本發(fā)明涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離設(shè)備、系統(tǒng)及方法。
背景技術(shù)：
：循環(huán)腫瘤細(xì)胞（ctc）是從原生癌細(xì)胞組織上脫落下來(lái)進(jìn)入人體外周血液及組織中的循環(huán)癌細(xì)胞，ctc對(duì)于癌癥的早期診斷、治療效果的評(píng)估有極其重要的意義。由于ctc數(shù)量極其稀少，每10ml血液可能僅含幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞,卻有高達(dá)約1億個(gè)白細(xì)胞和500億個(gè)紅細(xì)胞（zhexn，cherml，bonfilrd，am.j.cancerres.2011，1，740-751），在數(shù)量巨大的背景細(xì)胞的干擾下無(wú)法對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞直接檢測(cè)，這種檢測(cè)包括基因突變、表面標(biāo)志物、細(xì)胞活性、分泌蛋白譜以及力學(xué)性質(zhì)等，所以將ctc從外周血中分離出來(lái)成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)前的必須的步驟。在過(guò)去的幾十年間，人們開發(fā)了很多種用以捕獲癌細(xì)胞的技術(shù)，如熒光免疫法、磁性免疫法等。然而，這些技術(shù)所需的儀器昂貴，操作方法復(fù)雜，推廣難度大。因此，開發(fā)高通量、快速分離、操作簡(jiǎn)單的ctc捕獲儀器是非常有意義的。目前從人外周血中分離ctc的方法主要可分為兩類，這兩類方法同時(shí)也代表了從復(fù)雜生物學(xué)樣品中分離稀有細(xì)胞的主要策略。一類方法是基于ctc與血液中其他細(xì)胞物理性質(zhì)的差異，如密度、大小、軟硬程度等的不同實(shí)現(xiàn)ctc與其他細(xì)胞的分離，比如通過(guò)8微米孔徑的過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾去除小于8微米尺寸的白細(xì)胞，但是此類方法具有較高雜細(xì)胞背景，同時(shí)獲取的腫瘤細(xì)胞由于需要重新洗脫導(dǎo)致難以存活并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；另一類方法主要基于ctc與血液中其他細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異，基于循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原，通過(guò)固定在基底表面或磁性顆粒上的針對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的抗體或核算適配體實(shí)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性捕獲并與血液中其他細(xì)胞實(shí)現(xiàn)分離。cellsearch系統(tǒng)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離就是基于這種方法。此類技術(shù)缺陷在于只能捕獲上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞，具有較高假陰性，漏檢其他不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞，入間質(zhì)來(lái)源、干細(xì)胞來(lái)源等腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)通過(guò)將微流控技術(shù)與抗體／適配體捕獲相結(jié)合發(fā)展出了一系列的循環(huán)腫瘤細(xì)胞芯片捕獲技術(shù)，可以保持ctc的活性，為了提高其微通道的捕獲效率，目前的研究重點(diǎn)均集中在微通道表面的形狀上，如微柱陣列芯片（n.engl.j.med.2008,359,366-377）、表面具有周期性凹凸結(jié)構(gòu)“魚骨型”芯片(proc.natl.acad.sci.u.s.a.2010,107,18392-18397)等。但是，此類技術(shù)和系統(tǒng)均存在以下缺陷：1）捕獲的ctc純度較低，存在非特異性吸附，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。2）捕獲的腫瘤細(xì)胞被固定于芯片表面，無(wú)法釋放進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的是提供一種能夠解決以上問(wèn)題的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)捕獲設(shè)備和方法。