關(guān)聯(lián)申請(qǐng)的相互參照本申請(qǐng)主張于2015年1月30日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮樘卦?015-17328的日本專利申請(qǐng)以及于2015年8月7日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮樘卦?015-157444號(hào)的日本專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，并以全文引用的形式在本文中公開。本發(fā)明涉及麥角硫因生產(chǎn)能力被認(rèn)可的菌類和利用該菌類的麥角硫因的制備方法。
背景技術(shù)：
：：下式[ii]：所表示的麥角硫因是一種含硫氨基酸，是已確認(rèn)存在于包括人類在內(nèi)的動(dòng)物肝臟等臟器或血液中的生物物質(zhì)。已知麥角硫因具有抗氧化活性，據(jù)報(bào)道具有例如羥自由基的捕獲作用、來(lái)自鐵或銅依賴性過(guò)氧化氫的羥自由基的生成抑制作用、銅依賴性氧合血紅蛋白的氧化抑制作用、肌紅蛋白和過(guò)氧化氫對(duì)花生四烯酸的氧化抑制作用等。另外，據(jù)報(bào)道麥角硫因還具有彈性蛋白酶活性抑制作用、酪氨酸酶活性抑制作用、抗炎作用、細(xì)胞能量增進(jìn)作用、抗應(yīng)激作用、抗老化作用、皺紋形成抑制作用、脂質(zhì)過(guò)氧化物生成抑制作用等。充分利用作為具有這樣的多種生理活性的功能性生物物質(zhì)和耐熱水溶性物質(zhì)的特征，可期待將麥角硫因應(yīng)用于功能性食品、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、化妝品、藥品、類藥品(quasi-drug)、動(dòng)物飼料等。作為麥角硫因的制備方法，除了從動(dòng)物的臟器或血液中提取的方法以外，還已知從具有麥角硫因生產(chǎn)能力的蕈類(mushrooms)的菌絲體中提取麥角硫因的方法(例如，參照以下專利文獻(xiàn)1和2，該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式在此公開)。另外，在以下非專利文獻(xiàn)1和2(該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式在此公開)中記載了大多數(shù)細(xì)菌沒有麥角硫因生產(chǎn)能力，還記載了在菌類當(dāng)中盡管黑曲霉(aspergillusniger，黑曲霉)或粗糙脈孢菌(neurosporacrassa，粉色面包霉菌)也具有生產(chǎn)麥角硫因的能力，但是釀酒酵母(saccharomycescerevisiae，面包酵母)幾乎沒有生產(chǎn)麥角硫因的能力。另外，還報(bào)道了在具有生產(chǎn)麥角硫因的能力的菌類中麥角硫因的生物合成系統(tǒng)。例如，在以下非專利文獻(xiàn)3和4(該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式在此公開)中記載了粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)的生物合成系統(tǒng)，以下非專利文獻(xiàn)5(該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式在此公開)記載了作為分裂酵母的粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)的生物合成系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特許第4865083號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2：日本特許第5231025號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1：donaldb.melvilleetal,j.biol.chem.1956,223:9-17非專利文獻(xiàn)2：dorothys.genghof,j.bacteriology,aug.1970,p.475-478非專利文獻(xiàn)3：fungalgenetbiol49(2012)160-172非專利文獻(xiàn)4：orglett.2014oct17；16(20):5382-5385非專利文獻(xiàn)5：plosone2014may14；9(5):e97774技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的問(wèn)題專利文獻(xiàn)1和2記載的方法是在培養(yǎng)蕈類的菌絲體之后提取麥角硫因的方法，由于培養(yǎng)蕈類的菌絲體需要熟練和長(zhǎng)期間，因此不適合工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)麥角硫因。從非專利文獻(xiàn)1-5的記載可以獲知，可以利用蕈類以外的一部分菌類來(lái)生物合成麥角硫因。其中，在非專利文獻(xiàn)3中記載了使編碼酶(ncegt-1)的基因(ncu04343)缺失而轉(zhuǎn)化成的轉(zhuǎn)化粗糙脈孢菌，該酶(ncegt-1)催化以下反應(yīng)：將組氨酸的-nh2基甲基化生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽(hercynine)，由該組氨酸三甲基內(nèi)鹽和半胱氨酸生成下列式[i]所示的組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜(hercynylcysteinesulfoxide)。另外，在非專利文獻(xiàn)3和4中，作為能夠?qū)τ山M氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶，記載了ncu04636和ncu11365。進(jìn)而在非專利文獻(xiàn)4中記載了，實(shí)際上從使ncu11365基因超表達(dá)(過(guò)量表達(dá))而轉(zhuǎn)化成的轉(zhuǎn)化大腸桿菌中提取ncu11365，利用該ncu11365通過(guò)試驗(yàn)管內(nèi)(invitro)反應(yīng)可由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因。但是，在非專利文獻(xiàn)3和4中并沒有記載利用使基因ncu04343、ncu04636或ncu11365過(guò)量表達(dá)而轉(zhuǎn)化成的轉(zhuǎn)化體，通過(guò)活體內(nèi)(invivo)反應(yīng)來(lái)生成麥角硫因。另一方面，在非專利文獻(xiàn)5中記載了使編碼相當(dāng)于上述ncegt-1的酶的基因spv+bc1604.01過(guò)量表達(dá)而轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母，利用該轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母體內(nèi)(invivo)合成麥角硫因。但是，在非專利文獻(xiàn)5中記載的利用轉(zhuǎn)化粟酒裂殖酵母所獲得的麥角硫因的量非常少，并且沒有記載使相當(dāng)于上述ncu11365基因的基因過(guò)量表達(dá)而轉(zhuǎn)化成的轉(zhuǎn)化體。因此，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是，提供與專利文獻(xiàn)1和2記載的蕈類菌絲體相比可簡(jiǎn)便、短時(shí)間而高產(chǎn)量地生產(chǎn)麥角硫因，從而能夠以工業(yè)規(guī)模制備麥角硫因的具有麥角硫因生產(chǎn)能力的生物體，以及提供利用該生物體制備高純度麥角硫因含有物的方法。用于解決問(wèn)題的手段本發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題而反復(fù)進(jìn)行了深入研究，最終在一種菌類醬油曲霉(aspergillussojae，醬油麴霉)中，成功地鑒定了編碼對(duì)由組氨酸和半胱氨酸生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的基因asegta，以及編碼對(duì)由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)進(jìn)行催化的酶的基因asegtb和asegtc。接著，本發(fā)明人通過(guò)制作用于過(guò)量表達(dá)分離的各基因的dna構(gòu)建體并將其導(dǎo)入醬油曲霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功地制作了過(guò)量表達(dá)asegta、asegtb或asegtc的轉(zhuǎn)化醬油曲霉；過(guò)量表達(dá)asegta和asegtb的轉(zhuǎn)化醬油曲霉；以及過(guò)量表達(dá)asegta和asegtc的轉(zhuǎn)化醬油曲霉。對(duì)這些轉(zhuǎn)化醬油曲霉進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)后，結(jié)果令人驚訝地發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)asegta的轉(zhuǎn)化株相較于野生株，具有麥角硫因的生產(chǎn)能力提高的趨勢(shì)，而過(guò)量表達(dá)asegtb或asegtc的轉(zhuǎn)化株則沒有發(fā)現(xiàn)這樣的趨勢(shì)。更令人驚訝的是，在這樣事實(shí)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了過(guò)量表達(dá)asegta和asegtb的轉(zhuǎn)化株以及過(guò)量表達(dá)asegta和asegtc的轉(zhuǎn)化株相較于過(guò)量表達(dá)asegta的轉(zhuǎn)化株，具有麥角硫因的生產(chǎn)能力提高的趨勢(shì)。這顯示了過(guò)量表達(dá)參與麥角硫因生物合成系統(tǒng)的兩種基因的轉(zhuǎn)化體累加性地、甚至于協(xié)同性地增強(qiáng)麥角硫因的生產(chǎn)能力。另外，過(guò)量表達(dá)參與麥角硫因生物合成系統(tǒng)的上述一種或者兩種基因的轉(zhuǎn)化株可以按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，其增殖速度等與野生株也無(wú)顯著差異。本發(fā)明是基于這樣的成功例和見解而完成的。由此，根據(jù)本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化絲狀菌，該轉(zhuǎn)化絲狀菌中插入了編碼以下(1)的酶的基因或者編碼以下(1)和(2)的酶的基因，并且過(guò)量表達(dá)該插入的基因。