本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及氘代二苯基氨基-三氟甲基嘧啶化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，具體涉及式(ⅰ)所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、其制備方法、其藥物組合物及其在治療細(xì)胞增殖性疾病中的用途。
背景技術(shù)：
肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為我國城市人口惡性腫瘤死亡原因的第1位。非小細(xì)胞肺癌(nsclc)占所有類型肺癌的85％以上。egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)是上皮生長因子(egf)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，也被稱作her1、erbb1。egfr屬于erbb受體家族的一種，該家族包括egfr(erbb-1)，her2/c-neu(erbb-2)，her3(erbb-3)和her4(erbb-4)。egfr是一種糖蛋白，屬于酪氨酸激酶型受體，細(xì)胞膜貫通，分子量170kda。
egfr抑制劑易瑞沙(gefinitib)和特羅凱(erlotinib)等已在臨床治療非小細(xì)胞肺癌病人中獲得巨大成功，但其耐藥問題也日益突出，耐藥的主要原因是egfr-t790m突變，約占耐藥病人總數(shù)的50％。目前雖有第二代egfr非可逆抑制劑(canertinib、afatinib、neratinib、pelitinib等)進(jìn)入臨床試驗，但這些分子對egfr-t790m突變體的選擇性差，造成藥物臨床耐受劑量較低，在其最大耐受劑量下，藥物無法在體內(nèi)達(dá)到其有效濃度而使得對多數(shù)耐藥病人無效。多數(shù)臨床試驗也已被迫終止。此外，皮疹和腹瀉是wt-egfr抑制劑導(dǎo)致的最顯著毒副作用。因此開發(fā)具有高特異性egfr-t790m突變體抑制劑已成為解決目前耐藥性問題的重要策略。
2014年5月20日，克洛維斯腫瘤公司(clovisoncology)宣布，美國fda授予其試驗藥物rociletinib(co-1686,avl-301)突破性治療藥物資格，其作為單一藥物二線用于治療t790m突變患者egfr突變非小細(xì)胞肺癌(nsclc)。
co-1686可用于治療egfr突變型nsclc，它能夠選擇性抑制t790m突變型egfr的同時使野生型egfr信號閑置。該藥開發(fā)用于攜帶初始激活突變egfr及t790m突變egfr的nsclc患者的治療，所有不同劑量水平均能顯示出良好反應(yīng)和長久益處。
氘代修飾是改進(jìn)藥物代謝性質(zhì)的一種非常有潛力的新藥開發(fā)技術(shù)。在該方法中，設(shè)法通過將一個或多個氫原子用氘原子取代從而減慢cyp介導(dǎo)的藥物代謝或減少不期望的代謝物的生成。氘是安全、穩(wěn)定、不具有放射性的同位素，與氫相比，氘與碳可以形成更強的鍵。在某些情況下，由氘形成的增加的鍵強度可以積極影響藥物的adme性質(zhì)，結(jié)果可能會明顯地延長其藥物代謝循環(huán)、減少有毒代謝物的產(chǎn)生和藥物間的相互作用、提高安全性以及獲得 更佳的療效。
即使氘原子摻入了已知的代謝位置，氘修飾對于藥物的代謝性質(zhì)的影響仍然是不可預(yù)測的。因此必須經(jīng)過氘代分子的實際制備和測試，才能確定氘代藥物與非氘代藥物在代謝方面的差別。
雖然co-1686能夠有效地抵抗t790m抗性突變，并且同時幾乎不抑制wt-egfr并且無相關(guān)的劑量限制性毒性，但是發(fā)現(xiàn)具有治療細(xì)胞增值性疾病(如非小細(xì)胞肺癌)且具有很好的口服生物利用度且有成藥性的新型化合物還是具有挑戰(zhàn)性的工作。
因此，本領(lǐng)域仍需要開發(fā)對適用作治療劑的突變型egfr激酶具有選擇性抑制活性或更好的藥效學(xué)/藥代動力學(xué)的化合物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一類新型的對突變型egfr激酶具有選擇性抑制活性和具有更好藥效學(xué)/藥代動力學(xué)性能的化合物及其用途。
本發(fā)明一方面提供一種式(ⅰ)所示的氘代化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：
其中：
r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r10、r11、r12、r13、r14、r15、r16、r17、r18、r19、r20、r21、r22、r23、r24、r25和r26各自獨立地為氫或氘；
r8為三氟甲基；
r9為氫；
附加條件是r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r10、r11、r12、r13、r14、r15、r16、r17、r18、r19、r20、r21、r22、r23、r24、r25和r26中至少一個是氘，并且排除如下所示的化合物：