一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離設(shè)備，由進(jìn)樣裝置、分離裝置、收集裝置和控制裝置組成，所述進(jìn)樣裝置由多個(gè)由蠕動(dòng)泵控制的進(jìn)樣針和攪拌棒組成，用于將檢測(cè)樣品自動(dòng)稀釋并啟動(dòng)樣品多通道同步分離，所述分離裝置由磁鐵模塊（用于分離吸附免疫標(biāo)記磁微粒標(biāo)記的血液白細(xì)胞）和分離器模塊（用于從多細(xì)胞群體中富集分離ctc）組成，所述分離器模塊由多個(gè)單通道微流控芯片組成，所述微流控芯片為螺旋形通道，通道寬度為100~1000微米，高度為50~200微米，長(zhǎng)度為10~100厘米，所述微流控芯片設(shè)置有1個(gè)進(jìn)樣口和2~3個(gè)出樣口，進(jìn)樣口用于將去除白細(xì)胞后的細(xì)胞樣品導(dǎo)入微流控芯片，出樣口用于將經(jīng)分離后的循環(huán)腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞廢液分別導(dǎo)入收集管道和廢液管道，進(jìn)樣口與進(jìn)樣裝置的進(jìn)樣針連通，出樣口分別與循環(huán)腫瘤細(xì)胞管道和細(xì)胞廢液管道連通；所述收集裝置（用于收集經(jīng)分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞懸液）通過(guò)循環(huán)腫瘤細(xì)胞管道與分離裝置連通；所述控制裝置為計(jì)算機(jī)或單片機(jī)，設(shè)置有控制屏和控制板，用于設(shè)置設(shè)備運(yùn)行參數(shù)，包括稀釋液體積、反應(yīng)時(shí)間、進(jìn)樣速度、清洗參數(shù)等。具體的，所述微流控芯片由上層pdms或pmma聚合物芯片和下層的玻片或者硅片載體進(jìn)行封接而成，或者采用pc塑料注塑而成。微流控芯片由芯片通道內(nèi)側(cè)由兩親性聚合物(如peg-pcl,pcl-peg,pcl-pla-peg)通過(guò)疏水作用涂層修飾。該設(shè)備屬于自動(dòng)化進(jìn)樣、高效分離富集ctc系統(tǒng)，所述的設(shè)備和系統(tǒng)能夠一次性處理多個(gè)外周血樣品同步分離，樣品處理體積可達(dá)到20ml，經(jīng)分離后細(xì)胞體積在1ml左右，能夠直接用于細(xì)胞培養(yǎng)、基因提取等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。解決了循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲非特異性和無(wú)法富集捕獲的循環(huán)腫瘤細(xì)胞等技術(shù)瓶頸，本ctc分離設(shè)備和系統(tǒng)對(duì)ctc富集回收效率大于90%，對(duì)白細(xì)胞去除效率大于99.99%以上。本發(fā)明還涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離方法，所述方法包括：（1）待測(cè)血液樣品經(jīng)抗凝處理或紅細(xì)胞裂解處理后，加入樣品管中與抗cd45抗體標(biāo)記的免疫磁微粒預(yù)孵育，得到細(xì)胞懸液；（2）樣品管細(xì)胞懸液中加入稀釋液，攪拌混合15~20分鐘后，啟動(dòng)磁鐵模塊將磁微粒吸附到樣品管壁，抽取樣品管中的樣本液以0.5~5ml/min流速進(jìn)入單通道微流控芯片中進(jìn)行分離；所述微流控芯片為螺旋形通道，通道寬度為100~1000微米，高度為50~200微米，長(zhǎng)度為10~100厘米；（3）于單通道微流控芯片出樣口獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞懸液。具體的，所述步驟（1）為：待測(cè)血液樣品經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，1500rpm離心去除裂解紅細(xì)胞，重新分散于50ml樣品管中，每樣品管內(nèi)加有5ml含有0.5%bsa、2mmedta的pbs，ph7.5，同時(shí)每管加入100μl1mg/ml免疫磁微粒。本發(fā)明主要是通過(guò)免疫磁微粒去除部分外周血中白細(xì)胞背景，通過(guò)非標(biāo)記微流控芯片通道無(wú)創(chuàng)分離富集ctc。通過(guò)免疫磁微粒對(duì)白細(xì)胞去除和微流控芯片物理分離實(shí)現(xiàn)ctc高純度無(wú)創(chuàng)分離，完整保持了ctc活性。如附圖2所示，本發(fā)明所公開的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離儀工作原理為：稀釋液通過(guò)蠕動(dòng)泵吸入到已加有臨床樣品和抗cd45磁珠免疫磁微粒試劑的樣品管中，自動(dòng)攪拌混勻，室溫反應(yīng)15min，啟動(dòng)加磁，在磁場(chǎng)作用下吸附被免疫磁微粒結(jié)合的白細(xì)胞，吸附10min后，在保持磁場(chǎng)作用下，將樣品管中液體導(dǎo)入細(xì)胞分離器，經(jīng)過(guò)分離器內(nèi)在孔道分離作用，將目的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離，進(jìn)入樣品管a、b，其余非循環(huán)腫瘤細(xì)胞則進(jìn)入廢液通道。本發(fā)明研發(fā)了能夠通過(guò)非抗體依賴物理分離ctc的微流控芯片系統(tǒng)，與現(xiàn)有微流控系統(tǒng)相比，具有無(wú)需抗體標(biāo)記、不損傷腫瘤細(xì)胞的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明綜合納米磁微粒去除白細(xì)胞技術(shù)和微流控芯片分離技術(shù)，能夠顯著提高所分離ctc細(xì)胞純度。