(1)在s-腺苷甲硫氨酸、鐵(ii)和氧的存在下，催化由組氨酸和半胱氨酸生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜的反應(yīng)的酶；(2)將5’-磷酸吡哆醛作為輔酶，催化由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)的酶。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，上述絲狀菌為曲霉屬(aspergillus)微生物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，上述絲狀菌為選自醬油曲霉(aspergillussojae)、米曲霉(aspergillusoryzae)、黑曲霉(aspergillusniger)、溜曲霉(aspergillustamarii)、宇佐美曲霉(aspergillususamii)、白曲霉(aspergilluskawachii)以及齋藤曲霉(aspergillussaitoi)中的曲霉屬微生物。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，上述轉(zhuǎn)化絲狀菌是：編碼上述(1)的酶的基因或者編碼上述(1)和(2)的酶的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得與宿主絲狀菌相比麥角硫因的量增加的轉(zhuǎn)化絲狀菌。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，上述轉(zhuǎn)化絲狀菌是：編碼上述(1)和(2)的酶的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得與編碼上述(1)的酶的基因的表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化絲狀菌相比，麥角硫因的量增加的轉(zhuǎn)化絲狀菌。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，上述轉(zhuǎn)化絲狀菌是：編碼上述(1)的酶的基因或者編碼上述(1)和(2)的酶的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得利用適于宿主絲狀菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基將該轉(zhuǎn)化絲狀菌在30℃下培養(yǎng)3日時(shí)麥角硫因的量為每克質(zhì)量的干燥菌體達(dá)到10.0mg以上的轉(zhuǎn)化絲狀菌。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，編碼上述(1)的酶的基因選自具有序列表中seqidno:1所示的堿基序列的基因、具有序列表中seqidno:23所示的堿基序列的基因、以及具有序列表中seqidno:33所示的堿基序列的基因，或者上述(1)的酶選自具有序列表中seqidno:4所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中seqidno:26所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中seqidno:34所示的氨基酸序列的酶。優(yōu)選地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌中，編碼上述(1)的酶的基因選自具有序列表中seqidno:1所示的堿基序列的基因、具有序列表中seqidno:23所示的堿基序列的基因、以及具有序列表中seqidno:33所示的堿基序列的基因，或者上述(1)的酶選自具有序列表中seqidno:4所示的氨基酸序列的酶、具有序列表中seqidno:26所示的氨基酸序列的酶、以及具有序列表中seqidno:34所示的氨基酸序列的酶。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了一種高純度麥角硫因含有物的制備方法，該制備方法包括：利用適于宿主絲狀菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，從所得的培養(yǎng)物中得到純度為5％以上的麥角硫因含有物的工序。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供一種重組載體，該重組載體包括：選自編碼上述(1)的酶的基因和編碼上述(2)的酶的基因中的至少一種基因、以及異源基因。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供一種組合物，該組合物包含：含有編碼上述(1)的酶的基因和異源基因的重組載體、以及含有編碼上述(2)的酶的基因和異源基因的重組載體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的重組載體和組合物中，編碼上述(1)的酶的基因和編碼上述(2)的酶的基因是來(lái)源于應(yīng)插入上述重組載體的宿主生物的基因，或者是為了在該宿主生物中表達(dá)而進(jìn)行了最優(yōu)化的基因。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了一種轉(zhuǎn)化大腸桿菌，該轉(zhuǎn)化大腸桿菌插入了編碼上述(1)的酶的基因或者編碼上述(1)和(2)的酶的基因，并且過(guò)量表達(dá)該插入的基因。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌或制備方法，能夠通過(guò)常規(guī)培養(yǎng)絲狀菌的條件，制備高含量且高純度的麥角硫因。結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明，與以往的具有麥角硫因生產(chǎn)能力的蕈類或者使用該蕈類制備麥角硫因的方法相比，能夠簡(jiǎn)便地在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)麥角硫因。因此，根據(jù)本發(fā)明可期待以工業(yè)規(guī)模制備麥角硫因。附圖說(shuō)明圖1是表示實(shí)施例記載的轉(zhuǎn)化醬油曲霉和對(duì)照株的麥角硫因產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果的圖，圖中的“egt”表示麥角硫因；圖2是表示從實(shí)施例記載的對(duì)照株和asegta轉(zhuǎn)化株中得到的麥角硫因提取液的高效液相色譜圖(highperformanceliquidchromatography，hplc)；圖3是使用從實(shí)施例記載的轉(zhuǎn)化株和對(duì)照株中提取的全蛋白質(zhì)的sds-page照片；lane1表示來(lái)自對(duì)照株的蛋白質(zhì)、lane2表示來(lái)自asegta轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)、lane3表示來(lái)自asegtb轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)、lane4表示來(lái)自asegtc轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)、lane5表示來(lái)自(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)、lane6表示來(lái)自(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株的蛋白質(zhì)；圖4是表示菌類的麥角硫因生物合成系統(tǒng)的示意圖，圖中“sam”表示s-腺苷甲硫氨酸，“plp”表示5’-磷酸吡哆醛；圖5是表示實(shí)施例記載的轉(zhuǎn)化米曲霉和對(duì)照株的麥角硫因產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果的圖，圖中的“egt”表示麥角硫因；圖6是表示實(shí)施例記載的轉(zhuǎn)化大腸桿菌和對(duì)照株的麥角硫因產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果的圖；圖7是表示實(shí)施例記載的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的培養(yǎng)結(jié)果和對(duì)照株的麥角硫因產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果的圖，圖中的“菌體內(nèi)”表示麥角硫因提取液中的麥角硫因的定量結(jié)果，“菌體外”表示培養(yǎng)上清中的麥角硫因的定量結(jié)果。具體實(shí)施方式以下說(shuō)明本發(fā)明的詳情。(本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的概要)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌插入了編碼以下(1)的酶的基因或者編碼以下(1)和(2)的酶的基因，并且過(guò)量表達(dá)該插入的基因。(1)在s-腺苷甲硫氨酸、鐵(ii)和氧的存在下，催化由組氨酸和半胱氨酸生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜的反應(yīng)的酶；(2)將5’-磷酸吡哆醛作為輔酶，催化由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)的酶。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，通過(guò)過(guò)量表達(dá)作為外源基因而插入的編碼上述(1)和(2)的酶(以下分別稱為酶(1)和酶(2))的基因，從而能夠最終由組氨酸和半胱氨酸生成麥角硫因。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌大致分為兩種形態(tài)：過(guò)量表達(dá)編碼酶(1)的基因，且不過(guò)量表達(dá)編碼酶(2)的基因的轉(zhuǎn)化絲狀菌；以及，過(guò)量表達(dá)編碼酶(1)的基因，且過(guò)量表達(dá)編碼酶(2)的基因的轉(zhuǎn)化絲狀菌。應(yīng)予說(shuō)明，過(guò)量表達(dá)的編碼酶(1)的基因和過(guò)量表達(dá)的編碼酶(2)的基因可以分別是單獨(dú)一種或者兩種以上。菌類所設(shè)想的麥角硫因的生物合成系統(tǒng)示意圖如圖4所示。酶(1)相當(dāng)于圖4中的egta，酶(2)相當(dāng)于圖4中的egtb或者egtc。