本發(fā)明涉及高分子生物材料的技術領域，尤其涉及一種具有酯酶響應的陽離子聚合物。

背景技術：

近年來，基于核酸藥物的基因治療因在代謝類疾病、癌癥等各種遺傳性疾病治療方面具有特異性強、副作用小的特點而引起了極大的關注。游離的核酸藥物會很快的被血液及細胞中的核酸酶降解，且由于其帶負電荷，不易穿過細胞膜，很難實現入核以及轉染的目的，所以大量研究工作聚焦于開發(fā)能有效包裝和保護核酸藥物的基因載體。

病毒載體例如逆轉錄病毒、腺病毒等，在絕大多數細胞系中具有高效的基因轉染效率，但其潛在的致癌特性以及免疫原性在很大程度上限制了其在臨床上的廣泛應用。

陽離子聚合物作為非病毒載體，可中和核酸藥物的負電荷并將其壓縮成納米顆粒從而保護DNA不被降解，并幫助其進入細胞。直鏈及枝化聚乙烯亞胺(PEI)是一種常用的陽離子基因轉染載體材料，其中，分子量為25kDa的PEI具有較高的轉染效率，一直以來被用作基因轉染載體材料的金標準，但其較高的細胞毒性限制了它的應用。較低分子量的PEI，如分子量低于800Da的PEI，雖然細胞毒性很小，但由于其不能很好地壓縮DNA故而轉染效率較低。同時，這種通過正/負靜電相互作用形成的陽離子聚合物/核酸藥物復合物納米顆粒是熱力學穩(wěn)定的，該復合物納米顆粒進入細胞后很難解離釋放出核酸藥物，導致核酸藥物難以發(fā)揮藥效(A.B.Hill,M.Chen,C.-K.Chen,B.A.Pfeifer,C.H.Jones,Overcoming Gene-Delivery Hurdles:Physiological Considerations for Nonviral Vectors,Trends in Biotech.,34 91-105)。

因此，需要設計能夠響應細胞內微環(huán)境并能夠快速釋放出核酸藥物的載體，提高核酸藥物的藥效。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一類具有酯酶響應的陽離子聚合物，可以作為基因載體材料，在細胞內的酯酶水解時轉變?yōu)閹ж撾姾苫螂娭行缘木酆衔?，從而快速釋放出攜帶的核酸藥物，使其有效表達，兼具轉染效率高、毒性低的特性。

本發(fā)明公開了一種具有酯酶響應的陽離子聚合物，所述陽離子聚合物由聚丙烯酸酯、含一級氨基或二級氨基的聚合物與羧酸酯反應制備得到；

可選擇地，所述的陽離子聚合物再進行季胺化反應；

所述陽離子聚合物側鏈的羧酸酯可被酯酶快速水解變?yōu)殡娭行曰螂娯撔浴?/p>

作為優(yōu)選，所述的含一級氨基或二級氨基的聚合物為聚乙烯亞胺(PEI)。

作為優(yōu)選，采用碘甲烷或硫酸二甲酯進行季胺化反應。

進一步優(yōu)選，所述陽離子聚合物的結構式如下式中A～D所示：

式中，n＝5～300，R和R′獨立地選自碳數為1～6的烷基或芳香基。

再優(yōu)選，所述的n＝40～250。

本發(fā)明公開的具有酯酶響應的陽離子聚合物，在細胞內酯酶存在的條件下其烷基酚基酯會快速水解，觸發(fā)釋放酚基芐醇的反應。

如聚合物A～C，經水解直接生成羧酸根，并與氨基形成中性的離子對，見下式Ⅰ；

如聚合物，經水解后先生成三級胺，再進一步水解生成帶負電的聚丙烯酸。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

本發(fā)明公開的具有酯酶響應的陽離子聚合物，其羧酸酚基酯在細胞內的酯酶條件下快速斷裂，并觸發(fā)釋放羥基苯甲醇的反應生成三級胺并進一步水解生成電負性的聚丙烯酸，或直接生成電中性的聚(N-羧基乙烯亞胺)，從而由正電性變?yōu)樨撾娦曰螂娭行?，從而能夠與帶負電荷的DNA或siRNA有效解離，降低細胞毒性，提高轉染效率。