本發(fā)明提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)：1）非抗體依賴，ctc分離純度高。有效解決現(xiàn)有技術(shù)對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離非特異性。通過(guò)免疫磁微粒去除白細(xì)胞，結(jié)合微流控芯片物理分離腫瘤細(xì)胞。與現(xiàn)有cellsearch捕獲系統(tǒng)僅局限捕獲上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞相比，提高了ctc捕獲范圍，同時(shí)大大提高ctc純度。2）無(wú)創(chuàng)分離，保持ctc活性，由于采用微流控物理分離方式，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ctc高效富集，所獲得的ctc細(xì)胞懸液不需固定于芯片或磁柱上，無(wú)需經(jīng)過(guò)二次洗脫，有效保持了ctc活性。可用于ctc后續(xù)基因檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)、藥敏實(shí)驗(yàn)等。3）系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，高通量進(jìn)樣，自動(dòng)化成都高。4）成本更低，本設(shè)備和系統(tǒng)技術(shù)方案成本更低，結(jié)合后續(xù)細(xì)胞形態(tài)染色，更易于基層醫(yī)療體系市場(chǎng)推廣。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)工作原理圖。圖中清洗a液為外周血樣品稀釋液，清洗b液為設(shè)備保養(yǎng)液，主要為次氯酸鈉成分。圖3為分離出的肺癌ctc細(xì)胞形態(tài)圖；圖4為胰腺癌ctc熒光圖像圖；圖5為分離出的乳腺癌ctc細(xì)胞形態(tài)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：實(shí)施例1：如圖1所示，本發(fā)明提供的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲設(shè)備包括控制模塊（1:控制屏，7：控制板）、進(jìn)樣模塊（2:進(jìn)樣針及攪拌棒）、分離模塊（5:加磁器，3：分離器）、收集模塊（4:樣品收集架）。所述分離器由多個(gè)單通道微流控芯片組成，所述微流控芯片由上層pdms聚合物芯片和下層的硅片載體可逆封接而成，為螺旋形通道，通道寬度為600微米，高度為100微米，長(zhǎng)度為50厘米，微流控芯片內(nèi)壁涂布兩親性聚合物peg-pcl，所述微流控芯片設(shè)置有1個(gè)進(jìn)樣口（和進(jìn)樣針連通）和2個(gè)出樣口（循環(huán)腫瘤細(xì)胞出樣口和廢液出樣口），去除白細(xì)胞后的細(xì)胞樣品由進(jìn)樣口進(jìn)入微流控芯片，分離后的循環(huán)細(xì)胞懸液由循環(huán)細(xì)胞出樣口經(jīng)收集管道輸送至收集架的樣品出口流出，由樣品收集管收集。為了說(shuō)明本系統(tǒng)與現(xiàn)有其它循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離系統(tǒng)性能差異。分別將1x103個(gè)人工培養(yǎng)的egfp表達(dá)的腫瘤細(xì)胞mgc803各分散于健康人全血樣本2ml，分別通過(guò)本專利公開的nextctcctc捕獲儀和cellsearch捕獲系統(tǒng)進(jìn)行ctc分離。熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)分離后的細(xì)胞懸液中mgc803數(shù)量，計(jì)算捕獲率。nextctc捕獲率為81％，大于cellsearch捕獲率60％。為了說(shuō)明本設(shè)備和系統(tǒng)分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞工作過(guò)程，本發(fā)明選擇肺癌確診患者13人，經(jīng)倫理批準(zhǔn)和患者知情同意后，每人抽取外周血3ml，置入edta抗凝管中。循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離過(guò)程：1）、樣品準(zhǔn)備：經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，1500rpm離心后，去除裂解紅細(xì)胞，重新分散于加有5ml含有0.5%bsa、2mmedta的pbs中（ph7.5）的50ml離心管（樣品管）中，同時(shí)加入100μl1mg/ml的抗cd45抗體標(biāo)記的免疫磁微粒（其中cd45抗體購(gòu)自abcam公司，磁珠為自制1mm羧基化水溶性溶液）。2）將樣品管置入設(shè)備nextctc樣品架上，儀器開始運(yùn)行程序1分鐘，控制屏提示輸入病人信息，設(shè)置運(yùn)行參數(shù)后，點(diǎn)擊開始。儀器注入稀釋液，攪拌電機(jī)運(yùn)行，穩(wěn)定10分鐘，磁鐵推送電機(jī)運(yùn)行，將磁珠吸附到樣品管管壁，蠕動(dòng)泵抽取樣本以3ml/min流速經(jīng)分離器流入樣品收集架上的樣品收集管。3）捕獲ctc的鑒定。