(酶(1)和酶(2)的酶學(xué)性質(zhì))如圖4所示，酶(1)具有s-腺苷甲硫氨酸(sam)依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，可以sam依賴性地催化將組氨酸轉(zhuǎn)化為-nh2基三甲基化的組氨酸三甲基內(nèi)鹽的反應(yīng)。而且，酶(1)具有硫酸酯酶活性，在鐵(ii)和氧的存在下，可以催化由組氨酸三甲基內(nèi)鹽和半胱氨酸生成下列式[i]：所示的組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜的反應(yīng)。因此，酶(1)因?yàn)榫哂羞@些活性，結(jié)果能夠在s-腺苷甲硫氨酸、鐵(ii)和氧的存在下，由組氨酸和半胱氨酸生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜。酶(2)具有5’-磷酸吡哆醛(plp)結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶活性，能夠?qū)lp作為輔酶，催化由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，通過(guò)表達(dá)編碼酶(1)或編碼酶(1)和酶(2)的基因，在各個(gè)酶的活化條件下，能夠由組氨酸和半胱氨酸生成麥角硫因。(酶(1)和酶(2)的結(jié)構(gòu)特性)酶(1)只要是具有上述酶學(xué)性質(zhì)的酶，即只要是具有在s-腺苷甲硫氨酸、鐵(ii)和氧的存在下，催化由組氨酸和半胱氨酸生成組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜的反應(yīng)的sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶活性和硫酸酯酶活性的酶，則不受限于氨基酸序列、整體或部分的立體結(jié)構(gòu)、分子量等結(jié)構(gòu)特性；最適ph、最適溫度、失活條件等生化學(xué)性質(zhì)；來(lái)源物種等沒有特別限定。但是，酶(1)由于具有sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的活性和硫酸酯酶活性，因此優(yōu)選為含有sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶和硫酸酯酶內(nèi)保存良好的結(jié)構(gòu)域(domain)的酶。作為sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域(conserveddomain)，例如可列舉含有結(jié)構(gòu)域duf2260的sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。另外，作為硫酸酯酶的保守結(jié)構(gòu)域，例如可列舉甲酰甘氨酸生成酶(fge)-硫酸酯酶結(jié)構(gòu)域。但是，上述結(jié)構(gòu)域可以不連結(jié)成一體，例如也可以在結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含非保守結(jié)構(gòu)域。另外，酶(1)優(yōu)選為在sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域和硫酸酯酶的保守結(jié)構(gòu)域之間包含dinb_2結(jié)構(gòu)域，更優(yōu)選為包含含有鐵結(jié)合基序hx3hxe的dinb_2結(jié)構(gòu)域。例如，酶(1)的一形態(tài)具有包含sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域、dinb_2結(jié)構(gòu)域和硫酸酯酶的保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。酶(1)的另一形態(tài)具有包含含有結(jié)構(gòu)域duf2260的sam依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶、含有hx3hxe的dinb_2結(jié)構(gòu)域和fge-硫酸酯酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。酶(1)的優(yōu)選形態(tài)是：具有與非專利文獻(xiàn)3記載的ncegt-1(ncu04343)的氨基酸序列的序列同一性優(yōu)選為30％以上、更優(yōu)選為40％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為45％以上的氨基酸序列。應(yīng)予說(shuō)明，在本說(shuō)明書中“序列同一性”是指將兩個(gè)序列比對(duì)時(shí)序列間的同一性(一致性，identity)，而非序列間的相似性(simirality)。酶(1)的優(yōu)選形態(tài)的具體例子，可列舉登錄號(hào)(括號(hào)內(nèi)的數(shù)值表示以seqidno:4所示的asegta蛋白質(zhì)的氨基酸序列作為查詢序列(query)由blastp所得的序列同一性)分別為：xp_001727309.1(97％)、xp_002375556.1(97％)、xp_001211614.1(74％)、gaa90479.1(75％)、xp_001261027.1(72％)、xp_001275843.1(72％)、edp55069.1(72％)、xp_755900.1(72％)、eha24811.1(74％)、xp_001397117.2(73％)、eye96655.1(72％)、cak42541.1(71％)、xp_680889.1(69％)、eps32723.1(66％)、gad91762.1(63％)、ekv06018.1(63％)、xp_002487159.1(61％)、xp_002145387.1(61％)、cdm31097.1(62％)、xp_002623045.1(57％)、eql36096.1(57％)、eeq91012.1(57％)、xp_002794316.1(57％)、xp_002540839.1(57％)、xp_001246505.1(57％)、xp_003066681.1(56％)、efw18329.1(56％)、eeh06820.1(56％)、xp_003172803.1(55％)、ege82230.1(56％)、egd95426.1(54％)、ezf30391.1(54％)、ehy53149.1(53％)、xp_002844140.1(54％)、xp_003237555.1(54％)、exj78765.1(52％)、xp_001543980.1(53％)、exj84167.1(53％)、exj76804.1(51％)、eti21425.1(52％)、exj55868.1(52％)、ekg13377.1(51％)、xp_003836988.1(51％)、eon60831.1(50％)、ege08446.1(52％)、emd86163.1(51％)、eun21814.1(51％)、emd69895.1(50％)、eme40669.1(52％)、euc45427.1(51％)、eeh18365.1(52％)、xp_001939537.1(51％)、euc28327.1(50％)、xp_003296645.1(50％)、eer38486.1(54％)、xp_007587632.1(50％)、eoa87110.1(50％)、eeh47303.1(54％)、emc91772.1(51％)、ejt79063.1(50％)、xp_007289878.1(51％)、emf09308.1(50％)、xp_007274188.1(49％)、xp_003849540.1(51％)、enh83409.1(50％)、eqb47754.1(48％)、xp_006693510.1(51％)、etn41916.1(50％)、xp_003711933.1(49％)、ewg46299.1(50％)、egu87412.1(49％)、esz95365.1(48％)、egc47631.1(52％)、exm31381.1(49％)、exl83373.1(49％)、xp_385823.1(50％)、emt70054.1(50％)、exk95313.1(49％)、cct71860.1(50％)、exm04867.1(49％)、exa38531.1(49％)、ewz34577.1(49％)、ewy87102.1(49％)、enh70585.1(49％)、eyb29661.1(50％)、exk37219.1(49％)、ewz95323.1(49％)、egy20613.1(49％)、eme78671.1(50％)、ekj73623.1(50％)、efq30701.1(48％)、epe09977.1(48％)、exv06624.1(49％)、ers99852.1(49％)、ego59462.1(49％)、xp_003348780.1(48％)、efy99927.1(49％)、xp_007594915.1(47％)、xp_003660752.1(49％)、eaa27088.3(49％)、erf68279.1(49％)、efx04429.1(50％)、etr98676.1(49％)、efy84340.1(48％)、xp_006968620.1(48％)、xp_003048884.1(49％)、ehk20832.1(49％)、epe24413.1(49％)、ejp62962.1(49％)、ets83740.1(48％)、ehk45989.1(49％)、elq64904.1(47％)、xp_006672555.1(48％)、elq40007.1(46％)、exl83375.1(50％)、exk95315.1(50％)、cce33591.1(48％)、exm04869.1(51％)、exa38533.1(50％)、ewz95325.1(50％)、exk37221.1(50％)、ewz34579.1(50％)、ewy87104.1(50％)、ccx31754.1(47％)、xp_956324.2(46％)和xp_956324.2(46％)的蛋白質(zhì)，但并不限于此。其中，例如登錄號(hào)為xp_001727309.1(97％)的蛋白質(zhì)是具有seqidno:26所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。另外，登錄號(hào)為xp_001397117.2(73％)的蛋白質(zhì)是具有seqidno:34所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。由此，具有與asegta蛋白質(zhì)的氨基酸序列的序列同一性為40％以上、優(yōu)選為50％以上、更優(yōu)選為70％以上的氨基酸序列的甲基轉(zhuǎn)移酶，或者具有被推定為甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，putative)的氨基酸序列或被視為甲基轉(zhuǎn)移酶的假定蛋白質(zhì)(hypotheticalprotein)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，可以作為酶(1)而使用。