附圖說明：

圖1為聚合物A1～A7的¹H-NMR核磁共振譜圖；

圖2為聚合物A1在100U/ml的酯酶的PBS溶液中乙酰酚基酯的水解速率和相應的電性從帶正電向負電轉變的過程；

圖3為聚合物A1-A7在不同細胞系上轉染熒光素酶的能力。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明所述酯酶響應的基因載體材料及其合成方法作進一步說明，以助于理解本發(fā)明的內容。

實施例1：[N-丙酸(4-乙酰氧基)芐基酯]-N-甲基季胺化聚乙烯亞胺的合成(聚合物A1～A7)

10ml 4-乙酰氧基苯甲醇和6ml三乙胺溶于100ml二氯甲烷，用冰浴將該溶液冷卻至0℃，然后在快速攪拌下向該溶液緩慢滴加含5ml丙烯酰氯的二氯甲烷(50ml)溶液，滴加完后將該溶液在室溫下攪拌4h。過濾該溶液并用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌二氯甲烷溶液三次，然后用無水硫酸鎂干燥、蒸餾，得到終產物4-乙酰氧基芐基丙烯酸酯。

稱取0.17克分子量10KDa的聚乙烯亞胺(PEI-10KDa，約4mmol可供反應的NH基團)，溶解于3mlN,N-二甲基甲酰胺中，然后加入2.2克4-乙酰氧基芐基丙烯酸酯，室溫攪拌下反應48小時后轉至45℃油浴反應24小時；向反應產物中加入1.5克碘甲烷(約10mM)，避光反應過夜；真空烘箱除去殘留溶劑，分別用NaCl溶液和去離子水透析后，冷凍干燥得到粉末狀的聚合物(R′＝CH₃)，記為聚合物A1。

類似地，用4-烷(苯)酰氧基苯甲醇與丙烯酰氯反應分別得到4-烷(苯)酰氧基芐基丙烯酸酯，再分別與PEI反應和季胺化后制備得到聚合物A2～A7。聚合物A1～A7的¹H-NMR核磁共振譜圖見圖1，并給出支化聚乙烯亞胺的核磁共振譜圖作為對比。

R′＝CH₂CH₃，記為A2；

R′＝CH₂CH₂CH₃，記為A3；

R′＝CH₂CH₂CH₂CH₃，記為A4；

R′＝CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃，記為A5；

R′＝C₆H₅，記為A6；

R′＝CH(CH₂CH₂CH₃)₂，記為A7。

實施例2：[N-丙酸(4-乙酰氧基)芐基酯]聚乙烯亞胺的(聚合物B，R′＝CH₃)合成

稱取0.17克分子量10KDa的聚乙烯亞胺(PEI-10KDa，約4mmol可供反應的NH基團)，溶于3mlN,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入2.2克4-乙酰氧基芐基丙烯酸酯，室溫攪拌下反應48小時后轉至45℃油浴反應24小時，先用二氯甲烷稀釋該反應溶液，再用乙醚沉淀；然后反復溶解/沉淀三次，固體在真空烘箱除去殘留溶劑，得到聚合物B(R′＝CH3).

核磁檢測數據為：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,δ):7.10，7.25，(4H,phenyl ring CH＝),5.2(2H,COOCH₂),3.8(NCH₂),2.1-2.5(6H,NCH₂CH₂N，CH₂COO,),2.3(3H,CH₃COO)。結構式如下：

記為B1。

實施例3：[N-乙酸(4-乙酰氧基)芐基酯]-N-甲基季胺化聚乙烯亞胺(聚合物C，R′＝CH₃)

在三口燒瓶中加入4-乙酰氧基苯甲醇18g(0.11mo1)、三聚磷酸鈉18.40g(0.05mol)和80ml氯仿，在室溫劇烈攪拌下，于30min內用恒壓滴液漏斗滴加溴乙酰氯(15.74g，0.10mol)溶于30ml氯仿的溶液.繼續(xù)攪拌2.5h，抽濾，有機相分別用飽和食鹽水、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌至中性，分液，用無水硫酸鈉干燥.常壓蒸去氯仿，減壓裝置蒸餾得到溴乙酸4-乙酰氧基芐基酯。