在本發(fā)明的一些實施方案中，式(ⅰ)所示化合物的實例如下：
本發(fā)明的另一方面提供了一種治療egfr介導(dǎo)的疾病的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(ⅰ)化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽。
本發(fā)明的另一個方面提供了式(ⅰ)化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療egfr介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。
在本發(fā)明的部分實施方式中，所述egfr介導(dǎo)的疾病選自egfr-t790m激活突變介導(dǎo)的疾病。
在本發(fā)明的部分實施方式中，所述egfr介導(dǎo)的疾病是癌癥；所述癌癥選自卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、胃腸道間質(zhì)瘤、甲狀腺癌、膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、急性髓細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤、間皮瘤；所述肺癌可以選自非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌。
本發(fā)明的另一方面提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的式(ⅰ)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
本發(fā)明的藥物組合物可通過將本發(fā)明的化合物或其鹽與適宜的藥學(xué)上可接受的載體組合而制備，例如可配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠等。
給予本發(fā)明的化合物或其藥物可接受的鹽或其藥物組合物的典型途徑包括但不限于口服、直腸、透黏膜、經(jīng)腸給藥，或者局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域眾所周知的方法制造，如常規(guī)的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣藥丸法、磨細(xì)法、乳化法、冷凍干燥法等。
對于口服給藥，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合來配制該藥物組合物。這些載體能使本發(fā)明的化合物被配制成片劑、丸劑、錠劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、漿劑、懸浮劑等，用于對患者的口服給藥。
可以通過常規(guī)的混合、填充或壓片方法來制備固體口服組合物。例如，可通過下述方法獲得：將所述的活性化合物與固體賦形劑混合，任選地碾磨所得的混合物，如果需要則加入其它合適的輔劑，然后將該混合物加工成顆粒，得到了片劑或糖衣劑的核心。適合的輔料包括但不限于：粘合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑或矯味劑等。如微晶纖維素、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠溶液、蔗糖和淀粉糊；滑石、淀粉、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸；乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、山梨糖醇或磷酸二鈣；二氧化硅；交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、預(yù)交化淀粉、淀粉羥乙酸鈉、藻酸、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、甲基纖維素、瓊脂、羧甲基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮等?？梢愿鶕?jù)通常藥物實踐中公知的方法任選地對糖衣劑的核心進(jìn)行包衣，尤其使用腸溶包衣。
藥物組合物還可適用于腸胃外給藥，如合適的單位劑型的無菌溶液劑、混懸劑或凍干產(chǎn)品。
本發(fā)明所述的式(ⅰ)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽可以通過任何適用的途徑和方法給藥，例如通過口服或腸胃外(例如，靜脈內(nèi))給藥。式(ⅰ)化合物的治療有效量為從約0.0001到20mg/kg體重/天，例如從0.001到10mg/kg體重/天。