酶(2)也同樣只要是具有上述酶學(xué)性質(zhì)的酶，即只要是具有以5’-磷酸吡哆醛(plp)作為輔酶，催化由組氨酸三甲基內(nèi)鹽基半胱氨酸亞砜生成麥角硫因的反應(yīng)的plp結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶活性的酶，則不受限于結(jié)構(gòu)特性、生化學(xué)性質(zhì)和來(lái)源物種等。但是，酶(2)由于具有plp結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶活性，因此優(yōu)選包含plp結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶的保守結(jié)構(gòu)域(domain)。作為酶(2)在結(jié)構(gòu)上至少可為以下兩個(gè)種類：含有與非專利文獻(xiàn)3記載的ncu04636的序列同一性為75％左右的plp結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)；以及含有與非專利文獻(xiàn)4記載的ncu11365的序列同一性為44％左右的plp結(jié)合型半胱氨酸脫硫酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。酶(2)既可以是這兩種酶中的任一種，也可以是這兩種酶。(酶(1)和(2)的氨基酸序列)酶(1)和(2)只要是具有上述酶學(xué)性質(zhì)、優(yōu)選具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶，則對(duì)于氨基酸序列沒有特別限定。例如作為具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶(1)的一形態(tài)有seqidno:4所示的氨基酸序列，作為具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶(2)的一形態(tài)有seqidno:5和seqidno:6所示的氨基酸序列。具有seqidno:4-6所示的氨基酸序列的酶全部來(lái)源于醬油曲霉(aspergillussojae)，本發(fā)明人將其分別命名為asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)。另外，編碼這些酶的基因的堿基序列為seqidno:1-3所示的堿基序列。同樣地，作為具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶(1)的一形態(tài)，有seqidno:26和seqidno:34所示的氨基酸序列。具有seqidno:26和seqidno:34所示的氨基酸序列的酶，分別來(lái)源于米曲霉(aspergillusoryzae)和黑曲霉(aspergillusniger)，本發(fā)明人將其分別命名為aoegta蛋白質(zhì)和anegta蛋白質(zhì)。另外，編碼這些酶的基因的堿基序列分別為seqidno:23和seqidno:33所示的堿基序列。另外，作為具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶(2)的一形態(tài)，有seqidno:27和seqidno:28所示的氨基酸序列。由于具有seqidno:27和seqidno:28所示的氨基酸序列的酶分別來(lái)源于米曲霉，本發(fā)明人等將其分別命名為aoegtb蛋白質(zhì)和aoegtc蛋白質(zhì)。另外，編碼該酶的基因的堿基序列分別為seqidno:24和seqidno:25所示的堿基序列。asegta、asegtb和asegtc是由編碼存在于醬油曲霉的染色體dna上的這些酶的基因所編碼的蛋白質(zhì)。另外，aoegta、aoegtb和aoegtc是由編碼存在于米曲霉的染色體dna上的這些酶的基因所編碼的蛋白質(zhì)。而且，anegta是由編碼存在于黑曲霉的染色體dna上的這些酶的基因所編碼的蛋白質(zhì)。在本說(shuō)明書中有時(shí)會(huì)將這樣的存在于生物源性染色體dna上的基因和由該基因編碼的蛋白質(zhì)或酶分別稱為“野生型基因”，以及“野生型蛋白質(zhì)”或“野生型酶”。酶(1)和(2)的氨基酸序列只要分別具有上述酶(1)和(2)的酶學(xué)性質(zhì)，則也可以包含在野生型酶所具有的氨基酸序列中有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸缺失、置換、添加等的氨基酸序列。此處，氨基酸序列的“一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、置換、添加”中的“一個(gè)至數(shù)個(gè)”的范圍沒有特別限定，例如是指1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)，優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)左右，更優(yōu)選為1、2、3、4或5個(gè)左右。另外，“氨基酸的缺失”是指序列中的氨基酸殘基的脫落或消失，“氨基酸的置換”是指序列中的氨基酸殘基被替換為別的氨基酸殘基，“氨基酸的添加”是序列中插入而添加新的氨基酸殘基。作為“一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸的缺失、置換、添加”的具體形態(tài)，有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸被置換為其他的化學(xué)性相似的氨基酸的形態(tài)。例如，可列舉將某疏水性氨基酸置換為其他疏水性氨基酸的情況，將某極性氨基酸替換為具有相同電荷的其他極性氨基酸的情況等。像這樣化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸，每個(gè)氨基酸在其
技術(shù)領(lǐng)域：
：均已知。列舉具體的例子，作為非極性(疏水性)氨基酸可列舉出丙氨酸、纈胺酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可列舉出甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸等。作為帶正電荷的堿性氨基酸，可列舉精氨酸、組氨酸或賴氨酸等。另外，作為帶負(fù)電荷的酸性氨基酸，可列舉天冬氨酸或谷氨酸等。作為在野生型酶所具有的氨基酸序列中有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸缺失、置換、添加等的氨基酸序列，可列舉與野生型酶所具有的氨基酸序列具有一定以上的序列同一性的氨基酸序列，例如可列舉與野生型酶所具有的氨基酸序列具有80％以上的序列同一性、優(yōu)選為85％以上的序列同一性，更優(yōu)選為90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列同一性，進(jìn)一步優(yōu)選為具有99.5％以上的序列同一性的氨基酸序列。(編碼酶(1)和(2)的氨基酸序列)編碼酶(1)和(2)的基因只要含有編碼具有上述酶學(xué)性質(zhì)、優(yōu)選具有上述酶學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特性的酶(1)和(2)所具有的氨基酸序列的堿基序列，則沒有特別限定。通過(guò)編碼酶(1)和(2)的基因在轉(zhuǎn)化絲狀菌內(nèi)過(guò)量表達(dá)，從而生產(chǎn)酶(1)和(2)。在本說(shuō)明書中“基因的表達(dá)”是指通過(guò)轉(zhuǎn)錄或翻譯等，以具有本來(lái)的催化劑活性的形態(tài)生產(chǎn)基因所編譯的酶。另外，在本說(shuō)明書中的“基因的過(guò)量表達(dá)”是指通過(guò)插入基因，使得宿主生物超過(guò)本來(lái)的表達(dá)量，生產(chǎn)該基因所編碼的蛋白質(zhì)(酶)。編碼酶(1)和(2)的基因既可以是在被導(dǎo)入宿主生物之際，能夠在該基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)由剪接(splicing)而生成酶(1)和(2)的基因，也可以是能夠在該基因轉(zhuǎn)錄后不經(jīng)由剪接(splicing)而生成酶(1)和(2)的基因，可以是二者中的任意一者。編碼酶(1)和(2)的基因可以與來(lái)源生物原本所具有的基因(即野生型基因)不完全相同，只要是至少編碼具有上述酶學(xué)性質(zhì)的酶的基因，也可以是具有與野生型基因的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列在嚴(yán)格條件(stringentconditions)下雜交的堿基序列的dna。本說(shuō)明書中“在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列”是指，將含有野生型基因的堿基序列的dna用作探針，通過(guò)利用菌落雜交法、噬菌斑雜交法、southern印跡雜交(southernblothybridization)法等所獲得的dna堿基序列。在本說(shuō)明書中的“嚴(yán)格條件”是指，可明確識(shí)別特異性雜交信號(hào)和非特異性雜交信號(hào)的條件，根據(jù)所用的雜交系統(tǒng)、以及探針的種類、序列和長(zhǎng)度而不同。這樣的條件可以通過(guò)改變雜交的溫度、清洗的溫度和鹽濃度來(lái)決定。例如，在連非特異性雜交信號(hào)都強(qiáng)烈地檢測(cè)出的情況下，可以通過(guò)在提高雜交和清洗的溫度的同時(shí)，根據(jù)需要降低清洗時(shí)的鹽濃度，以提高特異性。另外，在連特異性雜交信號(hào)都檢測(cè)不出的情況下，可以通過(guò)在降低雜交和清洗的溫度的同時(shí)，根據(jù)需要提高清洗時(shí)的鹽濃度，使雜交穩(wěn)定化。作為嚴(yán)格條件的具體例子，例如使用dna探針作為探針，雜交使用5×ssc、1.0％(w/v)核酸雜交用封閉試劑(blockingreagent)(德國(guó)寶靈曼公司)、0.1％(w/v)n-月桂酰肌氨酸、0.02％(w/v)sds，進(jìn)行一夜(8-16小時(shí)左右)。使用0.1-0.5×ssc、0.1％(w/v)sds、優(yōu)選使用0.1×ssc、0.1％(w/v)sds，清洗兩次每次15分鐘。進(jìn)行雜交和清洗的溫度為65℃以上，優(yōu)選為68℃以上。另外，作為具有在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的dna，可列舉例如使用將具有來(lái)自菌落或噬菌斑的野生型基因的堿基序列的dna或者該dna片段固定化的過(guò)濾器，通過(guò)在上述嚴(yán)格條件下雜交而得到的dna；或在0.5-2.0m的nacl的存在下以40-75℃實(shí)施雜交后，優(yōu)選在0.7-1.0m的nacl的存在下以65℃實(shí)施雜交后，能夠通過(guò)使用0.1-1×ssc溶液(1×ssc溶液為150mm氯化鈉、15mm檸檬酸鈉)在65℃的條件下清洗過(guò)濾器而鑒定的dna等。