敗型花粉粒；花粉粒為圓形可被部分染色，呈現(xiàn)棕色或黑色，為染敗型花粉。顯微鏡下敗育花粉粒所占的比例決定不育系的主要敗育類型。生產(chǎn)上應(yīng)用的極大多數(shù)的細胞質(zhì)雄性不育系或為典敗型或為染敗型，只有少數(shù)如紅蓮型、茶野型不育系是圓敗型。

不育系的花粉敗育類型與其育性的可恢復(fù)性密切相關(guān)，既影響著不育系的應(yīng)用，又影響與恢復(fù)系組配的雜交稻的結(jié)實率，因此，鑒定不育系的花粉敗育類型對雜交育種具有重要意義。目前，鑒別不育系花粉敗育類型唯一方法是等待不育系進入開花期，取花粉用I₂-KI溶液染色、鏡檢觀察，從而判斷不育系花粉的敗育類型。這種方法只有在不育系進入開花期獲得花粉后才可進行，而且由于水稻在整個生育期都可能受到自然條件的脅迫，影響花粉的敗育。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速鑒別雜交水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的方法十分必要。

水稻分子生物學(xué)的研究及PCR分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為準(zhǔn)確快速鑒別水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系提供了有效的方法。本發(fā)明基于與水稻細胞質(zhì)雄性不育系花粉敗育相關(guān)的線粒體基因的研究，利用PCR技術(shù)對水稻典敗型與染敗型細胞質(zhì)雄性不育系進行準(zhǔn)確快速鑒別。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種實驗條件和操作較為簡單、樣品用量少，能準(zhǔn)確、快速鑒別水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的PCR方法，為生產(chǎn)上提供一種典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系鑒定的實用技術(shù)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

1.鑒別水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的特異引物，其特征在于：所述特異引物由3對引物atp6-orf79、orWA352和LD29組成；所述引物atp6-orf79由上游引物atp6-orf79F和下游引物atp6-orf79R組成，所述上游引物atp6-orf79F的堿基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物atp6-orf79R的堿基序列如SEQ ID NO：2所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為1592bp；所述引物orWA352由上游引物orWA352F和下游引物orWA352R組成，所述上游引物orWA352F的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物orWA352R的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為1432bp；所述引物L(fēng)D29由上游引物L(fēng)D29F和下游引物L(fēng)D29R組成，所述上游引物L(fēng)D29F的堿基序列如SEQ ID NO：5所示，下游引物L(fēng)D29R的堿基序列如SEQ ID NO：6所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為905bp或2555bp。

2.一種水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的PCR鑒別方法，特征在于包括以下步驟：

(1)從水稻細胞質(zhì)雄性不育系材料提取總DNA樣品，每個DNA樣品分成三份，第一份用技術(shù)方案1中所述的引物atp6-orf79進行PCR反應(yīng)，第二份用技術(shù)方案1中所述的引物orWA352進行PCR反應(yīng)，第三份用技術(shù)方案1中所述的引物L(fēng)D29進行PCR反應(yīng)；

(2)PCR反應(yīng)：

A.引物atp6-orf79對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物atp6-orf79F 0.25μL，20pmol/L下游引物atp6-orf79R 0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL，完成PCR反應(yīng)后，放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物atp6-orf79的PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性2min，30個循環(huán)后72℃延伸10min；

B.引物orWA352對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物orWA352F 0.25μL，20pmol/L下游引物orWA352R 0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL，完成PCR反應(yīng)后，放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物orWA352PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性1min30s，30個循環(huán)后72℃延伸10min；

C.引物L(fēng)D29對每個DNA樣品PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL，20pmol/L上游引物L(fēng)D29F 0.25μL，20pmol/L下游引物L(fēng)D29R 0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL，完成PCR反應(yīng)后，放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物L(fēng)D29的PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性3min，20個循環(huán)后72℃延伸10min；

(3)待上述3個PCR擴增完成后，同時各取5μL擴增產(chǎn)物，分別采用2％的瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，在電壓120V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，電泳分離PCR擴增的產(chǎn)物，如果引物orWA352和引物L(fēng)D29的PCR擴增產(chǎn)物分別為1432bp和2555bp的單一條帶，且引物atp6-orf79無擴增條帶，則確定所檢材料為典敗型水稻細胞質(zhì)雄性不育系；如果引物atp6-orf79和LD29的PCR擴增產(chǎn)物分別為1592bp和905bp的單一條帶，且引物orWA352為無擴增條帶，則確定所檢材料為染敗型水稻細胞質(zhì)雄性不育系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點和有益效果是：