式(ⅰ)化合物的劑量頻率由患者個體的需求決定，例如，每天1次或2次，或每天更多次。給藥可以是間歇性的，例如，其中在若干天的期間內(nèi)，患者接受式(ⅰ)化合物的每日劑量，接著在若干天的期間，患者不接受式(ⅰ)化合物的每日劑量。
本發(fā)明的式(ⅰ)化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽也可用于制備治療心血管疾病、炎癥、感染、免疫性疾病、細(xì)胞增值性疾病、病毒性疾病、代謝性疾病或器官移植的藥物中的用途。
本發(fā)明的式(ⅰ)化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽亦可與其他治療藥物聯(lián)用治療上述疾病或者延緩所述疾病的進(jìn)展或發(fā)病，所述的其他治療藥物包括但并不限于：5-氟尿嘧啶、folfox、阿瓦斯丁(avastin,bevacizumab)、貝沙羅汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、骨化三醇(calcitriol)、卡奈替尼(canertinib)、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、 碳鉑(carboplatin)、塞來考昔(celecoxib)、西妥昔單抗(cetuximab)、順鉑(cisplatin)、達(dá)沙替尼(dasatinib)、地高辛(digoxin)、埃羅替尼(erlotinib)、依托泊甙(etoposide)、依維莫司(everolimus)、氟維司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)金雀異黃素(genistein)、伊馬替尼(imatinib)、依立替康(irinotecan)、拉帕替尼(lapatinib)、來那度胺(lenalidomide)、來曲唑(letrozole)、亞葉酸(leucovorin)、馬妥珠單抗(matuzumab)奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(doxetaxel)、帕尼單抗(panitumumab)、peg化的粒細(xì)胞集落剌激因子(pegfilgrastin)、peg化的α-干擾素(peglatedalfa-interferon)、培美曲塞(pemetrexed)、沙柏(satraplatin)、西羅莫司(sirolimus)、舒尼替尼(sunitinib)、舒林酸(sulindac)、泰索帝(taxotere)、替莫唑胺(temozomolomide)、馱瑞塞爾(torisel)、替西羅莫司(temsirolimus)、替吡法尼(tipifarnib)、曲妥單抗(trastuzumab)、丙戊酸(valproicacid)、長春氟寧(vinflunine)、索拉非尼(sorafenib)、克唑替尼(crizotinib)、埃克替尼(lcotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、托法替尼(tofacitinib)、pd-0332991(palbociclib)、安貝生坦(ambrisentan)、cd40和/或cd154特異性抗體、融合蛋白、nf-kb抑制劑、非甾體抗炎藥、凝血因子fxa抑制劑(如利伐沙班等)、抗-tnf抗體、抗生素藥物如剌孢霉素(calicheamicin)、放線菌素(actinomycin)、阿霉素(doxorubicin)等。
有關(guān)定義：
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫(yī)學(xué)判斷的范圍之內(nèi)，適用于與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，與合理的利益/風(fēng)險比相稱。
作為藥學(xué)上可接受的鹽，例如，與無機酸形成的鹽、與有機酸形成的鹽、與酸性氨基酸形成的鹽等。藥學(xué)上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸；甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有機酸；以及脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。
本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽可由含有酸根或堿基的母體化合物通過常規(guī)化學(xué)方法合成。一般情況下，這樣的鹽的制備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經(jīng)由游離堿形式的這些化合物與化學(xué)計量的適當(dāng)酸反應(yīng)來制備。
本發(fā)明的某些化合物可以以非溶劑化形式或者溶劑化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶劑化形式與非溶劑化的形式相當(dāng)，都包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的某些化合物可以以多晶或無定形形式存在。