探針的制作或雜交的方法可以按照以下文獻(xiàn)記載的方法實(shí)施：molecularcloning：alaboratorymanual，2nd-ed.，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny.，1989、currentprotocolsinmolecularbiology，supplement1-38，johnwiley&sons，1987-1997(以下將這些文獻(xiàn)稱為參考技術(shù)文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容以引用的方式在此公開)。應(yīng)予說(shuō)明，除了以上緩沖液的鹽濃度或溫度等條件以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以對(duì)探針濃度、探針長(zhǎng)度、反應(yīng)時(shí)間等各種條件加以考慮，適當(dāng)設(shè)定用于獲得具有與野生型基因的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列和在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的dna的條件。作為具有在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的dna，可列舉與用作探針的含有野生型基因的堿基序列的dna的堿基序列具有一定以上的序列同一性的dna。例如，與野生型基因的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選為85％以上、更優(yōu)選為90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為99.5％以上的序列同一性的dna。作為與野生型基因的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列，包括例如在野生型基因的堿基序列中有一個(gè)至數(shù)個(gè)、優(yōu)選為1-50個(gè)、更優(yōu)選為從1-30個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1-20個(gè)、再進(jìn)一步優(yōu)選為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)堿基缺失、置換、添加等的堿基序列。在此，“堿基的缺失”是指序列中的堿基有脫落或消失，“堿基的置換”是指序列中的堿基被替換為別的堿基，“堿基的添加”是指插入而添加新的堿基。由與野生型基因的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列所編碼的酶，可能具有在由野生型基因的堿基序列編碼的酶所具有的氨基酸序列中有一個(gè)至數(shù)個(gè)氨基酸缺失、置換、添加等的氨基序列，但是具有與由野生型基因所編碼的酶相同的酶活性。(用于計(jì)算序列同一性的手段)獲取堿基序列或氨基酸序列的序列同一性的方法沒有特別限制，例如可以利用常規(guī)方法，將野生型基因或由野生型基因編碼的酶的氨基酸序列與目標(biāo)堿基序列或氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，通過(guò)使用用于計(jì)算兩個(gè)序列的一致率的程序來(lái)求得。作為用于計(jì)算兩個(gè)氨基酸序列或堿基序列的一致率的程序，例如，已知karlin和altschul的算法(proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268、1990；proc.natl.acad.sci.usa90：5873-5877、1993)，使用該算法的blast程序由altschul等開發(fā)(j.mol.biol.215：403－410、1990)。而且，還已知了靈敏度比blast更好的確定序列同一性的程序gappedblast(nucleicacidsres.25：3389-3402,1997)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員例如可以利用上述程序，針對(duì)所提供的序列從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索表現(xiàn)出高序列同一性的序列。這些程序，例如可以在美國(guó)nationalcenterforbiotechnologyinformation的網(wǎng)頁(yè)(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中使用。上述各方法通?？梢杂糜趶臄?shù)據(jù)庫(kù)中檢索表現(xiàn)出序列同一性的序列，但是作為確定個(gè)別序列的序列同一性的手段，也可以使用genetyx網(wǎng)絡(luò)版version12.0.1(genetyx公司)的同源性分析。該方法基于lipman-pearson法(science227：1435-1441，1985)。分析堿基的序列同一性時(shí)，盡可能使用編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域(cds或orf)。(編碼酶(1)和(2)的基因的來(lái)源)編碼酶(1)和(2)的基因例如來(lái)源于具有麥角硫因生產(chǎn)能力的物種或者出現(xiàn)酶(1)和(2)的表達(dá)物種等。作為編碼酶(1)和酶(2)的基因的來(lái)源生物，例如可列舉微生物。由于在微生物當(dāng)中，絲狀菌的很多菌種已知具有麥角硫因生產(chǎn)能力，因此優(yōu)選絲狀菌。作為絲狀菌的具體例，可列舉曲霉(aspergillus)屬絲狀菌，更具體地可列舉醬油曲霉(aspergillussojae)、米曲霉(aspergillusoryzae)、黑曲霉(aspergillusniger)、溜曲霉(aspergillustamarii)、宇佐美曲霉(aspergillususamii)、白曲霉(aspergilluskawachii)以及齋藤曲霉(aspergillussaitoi)等。作為上述曲霉屬絲狀菌的具體例而列舉的醬油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉以及齋藤曲霉在味噌、醬油、日本酒和燒酒等釀造食品的制造，檸檬酸制造，淀粉酶等酶制劑制造中的使用實(shí)際成果豐碩，酶生產(chǎn)性高，長(zhǎng)年使用的安全可靠性高，因此是可以工業(yè)應(yīng)用的微生物。如上所述，編碼酶(1)和(2)的基因的來(lái)源生物沒有特別限定，但是在轉(zhuǎn)化絲狀菌中表達(dá)的酶(1)和(2)有可能不因宿主絲狀菌的生長(zhǎng)條件而失活，或者表現(xiàn)各自的活性。因此，編碼酶(1)和(2)的基因的來(lái)源生物優(yōu)選為，通過(guò)插入編碼酶(1)和(2)的基因而應(yīng)轉(zhuǎn)化的宿主絲狀菌或者生長(zhǎng)條件與宿主絲狀菌的近似的絲狀菌。(由基因工程方法克隆編碼酶(1)和(2)的基因)編碼酶(1)和(2)的基因能夠插入適當(dāng)?shù)墓母鞣N載體中。而且，將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)墓拗魃?，能夠制作被?dǎo)入了含有編碼酶(1)和(2)的基因的重組載體(重組dna)的轉(zhuǎn)化體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇編碼酶(1)和(2)的基因的取得方法，或者編碼酶(1)和(2)的基因序列、編碼酶(1)和(2)的氨基酸序列信息的取得方法，各種載體的制備方法或轉(zhuǎn)化體的制作方法等。另外，在本說(shuō)明書中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化體中分別包含了轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)導(dǎo)子。以下對(duì)編碼酶(1)和(2)的基因的克隆的一例進(jìn)行非限制性說(shuō)明。為了克隆編碼酶(1)和(2)的基因，可以適當(dāng)使用常規(guī)使用的基因克隆方法。例如，可以從具有酶(1)和(2)的生產(chǎn)能力的微生物或各種細(xì)胞中，利用常規(guī)方法，例如利用記載在參考技術(shù)文獻(xiàn)內(nèi)的方法，提取染色體dna或mrna?？梢詫⑻崛〉膍rna作為模板合成cdna。利用像這樣得到的染色體dna或cdna，可以制作染色體dna或cdna的文庫(kù)。例如編碼酶(1)和(2)的基因可以通過(guò)將具有該基于的微生物源性染色體dna或cdna作為模板進(jìn)行克隆而得到。編碼酶(1)和(2)的基因的來(lái)源生物如上所述，作為具體的例子，可列舉醬油曲霉nbrc4239株、米曲霉rib40株、黑曲霉iam2533株等，但并不限于此。例如，培養(yǎng)醬油曲霉nbrc4239株，從所得的菌體中除去水分，在液氮中冷卻的同時(shí)利用乳缽等物理磨碎，從而制成微細(xì)的粉末狀菌體片，利用常法從該菌體片中提取染色體dna組分。染色體dna的提取操作可以利用dneasyplantminikit(qiagen公司)等市售的染色體dna提取試劑盒。接下來(lái)，將上述染色體dna作為模板，利用與5'末端序列和3'末端序列互補(bǔ)的合成引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(以下記為“pcr”)，從而擴(kuò)增dna。作為引物，只要能夠擴(kuò)增含有該基因的dna片段，則沒有特別限定。作為其例，可列舉參考醬油曲霉的基因組序列而設(shè)計(jì)的由seqidno:17-22所表示的引物等。應(yīng)予說(shuō)明，由于若使用這些引物則會(huì)擴(kuò)增目標(biāo)基因的全長(zhǎng)，因此可以省略race。作為其他方法，可以通過(guò)5'race或3'race等適當(dāng)?shù)膒rc，擴(kuò)增含有目標(biāo)基因片段的dna，使其連接得到含有全長(zhǎng)的目標(biāo)基因的dna。另外，取得編碼酶(1)和(2)的基因的方法沒有特別限定，即便不采用基因工程的方法，也可以利用例如化學(xué)合成法構(gòu)建編碼酶(1)和(2)的基因。通過(guò)pcr擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物或化學(xué)合成的基因中的堿基序列的確認(rèn)，例如可如下進(jìn)行。首先，將欲確認(rèn)序列的dna按照常法插入適當(dāng)?shù)妮d體中，制作重組dna。