將樣品收集管收集的ctc細(xì)胞懸液，經(jīng)gimsa-wright染色處理，顯微鏡拍照，鑒定腫瘤細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)采用熒光標(biāo)記的抗panck抗體、抗cd45抗體以及dapi染色，計(jì)數(shù)ck陽(yáng)性、cd45陰性的ctc數(shù)量。表1：13例分離的臨床肺癌患者外周血樣本中捕獲的ctc數(shù)量統(tǒng)計(jì)表對(duì)應(yīng)編號(hào)臨床樣本編號(hào)ctc數(shù)量11290116367182129011616955312901137451941290115989175129011389386129081107h157129062040h188129085516h39129063465h110129085489h1011129084389h＞10012129084767h2313129085414h21圖3為分離出的肺癌ctc細(xì)胞形態(tài)圖，結(jié)果顯示ctc細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核，細(xì)胞膜界線清楚。細(xì)胞直徑尺寸約15微米，明顯大于周圍尺寸小的中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞。表明，本發(fā)明公開的設(shè)備和方法能夠高效富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞。實(shí)施例2:選擇胰腺癌確診患者5人，經(jīng)倫理批準(zhǔn)和患者知情同意后，每人抽取外周血7.5ml，置入edta抗凝管中。循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離過(guò)程：1）、樣品準(zhǔn)備：經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，1700rpm離心后，去除裂解紅細(xì)胞，重新分散于加有5ml含有0.5%bsa、2mmedta的pbs中（ph7.5）的50ml離心管（樣品管）中，同時(shí)加入50ul1mg/ml免疫磁微粒。2）將樣品管置入設(shè)備nextctc樣品架上，儀器開始運(yùn)行程序1分鐘，控制屏提示輸入病人信息，設(shè)置運(yùn)行參數(shù)后，點(diǎn)擊開始。儀器注入稀釋液，攪拌電機(jī)運(yùn)行，穩(wěn)定15分鐘，磁鐵推送電機(jī)運(yùn)行，將磁珠吸附到樣品管管壁，蠕動(dòng)泵抽取樣本以2ml/min流速經(jīng)分離器流入樣品收集架上的樣品收集管。3）捕獲ctc的鑒定。將樣品收集管收集的ctc細(xì)胞懸液，經(jīng)gimsa-wright染色處理，顯微鏡拍照，鑒定腫瘤細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)采用熒光標(biāo)記的抗panck抗體、抗cd45抗體以及dapi染色，計(jì)數(shù)ck陽(yáng)性、cd45陰性的ctc數(shù)量。圖4為胰腺癌ctc熒光圖像圖，結(jié)果顯示ck陽(yáng)性cd45陰性的細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（ctc），dapi陽(yáng)性表明具有完整細(xì)胞核形態(tài)。表明本發(fā)明設(shè)備能夠有效分離胰腺癌ctc。實(shí)施例3:選擇乳腺癌確診患者5人，經(jīng)倫理批準(zhǔn)和患者知情同意后，每人抽取外周血5ml，置入edta抗凝管中。循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離過(guò)程：1）、樣品準(zhǔn)備：經(jīng)紅細(xì)胞裂解處理后，1800rpm離心后，去除裂解紅細(xì)胞，重新分散于加有5ml含有0.5%bsa、2mmedta的pbs中（ph7.5）的50ml離心管（樣品管）中，同時(shí)加入80ul1mg/ml免疫磁微粒。2）將樣品管置入設(shè)備nextctc樣品架上，儀器開始運(yùn)行程序1分鐘，控制屏提示輸入病人信息，設(shè)置運(yùn)行參數(shù)后，點(diǎn)擊開始。儀器注入稀釋液，攪拌電機(jī)運(yùn)行，穩(wěn)定15分鐘，磁鐵推送電機(jī)運(yùn)行，將磁珠吸附到樣品管管壁，蠕動(dòng)泵抽取樣本以2.5ml/min流速經(jīng)分離器流入樣品收集架上的樣品收集管。3）捕獲ctc的鑒定。將樣品收集管收集的ctc細(xì)胞懸液，經(jīng)gimsa-wright染色處理，顯微鏡拍照，鑒定腫瘤細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)采用熒光標(biāo)記的抗panck抗體、抗cd45抗體以及dapi染色，計(jì)數(shù)ck陽(yáng)性、cd45陰性的ctc數(shù)量。圖5為分離出的乳腺癌ctc細(xì)胞形態(tài)圖，結(jié)果顯示所分離出的乳腺癌ctc細(xì)胞形態(tài)明顯區(qū)分于白細(xì)胞，細(xì)胞尺寸明顯大于白細(xì)胞，ctc具有清晰的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。該乳腺癌患者處于臨床一期階段，表明本發(fā)明設(shè)備、系統(tǒng)和方法能夠有效實(shí)現(xiàn)腫瘤早期階段的鑒定和ctc分離。當(dāng)前第1頁(yè)12