本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物的任何原子若沒有特別指定，可代表該原子的任何一種穩(wěn)定的同位素。除非特別說明，當(dāng)結(jié)構(gòu)中某一位置被定義為h即氫(h-1)時，該位置僅含天然存在的同位素量。同樣，除非特別說明，當(dāng)結(jié)構(gòu)中某一位置被定義為d即氘(h-2)時，該位置含同位素量至少比天然存在的同位素量(0.015％)大3340倍(即至少會50.1％氘同位素)。
本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物的氘代率是指標(biāo)記合成的同位素含量與天然存在的同位素量的比值。本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物的每個指定氘原子的氘代率可至少為3500倍(52.5％)、至少為4000倍(60％)、至少為4500倍(67.5％)、至少為5000倍(75％)、至少為5500倍(82.5％)、至少為6000倍(90％)、至少為6333.3倍(95％)、至少為6466.7倍(97％)、至少為6566.7倍(98.5％)、至少為6600倍(99％)、至少為6633.3倍(99.5％)。
本發(fā)明中的同位素體(isotopologues)是指在化學(xué)結(jié)構(gòu)方面僅有同位素組成上不同的化合物。本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)、僅在其分子的原子組成中同位素的變化。因此，本發(fā)明中所標(biāo)記合成的在特定位置含氘化合物也同樣會含非常少的該位置的氫同位素體，本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物中的某位置的氫同位素體的量取決許多因素，其中包括氘代試劑(d2o、d2、nabd4、liald4等)的氘同位素純度以及引入氘同位素合成方法的有效性。然而，如前所述這種某位置的氫同位素體的量總數(shù)將少于49.9％。本發(fā)明中所標(biāo)記合成的化合物中的某位置的氫同位素體的量總數(shù)將少于47.5％、40％、32.5％、25％、17.5％、10％、5％、3％、1％或0.5％。
本發(fā)明中，任何未指定為氘的各原子以其天然同位素豐度存在。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的那些載體。“藥學(xué)上可接受的載體”是指與活性成份一同給藥的、有利于活性成份給藥的惰性物質(zhì)，包括但不限于國家食品藥品監(jiān)督管理局許可的可接受的用于人或動物(例如家畜)的任何助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、崩解劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。所述載體的非限制性實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇等。關(guān)于載體的其他信息，可以參考remington:thescienceandpracticeofpharmacy,21sted.,lippincott,williams&wilkins(2005)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。
術(shù)語“賦形劑”通常是指配制有效的藥物組合物所需要載體、稀釋劑和/或介質(zhì)。
針對藥物或藥理學(xué)活性劑而言，術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是指無毒的但能達(dá)到預(yù)期效果的藥物或藥劑的足夠用量。對于本發(fā)明中的口服劑型，組合物中一種活性物質(zhì)的“有效量”是指與該組合物中另一種活性物質(zhì)聯(lián)用時為了達(dá)到預(yù)期效果所需要的用量。有效量的確定因人而異，取決于受體的年齡和一般情況，也取決于具體的活性物質(zhì)，個案中合適的有效量可 以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)試驗確定。
術(shù)語“活性成分”、“治療劑”，“活性物質(zhì)”或“活性劑”是指一種化學(xué)實體，它可以有效地治療目標(biāo)紊亂、疾病或病癥。
在本發(fā)明中，式ⅰ所示化合物具對突變型egfr激酶具有優(yōu)異的選擇性抑制活性，同時展現(xiàn)出優(yōu)異的藥代動力學(xué)性質(zhì)。所述藥代動力學(xué)性質(zhì)可以通過本領(lǐng)域已知的實驗方法得到，例如但不僅限于體外肝臟微粒體實驗、大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)實驗等等。