對(duì)于載體的克隆，可使用tacloningkit(invitrogen公司)等市售的試劑盒；puc119(寶生物工程公司)、puc18(寶生物工程公司)、pbr322(寶生物工程公司)、pbluescriptsk+(stratagene公司)、pyes2/ct(invitrogen公司)等市售的質(zhì)粒載體dna；λembl3(stratagene公司)等市售的噬菌體載體dna。使用該重組dna，對(duì)宿主生物，例如大腸桿菌(escherichiacoli)、優(yōu)選為大腸桿菌jm109株(寶生物工程公司)或大腸桿菌dh5α(寶生物工程公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。利用qiagenplasmidminikit(qiagen公司)等對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體所含的的重組dna進(jìn)行純化。通過(guò)雙脫氧序列分析法(methodsinenzymology、101、20-78、1983)等確定插入該轉(zhuǎn)化體dna中的各基因的堿基序列。確定堿基序列時(shí)使用的序列分析裝置沒有特別限定，例如可列舉li-cormodel4200l測(cè)序儀(aloka公司)、370dna測(cè)序系統(tǒng)(perkinelmer公司)、ceq2000xldna分析系統(tǒng)(beckman公司)等。然后，可以基于所確定的堿基序列獲知翻譯的蛋白質(zhì)，即酶(1)和(2)的氨基酸序列。(含有編碼酶(1)和(2)的基因的重組載體的構(gòu)建)含有編碼酶(1)和(2)的基因的重組載體(重組體dna)可以通過(guò)將含有編碼酶(1)和(2)的任一基因的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和各種載體以能夠表達(dá)編碼酶(1)和(2)的基因的形式結(jié)合來(lái)構(gòu)建。例如，通過(guò)利用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈芯幋a酶(1)和(2)的任一基因的dna片段，將該dna片段與利用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗟馁|(zhì)粒連接來(lái)構(gòu)建。另外，可以通過(guò)利用in-fusionhdcloningkit(clontech公司)等市售的重組載體制作試劑盒，將含有在兩個(gè)末端附著有與質(zhì)粒相同的序列的該基因的dna片段與來(lái)源于由反向pcr擴(kuò)增后的質(zhì)粒的dna片段連接而得到。作為本發(fā)明的又一形態(tài)，可列舉含有編碼酶(1)的基因的重組載體，含有編碼酶(2)的基因的重組載體，以及含有編碼酶(1)的基因和編碼酶(2)的基因的重組載體。本發(fā)明的重組載體用于制作本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為含有異源基因或異源核酸序列。異源基因只要是原本不存在于(notnaturallyoccuring)宿主生物中的基因，則沒有特別限定，例如，可列舉不依賴來(lái)源于宿主生物的核酸序列的合成基因，來(lái)自與編碼酶(1)的基因的來(lái)源生物不同的生物的基因，來(lái)自與宿主生物不同的其他的絲狀菌或微生物、植物、動(dòng)物、病毒等生物的基因等。作為宿主生物為絲狀菌的情況下的異源基因的具體例可以列舉來(lái)自puc19的dna片段等，但是并不限于此。作為本發(fā)明的重組載體的具體例，可列舉由來(lái)自puc19的dna片段、來(lái)自ptef的dna片段、來(lái)自asegta和/或asegtc的dna片段、來(lái)自talp的dna片段、來(lái)自pyrg的dna片段、以及來(lái)自puc19的dna片段連接而成的重組載體(轉(zhuǎn)化絲狀菌的制作方法)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的制作方法沒有特別限定，例如可列舉按照常規(guī)方法，編碼酶(1)和(2)的基因以表達(dá)的方式插入宿主絲狀菌的方法。具體而言，將編碼酶(1)和(2)的任一基因插入誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子和終止子之間制作dna構(gòu)建體，然后通過(guò)僅用含有編碼酶(1)的基因的dna構(gòu)建體對(duì)宿主絲狀菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，或者通過(guò)用含有編碼酶(1)的基因的dna構(gòu)建體和含有編碼酶(2)的基因的dna構(gòu)建體的對(duì)宿主絲狀菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而得到僅過(guò)量表達(dá)編碼酶(1)的基因的轉(zhuǎn)化絲狀菌，或者過(guò)量表達(dá)編碼酶(1)和(2)的基因的轉(zhuǎn)化絲狀菌。在本說(shuō)明書中，將為了轉(zhuǎn)化宿主絲狀菌而制作的、由誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子-編碼酶(1)或(2)的基因-終止子構(gòu)成的dna片段以及含有該dna片段的重組載體統(tǒng)稱為dna構(gòu)建體(dnaconstruct)。編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因以表達(dá)的方式插入宿主絲狀菌中的方法沒有特別限定，例如可列舉通過(guò)利用同源重組而直接插入至宿主生物的染色體上的方法、通過(guò)連接至質(zhì)粒載體上而導(dǎo)入宿主絲狀菌內(nèi)的方法。在利用同源重組的方法中，可以將dna構(gòu)建體連接在與染色體上重組部位的上游區(qū)及下游區(qū)相同的序列之間，插入宿主絲狀菌的基因組中。通過(guò)在dna構(gòu)建體自身的高表達(dá)啟動(dòng)子的控制下在宿主絲狀菌內(nèi)過(guò)量表達(dá)，可以得到自克隆的轉(zhuǎn)化體。高表達(dá)啟動(dòng)子沒有特別限定，例如可列舉翻譯延伸因子tef1基因(tef1)的啟動(dòng)子區(qū)、α-淀粉酶基因(amy)的啟動(dòng)子區(qū)、堿性蛋白酶基因(alp)啟動(dòng)子區(qū)等。在利用載體的方法中，可以利用常規(guī)方法將dna構(gòu)建體整合到用于絲狀菌的轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體中，利用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化對(duì)應(yīng)的宿主絲狀菌。作為這樣適宜的載體-宿主系統(tǒng)只要是可在宿主絲狀菌中生產(chǎn)酶(1)、或者酶(1)和(2)的系統(tǒng)，則沒有特別限定，例如可列舉puc19和絲狀菌系統(tǒng)、psta14(mo1.gen.genet.218、99-104、1989)和絲狀菌系統(tǒng)等。dna構(gòu)建體優(yōu)選導(dǎo)入宿主絲狀菌的染色體中使用，但是作為其他的方法，也可以通過(guò)向自我復(fù)制型載體(ozekietal.biosci.biotechnol.biochem.59，1133(1995))中整合dna構(gòu)建體，以不導(dǎo)入染色體中的形式使用。在dna構(gòu)建體中也可以含有能夠選擇被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記基因。對(duì)于標(biāo)記基因沒有特別限定，例如可列舉像pyrg、niad、adea這樣的與宿主的營(yíng)養(yǎng)需求性互補(bǔ)的基因、對(duì)吡啶硫胺、潮霉素b寡霉素等藥物具有抗藥性的基因等。另外，dna構(gòu)建體優(yōu)選含有啟動(dòng)子、終止子以外的控制序列(例如增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化序列等)，該控制序列可在宿主細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因。對(duì)于啟動(dòng)子沒有特別限定，可列舉適宜的誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，例如tef1啟動(dòng)子、alp啟動(dòng)子、amy啟動(dòng)子等。對(duì)于終止子也沒有特別限定，例如可列舉alp終止子、amy終止子、tef1終止子等。在dna構(gòu)建體中，當(dāng)含有插入的編碼酶(1)或(2)的基因的dna片段包含具有表達(dá)控制功能的序列時(shí)，編碼酶(1)或(2)的基因的表達(dá)控制序列不是必須的。另外，通過(guò)共轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化的情況下，dna構(gòu)建體有時(shí)可以不含標(biāo)記基因。在dna構(gòu)建體中可以加上用于純化的標(biāo)簽。例如，通過(guò)將適宜的接頭序列連接至編碼酶(1)或(2)的基因的上游或下游，將編碼組氨酸的氨基序列連接6密碼子以上，能夠利用鎳柱進(jìn)行純化。dna構(gòu)建體的一實(shí)施方式，例如是將tef1基因啟動(dòng)子、編碼酶(1)或(2)的基因、alp基因的終止子以及pyrg標(biāo)記基因連接在位于puc19的多克隆位點(diǎn)上的in-fusion克隆位點(diǎn)處的dna構(gòu)建體。向絲狀菌的轉(zhuǎn)化方法，可以適當(dāng)選擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法。例如，可以使用在制備宿主絲狀菌的原生質(zhì)體后，利用聚乙二醇和氯化鈉的原生質(zhì)體peg法(例如，參照mo1.gen.genet.218、99-104、1989、日本特開2007-222055號(hào)公報(bào)等)。用于使轉(zhuǎn)化絲狀菌再生的培養(yǎng)基，可以根據(jù)所用的宿主絲狀菌和轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因而使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基。例如，在使用醬油曲霉作為宿主絲狀菌、使用pyrg基因作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因的情況下，轉(zhuǎn)化絲狀菌的再生，例如可利用含有0.5％瓊脂和1.2m山梨糖醇的czapek-dox基本培養(yǎng)基(difco公司)來(lái)進(jìn)行。另外，例如為了得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，也可以利用同源重組，將宿主絲狀菌的染色體上原本所具有的編碼酶(1)和(2)的基因的啟動(dòng)子置換成tef1等高表達(dá)啟動(dòng)子。