創(chuàng)新點：

(1)3對特異引物組合進行PCR提高鑒別的精確性；

(2)通過改變PCR的循環(huán)次數(shù)提高鑒別效果。

有益效果：

在水稻種子、苗期即可預(yù)期所檢材料為可育/敗育，是典敗型敗育還是染敗型敗育，不需等到水稻抽穗開花時期，在選育典敗型和染敗型不育系過程中可縮短育種年限，減少工作量，具有操作簡單、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是引物atp6-orf79的上游引物atp6-orf79F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是引物atp6-orf79的下游引物atp6-orf79R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是引物orWA352的上游引物orWA352F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物orWA352的下游引物orWA352R的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是引物L(fēng)D29的上游引物L(fēng)D29F的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是引物L(fēng)D29的下游引物L(fēng)D29R的堿基序列。

附圖說明

圖1：水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系PCR鑒別結(jié)果。圖中泳道1-12為水稻細胞質(zhì)雄性不育系，其中2、3、5、7、8、9、11和12為典敗型不育系，1、4、6和10為染敗型不育系。1-9分別為BT型(粳139A)、D型(D62A)、矮敗型(矮敗型合系42A)、滇Ⅰ型(滇Ⅰ型合系42A)、岡型(G46A)、紅蓮型(紅蓮型滇榆A)、印水型(印水型合系42A)、K型(K型遼207A)和野敗型(野敗型合系42A)細胞質(zhì)雄性不育系，10-12分別為D-7/粳23A、滇屯502/H23A、IR58025/合系42A，均為新質(zhì)源細胞質(zhì)雄性不育系。M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。左側(cè)為PCR引物名稱，右側(cè)標(biāo)示PCR擴增條帶的分子量大小。

具體實施方式

以下實施例無特殊說明為常規(guī)方法。

1、材料

所用材料如表1所示，

表1材料來源表

表1中所有供試材料已在如下非專利文獻中公開，本專利申請人云南農(nóng)業(yè)大學(xué)從申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放上述所有供試材料，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)地址：云南省昆明市盤龍區(qū)黑龍?zhí)逗诮鹇?5號，郵編：650201。

1、粳139A公開文獻：王先俱等，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交粳稻新組合粳優(yōu)558的選育與應(yīng)用，雜交水稻，2012,27(4)：20-22。

2、D62A和G46A公開文獻：廖金花等，秈型紅米雄性不育系紅寶石的選育及其特性，種子，2004,23(3)：14-16。

3、滇Ⅰ型合系42A公開文獻：程賢宇等，滇Ⅰ型不育系合系42A高產(chǎn)繁殖技術(shù)，種子，2012(2)：122-123。

4、矮敗型合系42A、紅蓮型滇榆A、印水型合系42A、K型遼207A、野敗型合系42A公開文獻：孫朝華等，不同細胞質(zhì)源粳稻雄性不育系花粉敗育特點研究，雜交水稻,2013,28(3):68-71。

5、D-7/粳23A、滇屯502/H23A、IR58025/合系42A公開文獻：Wang SH et al.,Pollen abortive characters of new cytoplasmic male sterile lines and their potential heterosis in japonica Rice,Journal of Yunnan Agricultural University,2009,24(3):331-335。

2、DNA提取

采用改良的CTAB法(Rogers and Bendich,Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues,Plant Mol Biol,1985,5(2):69–76)提取水稻總DNA，取表1中12個水稻不育系嫩葉各約0.5g分別放入到已編號(編號同表1材料來源表)的1.5mL離心管中，每一材料的總DNA提取均按以下操作進行：

(1)取細胞質(zhì)源水稻不育系嫩葉約0.5g放入到已編號的1.5mL離心管中，加入液氮并快速研磨成粉末狀，待液氮揮發(fā)完畢后加入2×CTAB緩沖液700μL，放入65℃水浴鍋中1h，每隔20min混勻一次。

(2)取出離心管，10000×g，離心10min。取上清液至已編號(編號同表1材料來源表)的1.5mL新離心管。

(3)在上清液中加入700μL氯仿異戊醇混合液(三氯甲烷：異戊醇(v/v)＝24:1)，顛倒混勻至分層明顯。10000×g，離心10min，取600μl上清液移至已編號(編號同表1材料來源表)的1.5mL新離心管。