本發(fā)明的化合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多種合成方法來制備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學(xué)合成方法的結(jié)合所形成的實施方式以及本領(lǐng)域技術(shù)上人員所熟知的等同替換方式，優(yōu)選的實施方式包括但不限于本發(fā)明的實施例。
本發(fā)明所使用的所有溶劑是市售的，無需進(jìn)一步純化即可使用。涉及對水和/或氧氣敏感的實驗的所有操作都在預(yù)干燥玻璃儀器中于氮氣氛下進(jìn)行。除非另有說明，所有原料均為商業(yè)原料，并且在使用前未作進(jìn)一步純化。本發(fā)明所用柱層析采用的是青島海洋化工所生產(chǎn)的硅膠(200-300目)。薄層色譜采用默克公司(e.merck)預(yù)涂色譜板(硅膠60pf254，0.25毫米)。核磁共振光譜分析使用的儀器為瓦里安vnmrs-400共振光譜儀，化學(xué)位移以四甲基硅烷(tms＝δ0.00)為內(nèi)標(biāo)，核磁共振氫譜數(shù)據(jù)的記錄格式為：質(zhì)子數(shù)，峰型(s，單峰；d，雙重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰)，耦合常數(shù)(以赫茲hz為單位)。
本發(fā)明采用下述縮略詞：dcm代表二氯甲烷；dipea代表二異丙基乙基胺；pe代表石油醚；ea代表乙酸乙酯；dmso代表二甲亞砜；dma代表n,n-二甲基乙酰胺；tfa代表三氟乙酸。
化合物經(jīng)手工或者
具體實施方式
下面的實施例可以更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實施例1式ⅰ-1化合物的制備
步驟1：式2化合物(d3-間苯二胺)的制備
在35ml微波反應(yīng)管中稱量間苯二胺(700mg，6.47mmol)，重水(8.8ml，485mmol)，溶清后加ru3(co)12催化劑(11mg，16.2umol)，微波150℃反應(yīng)1hr，抽濾除催化劑，旋蒸干溶劑后再重復(fù)操作，二次氘代得710mg標(biāo)題化合物；
ms(esi,[m+h]+)：112.0944；
1h‐nmr(300m，d2o)：7.05(s，1h)。
步驟2：式4化合物(1‐(4‐(4‐(4‐(2,4,6‐d‐3‐氨基苯基氨基)‐5‐(三氟甲基)嘧啶‐2‐基氨基)‐3‐甲氧基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酮)的制備
在35ml微波反應(yīng)管中稱量式3化合物(710mg，1.65mmol)，d3-間苯二胺(184mg，1.65mmol)，etoh20ml，微波100℃反應(yīng)90min，hplc監(jiān)控原料點消失，反應(yīng)液制砂，dcm-meoh洗脫(50:1到20：1)得標(biāo)題化合物(500mg，0.99mmol)；
ms(esi,[m+h]+)：505.2498；
1h-nmr(500m，dmso-d6)：8.23(s，1h)，8.10(s，1h)，8.08(s，1h)，7.55(s，1h)，6.94(s，1h)，4.94(s，2h)，3.78(s，3h)，3.58-3.57(d，4h)，3.29(s，2h)，3.12-3.06(d，4h)，2.05(s，3h)。
步驟3：式ⅰ-1化合物的制備
反應(yīng)瓶中稱量式4化合物(470mg，0.93mmol)，新蒸thf10ml溶清，加三乙胺(141mg，1.40mmol)，n2保護(hù)下滴加丙烯酰氯(169mg，1.86mmol)，3hr后點板原料消失，旋蒸反應(yīng)液，殘余物加水ea萃取，干燥旋蒸干得320mg，反應(yīng)液制砂，dcm-meoh洗脫得標(biāo)題化合物(210mg，0.38mmol)；
ms(esi,[m+h]+)：559.2978；
1h-nmr(500m，dmso-d6)：10.1(s，1h)，8.63(s，1h)，8.28(s，1h)，8.07(s，1h)，7.49～7.55(t， j＝9.69hz，2h)，7.24～7.29(t，j＝8.01hz，1h)，7.15～7.17(be，1h)，6.40～6.49(dd，1h)，6.28～6.29(d，j＝1.98hz，1h)，5.74～5.78(dd，1h)，3.77(s，3h)，3.57(s，4h)，3.07-3.01(d，4h)，2.04(s，3h)。
實施例2式ⅰ-2化合物的制備
步驟1：式7化合物(2-甲氧基-3,5,6-d-4-哌嗪苯胺)的制備
將式6化合物(2.5g，10.03mmol)加入三氟乙酸酐(2.5g，11.90mmol)的重水溶液中。密封管油浴加熱120℃反應(yīng)過夜，tlc檢測反應(yīng)完畢后，0℃下向反應(yīng)液中加入碳酸鉀固體調(diào)堿。用二氯甲烷萃取反應(yīng)液，有機相合并用飽和食鹽水洗，減壓旋蒸后得標(biāo)題化合物2.35g；
hrms(esi,[m+h]+)m/z：211.1638。
步驟2：式9化合物(1‐(4‐(2,5,6‐d‐3‐甲氧基‐4‐氨基苯基)哌嗪‐1‐基)乙酮)的制備