此時(shí)，優(yōu)選除了高表達(dá)啟動(dòng)子，還插入pyrg等轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因。例如，為了該目的，參照日本特開2011-230681記載的實(shí)施例1或圖1，可以利用編碼酶(1)或(2)的基因的上游區(qū)-轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因-高表達(dá)啟動(dòng)子-編碼酶(1)或(2)的全部或部分基因所組成的轉(zhuǎn)化盒。在此情況下，編碼酶(1)或(2)的基因的上游區(qū)和編碼酶(1)或(2)的全部或部分基因被用于同源重組。編碼酶(1)或(2)的全部或部分基因可以使用包含從起始密碼子到中間區(qū)域的部分。適用于同源重組的區(qū)域的長(zhǎng)度優(yōu)選為0.5kb以上。可以通過(guò)在可確認(rèn)酶(1)、或者酶(1)和(2)的酶活性的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，然后確認(rèn)培養(yǎng)后所得培養(yǎng)物中麥角硫因的量是否大于相同環(huán)境下培養(yǎng)的宿主絲狀菌的培養(yǎng)物中麥角硫因的量，從而確認(rèn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌已制成。另外，還可以通過(guò)從轉(zhuǎn)化絲狀菌提取染色體dna，以其為模板進(jìn)行pcr，確認(rèn)當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)是否生成可擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物，從而確認(rèn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌已制成。例如，以使用的啟動(dòng)子的堿基序列對(duì)應(yīng)的正向引物、轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因的堿基序列對(duì)應(yīng)的反向引物的組合進(jìn)行pcr，確認(rèn)是否生成設(shè)想長(zhǎng)度的產(chǎn)物。在通過(guò)同源重組來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的情況下，優(yōu)選以位于比使用的上游側(cè)同源區(qū)更接近上游的正向引物和比使用的下游側(cè)同源區(qū)更接近下游的反向引物的組合來(lái)進(jìn)行pcr，確認(rèn)在發(fā)生同源重組時(shí)是否生成設(shè)想長(zhǎng)度的產(chǎn)物。(宿主絲狀菌)作為宿主絲狀菌，只要是能夠通過(guò)含有編碼酶(1)的基因的dna構(gòu)建體、或者含有編碼酶(1)的基因的dna構(gòu)建體和含有編碼酶(2)的基因的dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)酶(1)、或者酶(1)和(2)的絲狀菌，則沒有特別限定，例如，優(yōu)選為已確認(rèn)生產(chǎn)麥角硫因的絲狀菌、或者在基因組dna上具有編碼酶(1)和(2)的基因的絲狀菌。作為宿主絲狀菌的具體例，可列舉非專利文獻(xiàn)1和2記載的絲狀菌，例如可列舉屬于曲霉屬、脈孢菌(neurospora)屬、青霉(penicillium)屬、鐮刀菌(fusarium)屬、木霉(trichoderma)屬、毛霉(mucor)屬、根霉(rhizopus)屬等的絲狀菌。作為在基因組dna上具有編碼酶(1)和(2)的基因的絲狀菌，例如可列舉屬于新薩托菌(neosartorya)屬、絲衣霉(byssochlamys)屬、籃狀菌(talaromyces)屬、阿耶羅菌(ajellomyces)屬、副球孢子菌(paracoccidioides)屬、uncinocarpus屬、球孢子菌(coccidioides)屬、節(jié)皮菌(arthroderma)屬、毛癬菌(trichophyton)屬、外瓶霉(exophiala)屬、刺殼腔菌(capronia)屬、cladophialophora屬、殼球孢(macrophomina)屬、小球腔菌(leptosphaeria)屬、平臍蠕孢(bipolaris)屬、褥盤孢(dothistroma)屬、核腔菌(pyrenophora)屬、neofusicoccum屬、毛球腔菌(setosphaeria)屬、雙極霉(baudoinia)屬、頂囊殼(gaeumannomyces)屬、盤二孢菌(marssonina)屬、亞球殼(sphaerulina)屬、核盤菌(sclerotinia)屬、間座殼(magnaporthe)屬、輪枝菌(verticillium)屬、假尾孢(pseudocercospora)屬、刺盤孢(colletotrichum)屬、蛇口殼(ophiostoma)屬、綠僵菌(metarhizium)屬、孢子絲菌(sporothrix)屬、糞殼(sordaria)屬等的絲狀菌。若考慮到安全性或培養(yǎng)的容易性，在絲狀菌中優(yōu)選上述作為編碼酶(1)和(2)的基因的來(lái)源生物而列舉的醬油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、宇佐美曲霉、白曲霉以及齋藤曲霉等曲霉屬微生物。(編碼酶(1)和(2)的基因的具體例)作為來(lái)源于醬油曲霉nbr4239株的編碼酶(1)的基因，例如可列舉后述實(shí)施例中記載的基因asegta。另外，作為來(lái)源于醬油曲霉nbr4239株的編碼酶(2)的基因，例如可列舉后述實(shí)施例中記載的基因asegtb和asegtc?；騛segta、asegtb和asegtc的堿基序列分別表示為序列表中的seqidno:1-3。另外，基因asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別表示為序列表中的seqidno:4-6。作為來(lái)源于米曲霉rib40株的編碼酶(1)的基因，例如可列舉后述實(shí)施例中記載的基因aoegta。另外，作為來(lái)源于米曲霉rib40株的編碼酶(2)的基因，例如可列舉后述實(shí)施例中記載的基因aoegtb和aoegtc。基因aoegta、aoegtb和aoegtc的堿基序列分別表示為序列表中的seqidno:23-25。另外，基因aoegta、aoegtb和aoegtc蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別表示為序列表中的seqidno:26-28。作為來(lái)源于黑曲霉iam2533株的編碼酶(1)的基因，例如可列舉后述實(shí)施例中記載的基因anegtb?；騛negta的堿基序列表示為序列表中的seqidno:33。另外，基因anegta蛋白質(zhì)的氨基酸序列表示為序列表中的seqidno:34。對(duì)于從除了醬油曲霉、米曲霉和黑曲霉以外的絲狀菌中得到編碼酶(1)和(2)的基因的方法沒有特別限定，例如可以通過(guò)根據(jù)asegta、asegtb和asegtc的堿基序列(seqidno:1-3)以及asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)的氨基酸序列(seqidno:4-6)，對(duì)其他絲狀菌的基因組dna進(jìn)行blast同源性檢索，識(shí)別具有與基因asegta、asegtb和asegtc的堿基序列高序列同一性的堿基序列的基因，從而得到編碼酶(1)和(2)的基因。另外，可以根據(jù)絲狀菌的全蛋白質(zhì)，識(shí)別具有與asegta、asegtb和asegtc高序列同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并識(shí)別編碼該蛋白質(zhì)的基因，從而得到編碼酶(1)和(2)的基因?？梢岳盟玫幕?qū)?lái)源絲狀菌作為宿主絲狀菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，確認(rèn)與宿主絲狀菌相比麥角硫因的產(chǎn)量是否增強(qiáng)，從而確認(rèn)所得的基因是否相當(dāng)于編碼酶(1)和(2)的基因。由于醬油曲霉、米曲霉和黑曲霉的生長(zhǎng)條件相近，有可能通過(guò)插入各自具有的基因而相互轉(zhuǎn)化。例如可以將從醬油曲霉中得到的編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因?qū)胱鳛樗拗鹘z狀菌的米曲霉或黑曲霉中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。鑒于酶(1)、或者酶(1)和(2)確實(shí)具有所需的酶活性，優(yōu)選編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的來(lái)源絲狀菌與宿主絲狀菌相同。例如可以列舉將來(lái)源于醬油曲霉中的編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因在相同的醬油曲霉中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。編碼酶(1)和(2)的基因，也可以是根據(jù)來(lái)源于醬油曲霉等的編碼酶(1)或酶(2)的基因的氨基酸序列，為了在宿主生物中表達(dá)而將密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)、gc含量等最優(yōu)化的基因。作為這樣的基因的具體例，可列舉為了在大腸桿菌中表達(dá)而合成的ecegta(seqidno:37)和ecegtc(seqidno:38)。(本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的一實(shí)施方式)本發(fā)明的一實(shí)施方式為，將基因asegta、aoegta和/或anegta插入醬油曲霉、米曲霉、黑曲霉以外的絲狀菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化使得插入的基因所編碼的蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)而得到的轉(zhuǎn)化絲狀菌。本發(fā)明的另一實(shí)施方式為，將基因asegta、aoegta和/或anegta、以及基因asegtb、asegtc、aoegtb和/或aoegtac插入醬油曲霉、米曲霉、黑曲霉以外的絲狀菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化使得插入的基因所編碼的蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)而得到的轉(zhuǎn)化絲狀菌。