稱取0.17克分子量10KDa的聚乙烯亞胺(PEI-10KDa，約4mmol可供反應的NH基團)，三聚磷酸鈉3g，溶于3ml N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入1.5克溴乙酸4-乙酰氧基苯甲醇酯，室溫攪拌下反應48小時；過濾，再向反應產物中加入1.5克碘甲烷(約10mM)，避光反應過夜；真空烘箱除去殘留溶劑，分別用NaCl溶液和去離子水透析后，冷凍干燥得到粉末狀的聚合物C(R′＝CH₃)，記為C1。

核磁檢測數據為：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,δ):7.10，7.25，(4H,phenyl ring CH＝),5.2(2H,COOCH₂),4.25(2H，N⁺CH₂COO),3.2-3.8(7H,N⁺CH₂CH₂N⁺),2.3(3H,CH₃COO)。

實施例4：聚{2-[(N,N-二乙基-N-(4-乙酰氧基)芐基-季胺基]乙基丙烯酸酯}(聚合物D，R＝CH₂CH₃，R′＝CH₃)的制備

按文獻方法(Liu et al.Advanced Materials 2016,28,1714)由單體丙烯酸N,N-二乙基氨基乙基酯[2-(N,N-diethylaminoethyl)acrylate]聚合制備其聚合物，簡稱PDEAEA。稱取PDEAEA0.3g，4-乙酰氧基卞溴0.6g，混合溶于N,N-二甲基甲酰胺溶劑中，室溫下攪拌，反應24小時，將產物用超純水溶解后，置于活化后的截留分子量為3500Da的透析袋中透析12小時。透析結束后，將透析袋中溶液凍干干燥，得到產物聚合物D(R＝CH₂CH₃，R′＝CH₃)，記為D1，結構式如下。

核磁檢測數據如下：¹H-NMR(400MHz,CDCl₃,δ):7.1-7.3，(4H,phenyl ring CH＝),4.5-5.0(4H,COOCH₂,NCH₂phenyl),3.0-3.8(broad,6H,NCH₂),1.5-2.5(broad,6H,CHCH₂,CH₃COO),1.28(6H,NCH₂CH₃).

實施例5：聚合物A1在酯酶催化下的水解和電荷反轉

聚合物A1(3mg)溶于10mL超純水，濃度為0.3mg/mL，然后加入肝酯酶溶液至終濃度為100U/ml，37℃孵育。用10％甲醇水溶液作為流動相，流速為1ml/min，用高效液相色譜法(HPLC)分析聚合物A1水解生成的對羥基苯甲醇(HMP)，不同時間取樣，記錄HPLC曲線中275nm下的吸收峰面積，通過標準曲線計算出釋放比例。同時，溶液用動態(tài)光散射儀(DLS)測定溶液在不同時間聚合物的Zeta電位。觀察圖2可以發(fā)現，聚合物A1中的酯在不到一個小時內即已水解完全，并從原來帶正電荷逐漸變?yōu)閹ж撾姾伞?/p>

實施例6：聚合物A1～A7/DNA納米復合物的熒光素酶基因細胞轉染實驗

將細胞培養(yǎng)于48孔板中，細胞密度為25000個/孔，每孔含有0.4ml培養(yǎng)基，并將細胞置于5％CO₂濃度和95％濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。之后將每孔中培養(yǎng)基替換為0.4ml培養(yǎng)基(血清FBS含量為0％或者10％)，并分別加入含有聚合物PEI、A1～A7與DNA按一定氮磷比形成的聚合物/DNA納米復合物溶液50μL(含luciferase pGL4.13質粒DNA1μg)，培養(yǎng)4h。然后用新鮮的培養(yǎng)基棄替換含有納米復合物的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入100μL1×細胞裂解液，離心取上清，加入熒光素酶底物，用化學發(fā)光檢測儀測定化學發(fā)光強度。蛋白濃度用Bradford蛋白檢測試劑盒測定?；瘜W發(fā)光強度利用蛋白濃度歸一化，單位是每毫克蛋白發(fā)光強度。每一組數據均為同組試樣三個孔的平均值。結果如圖3所示，該酯酶響應的電荷反轉型基因輸送載體確實能有效地將DNA釋放出來促進轉染。同時它的轉染值還比陽性對照組PEI/DNA最高可高出30倍。圖3中，Hela和A549代表腫瘤細胞類型，N/P代表的聚合物中氮與DNA中磷原子的摩爾比，從左至右依次為PEI、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7。