向式7化合物(1.03g，4.7mmol)的二氯甲烷溶液中加入式8化合物(0.52g，2.3mmol)。氮氣保護(hù)下室溫攪拌過夜，tlc檢測反應(yīng)完畢后向反應(yīng)中加入飽和碳酸鉀溶液淬滅反應(yīng)，用二氯甲烷萃取反應(yīng)液，有機相合并用飽和食鹽水洗，柱層析得標(biāo)題化合物0.53g；
hrms(esi,[m+h]+)m/z：253.1770。
步驟3：式ⅰ-2化合物的制備。
將式10化合物(374mg，1.1mmol)和三氟乙酸(130mg，1.1mmol)加入式9化合物(330mg，1.3mmol)的1,4‐二氧六環(huán)溶液中，氮氣保護(hù)下油浴加熱至50℃反應(yīng)過夜，hplc監(jiān)測反應(yīng)完畢，向反應(yīng)液中加入甲醇鈉的重水溶液調(diào)堿，用dcm萃取反應(yīng)液，有機相合并用飽和食鹽水洗，柱層析分離得到標(biāo)題化合物269mg；
hrms(esi,[m+h]+)m/z：558.2140；
1h‐nmr(300m，dmso‐d6)：10.164(s,1h),8.663(br,1h),8.291(s,1h),8.089(s,1h),7.753(br,1h),7.538‐7.554(d,1h),7.257‐7.289(t,1h),7.166(br,1h),6.919(s,1h),6.420‐6.474(q,1h),6.246‐6.250(dd,1h),5.754‐5.777(dd,1h),3.779(s,3h),3.548‐3.583(br,4h),3.007‐3.070(br,4h),2.053(s,3h)。
實驗例1：表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)及致癌驅(qū)動基因alk抑制活性。
配制方法：以上樣品均用dmso配成10mm的原液。使用時用培養(yǎng)液配成所需濃度。
細(xì)胞株：nci-h292細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；nci-h3122來自美國nci。用含10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
試劑及儀器：rpmi-1640購自gibcobrl公司；胎牛血清購自gibco公司；多功能酶標(biāo)儀購自biotek公司；srb購自sigma公司。
試驗方法(srb法)：應(yīng)用磺酰羅丹明b蛋白染色法(sulforhodamineb,srb)檢測藥物對腫瘤細(xì)胞增殖生長的抑制作用。主要步驟如下：接種對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的藥物，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對照。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)72小時。細(xì)胞用srb室溫中染色，最后加入tris溶液溶解，酶標(biāo)儀(biotek)510nm波長下測定od值，以下列公式計算細(xì)胞生長抑制率：
抑制率＝(od值對照孔－od值給藥孔)/od值對照孔×100％。
根據(jù)各濃度抑制率，根據(jù)非線性回歸方法計算半數(shù)抑制濃度ic50。
實驗例2：對體外培養(yǎng)人肺腺癌h1975(t790m)細(xì)胞增殖的影響。
細(xì)胞株：h1975細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，用含10％胎牛血清(fbs)的prim1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
試劑及儀器：prim1640購自gibcobrl公司；胎牛血清購自hyclone公司；多功能酶標(biāo)儀購自biotek公司；srb購自sigma公司。
試驗方法(srb法)：應(yīng)用磺酰羅丹明b(sulforhodamineb,srb)蛋白染色法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞增殖生長的抑制作用。主要步驟如下：
接種對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度(1-10000nm)的藥物，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)相應(yīng)濃度的溶媒對照。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％co2條件下培養(yǎng)72小時。細(xì)胞用srb室溫中染色，最后加入tris溶液溶解，酶標(biāo)儀(biotek)510nm波長下測定od值，以下列公式計算細(xì)胞生長抑制率：
抑制率＝(od值對照孔－od值給藥孔)/od值對照孔×100％。
根據(jù)各濃度抑制率，根據(jù)非線性回歸方法計算半數(shù)抑制濃度ic50。