(4)重復(fù)步驟(3)。

(5)在上清液中加入等體積預(yù)冷的異丙醇。將離心管輕輕顛倒混勻約1min后，-20℃冰箱中沉降1h。

(6)取出后10000×g，離心10min。棄上清液，用70％乙醇洗滌后再用95％乙醇洗滌。

(7)37℃烘干至無酒精，加100μL已滅菌的雙蒸水，現(xiàn)用或-20℃冰箱保存。

提總DNA過程大約需3h。

3、PCR擴增

(1)引物序列設(shè)計

根據(jù)對水稻細胞質(zhì)雄性不育系花粉敗育相關(guān)的線粒體基因的研究文獻選取引物。atp6-orf79和LD29來自文獻(Luan et al.,Mitochondrial DNA genetic polymorphism in thirteen rice cytoplasmic male sterile lines,Plant Cell Rep,2013，32(4):545–554)；orWA352來自文獻(Luo et al.,A detrimental mitochondrial-nuclear interaction causes cytoplasmic male sterility in rice,Nat Genet,2013，45:573–577)。全部引物由華大基因(BGI)合成。將表1中12個水稻不育系的每個DNA樣品等量分成三份，第一份用引物atp6-orf79進行PCR反應(yīng)，第二份用引物orWA352進行PCR反應(yīng)，第三份用引物L(fēng)D29進行PCR反應(yīng)；

(2)PCR反應(yīng)：

A.引物atp6-orf79分別對表1中12個水稻不育系的每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(購自北京博邁德公司)，20pmol/L上游引物atp6-orf79F 0.25μL，20pmol/L下游引物atp6-orf79R0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反應(yīng)后，將PCR管放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物atp6-orf79的PCR反應(yīng)程序進行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性2min，30個循環(huán)后72℃延伸10min，耗時104min(每次可同時檢測96個樣品)，所述上游引物atp6-orf79F的堿基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物atp6-orf79R的堿基序列如SEQ ID NO：2所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為1592bp。

B.引物orWA352分別對表1中12個水稻不育系的每個DNA樣品PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(購自北京博邁德公司)，20pmol/L上游引物orWA352F 0.25μL，20pmol/L下游引物orWA352R0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反應(yīng)后，將PCR管放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物orWA352的PCR擴增程序進行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性1min30s，30個循環(huán)后72℃延伸10min，完成引物orWA352一次PCR(每次可同時檢測96個樣品)共耗時89min，所述上游引物orWA352F的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物orWA352R的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為1432bp。

C.引物L(fēng)D29分別對表1中12個水稻不育系的每個DNA樣品PCR擴增反應(yīng)體系總體積均為25μL，其中Taq PCR Master Mix 12.5μL(購自北京博邁德公司)，20pmol/L上游引物L(fēng)D29F 0.25μL，20pmol/L下游引物L(fēng)D29R 0.25μL，模板DNA 1μL，無菌雙蒸水11μL；按照上述配制完成PCR反應(yīng)后，將PCR管放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物L(fēng)D29的PCR擴增程序進行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性4min，循環(huán)內(nèi)94℃變性30s，55℃退火30s，72℃復(fù)性3min，20個循環(huán)后72℃延伸10min，耗時94min(每次可同時檢測96個樣品)，所述上游引物L(fēng)D29F的堿基序列序列表如SEQ ID NO：5所示，下游引物L(fēng)D29R的堿基序列如SEQ ID NO：6所示，目標(biāo)產(chǎn)物片段長度為905bp或2555bp。

(3)待上述12個水稻不育系的各PCR反應(yīng)完成后，各取5μLPCR擴增產(chǎn)物，分別采用2％的瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠(EB)染色，在電壓120V下電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

(4)特異引物在水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的電泳結(jié)果如圖1，結(jié)果可見，典敗型不育系中(泳道2、3、5、7、8、9、11、12)，引物orWA352和LD29分別擴增出1432bp和2555bp的單一條帶，且引物atp6-orf79無條帶。染敗不育系中(泳道1、4、6、10)，atp6-orf79和LD29分別擴增出1592bp和905bp的單一條帶，且引物orWA352無條帶。表明本方法能在水稻的幼苗時期就將典敗型與染敗型水稻細胞質(zhì)雄性不育系準(zhǔn)確的鑒別出來。

整個鑒別過程(可同時鑒別96個樣品)耗時約8-9h，如果3臺PCR儀同時進行則約4-5h。

<110> 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 水稻典敗型和染敗型細胞質(zhì)雄性不育系的PCR鑒別方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

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