這樣的轉(zhuǎn)化絲狀菌通過(guò)對(duì)插入的基因所編碼的酶(1)、或者酶(1)和酶(2)進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，其麥角硫因的產(chǎn)量比宿主絲狀菌的大。另外，如后述實(shí)施例所述，例如，過(guò)量表達(dá)asegta蛋白質(zhì)和asegtb或asegtc蛋白質(zhì)而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉，與僅過(guò)量表達(dá)asegya蛋白質(zhì)而轉(zhuǎn)化的醬油曲霉相比，麥角硫因的產(chǎn)量更大。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌優(yōu)選為，編碼酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得與宿主絲狀菌相比麥角硫因的量增加的轉(zhuǎn)化絲狀菌。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌更優(yōu)選為，編碼酶(1)和(2)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得與編碼酶(1)的基因的表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化絲狀菌相比麥角硫因的量增加的轉(zhuǎn)化絲狀菌。另外，如后述實(shí)施例所述，例如，過(guò)量表達(dá)asegta蛋白質(zhì)的而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉，或者過(guò)量表達(dá)asegta蛋白質(zhì)和asegtb或asegtc蛋白質(zhì)而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉，通過(guò)利用適于宿主絲狀菌即醬油曲霉生長(zhǎng)的dpy培養(yǎng)基在30℃下培養(yǎng)3日，每1g質(zhì)量干燥菌體可得到26.6-37.3mg的麥角硫因。與此相對(duì)，過(guò)量表達(dá)asegtb或asegtc蛋白質(zhì)而轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉通過(guò)在相同條件下培養(yǎng)，每1g質(zhì)量的干燥菌體只能生產(chǎn)0.9-1.2mg的麥角硫因。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的一實(shí)施方式為：編碼酶(1)、或者酶(1)和(2)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得在利用適于宿主絲狀菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌在30℃下培養(yǎng)3日時(shí)，每1g質(zhì)量的干燥菌體可得到260mg以上、優(yōu)選為10.0mg以上、更優(yōu)選為20.0mg以上、進(jìn)一步優(yōu)選為25.0mg以上的轉(zhuǎn)化絲狀菌。另外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的另一實(shí)施方式為：編碼酶(1)和(2)的基因的表達(dá)增強(qiáng)，使得在利用適于宿主絲狀菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌在30℃下培養(yǎng)3日時(shí)，每1g質(zhì)量的干燥菌體可得到27.0mg以上、優(yōu)選為28.0mg以上、更優(yōu)選為29.0mg以上、進(jìn)一步優(yōu)選為30mg以上的轉(zhuǎn)化絲狀菌。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌有時(shí)在利用插入的編碼酶(1)和酶(2)的基因生產(chǎn)酶(1)和(2)的同時(shí)，利用宿主絲狀菌原本所具有的編碼酶(1)和(2)的基因生產(chǎn)結(jié)構(gòu)特性與上述酶(1)和(2)相同或不同種類的野生型酶(1)和(2)。作為本發(fā)明的又一實(shí)施方式，可列舉插入了編碼酶(1)和(2)的基因，并且過(guò)量表達(dá)該插入的基因的轉(zhuǎn)化古細(xì)菌或轉(zhuǎn)化真細(xì)菌。作為轉(zhuǎn)化真細(xì)菌的非限制性的例子，可列舉由含有ecegta、或者ecegta和ecegtc的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。(本發(fā)明的麥角硫因的制備方法)本發(fā)明的麥角硫因的制備方法至少包括：使組氨酸和半胱氨酸作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌而得到麥角硫因的工序。關(guān)于使組氨酸和半胱氨酸作用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的方法，只要是能夠使組氨酸和半胱氨酸與轉(zhuǎn)化絲狀菌接觸，利用轉(zhuǎn)化絲狀菌所具有的酶生產(chǎn)麥角硫因的方法，則沒有特別限制，例如可列舉通過(guò)利用含有組氨酸和半胱氨酸且適于轉(zhuǎn)化絲狀菌的生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，在適于轉(zhuǎn)化絲狀菌的各種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化絲狀菌而制備麥角硫因的方法。對(duì)于培養(yǎng)方法沒有特別限定，例如可列舉在通氣條件下進(jìn)行的固體培養(yǎng)法或液體培養(yǎng)法。關(guān)于培養(yǎng)基，只要是培養(yǎng)絲狀菌的常規(guī)培養(yǎng)基，即以適當(dāng)比例含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)物、其他營(yíng)養(yǎng)素，則可以使用合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基中的任一者。當(dāng)絲狀菌為曲霉屬微生物的情況下，可以使用后述實(shí)施例所述的dpy培養(yǎng)基等，但沒有特別限定。但是，培養(yǎng)基的成分中優(yōu)選含有酶(1)的活化所必須的鐵(ii)。鐵(ii)可以作為化合物而添加到培養(yǎng)基中，也可以作為礦物成分而添加。對(duì)于組氨酸和半胱氨酸沒有特別限定，例如可列舉組氨酸和半胱氨酸本身、含有組氨酸和半胱氨酸作為結(jié)構(gòu)單元的衍生物(例如胱氨酸)、組氨酸和半胱氨酸含有物等。培養(yǎng)條件可以采用本領(lǐng)域人員通常知悉的絲狀菌的培養(yǎng)條件，例如可以將培養(yǎng)基的初始ph調(diào)整為5-10，適當(dāng)設(shè)定培養(yǎng)溫度為20-40℃，培養(yǎng)時(shí)間為數(shù)小時(shí)-數(shù)日、優(yōu)選為1-7日、更優(yōu)選為2-5日等。對(duì)于培養(yǎng)方法沒有特別限定，可采用通氣攪拌深層培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)等，優(yōu)選溶解氧充足的條件下培養(yǎng)。例如，作為培養(yǎng)曲霉屬微生物時(shí)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的一例，可列舉使用后述實(shí)施例所述的dpy培養(yǎng)基，在30℃下、以160rpm振蕩培養(yǎng)3-5日。對(duì)于培養(yǎng)結(jié)束后從培養(yǎng)物中提取麥角硫因的方法沒有特別限定。提取既可以直接使用通過(guò)過(guò)濾、離心等操作從培養(yǎng)物中回收的菌體，也可以使用回收后經(jīng)干燥的菌體或者進(jìn)一步粉碎后的菌體。對(duì)于菌體的干燥方法沒有特別限定，例如可列舉冷凍干燥、日光干燥、熱風(fēng)干燥、真空干燥、通氣干燥、減壓干燥等。提取溶劑只要是溶解麥角硫因的溶劑，則沒有特別限定，例如可列舉甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮等有機(jī)溶劑；這些有機(jī)溶劑與水混合而成含水有機(jī)溶劑；水、溫水和熱水等。加入溶劑后，邊適當(dāng)施加菌體破碎處理邊提取麥角硫因。提取溶劑溫度可以設(shè)定為室溫至100℃。作為麥角硫因的提取方法的一實(shí)施方式，例如可列舉以下方法：用水洗滌從培養(yǎng)物中回收的菌體后，將菌體加入水中制成懸浮液，然后將所得懸浮液在98-100℃下實(shí)施15分鐘等加熱處理后，離心，回收上清，接下來(lái)將回收的上清過(guò)濾除去不溶物。另外，也可以不對(duì)該加熱處理后的懸浮液進(jìn)行離心而直接過(guò)濾。另外，代替上述加熱處理，例如，還可以進(jìn)行以下菌體破碎處理：利用超聲波破碎機(jī)、弗氏壓碎器(frenchpress)、砂磨機(jī)(dyno-mill)、乳缽等破碎手段將菌體破碎的方法；絲狀菌破壁酶(yatalase)等細(xì)胞壁溶解酶來(lái)溶解菌體細(xì)胞壁的方法；利用sds、tritonx-100等表面活性劑溶解菌體的方法等。這些方法可以單獨(dú)或者組合使用。所得的提取液可以通過(guò)進(jìn)行離心、過(guò)濾器過(guò)濾、超濾、凝膠過(guò)濾、溶解度差異分離、溶劑提取、層析法(吸附層析法、疏水層析法、陽(yáng)離子交換層析法、陰離子交換層析法、反相層析法等)、結(jié)晶化、活性炭處理、膜處理等純化處理，將麥角硫因純化。對(duì)于麥角硫因的定性或定量分析沒有特別限定，例如可以通過(guò)hplc等進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)選擇hplc分離條件，例如可以按照后述實(shí)施例所述的條件來(lái)實(shí)施。若使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，則能夠得到高收率的麥角硫因。例如，非專利文獻(xiàn)5的fig.s6中記載的麥角硫因的收率非常少，最多也不過(guò)是每40ml培養(yǎng)液10μg左右。與此相對(duì)，在使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌的情況下，每10ml培養(yǎng)液可以制備3mg以上的麥角硫因。(本發(fā)明的高純度麥角硫因含有物的制備方法)本發(fā)明的高純度麥角硫因含有物的制備方法包括以下工序：利用含有組氨酸和半胱氨酸、優(yōu)選為適于宿主絲狀菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，從所得的培養(yǎng)物中得到純度為5％以上的麥角硫因含有物。只要通過(guò)本發(fā)明的高純度麥角硫因含有物的制備方法而得到的麥角硫因含有物的純度為5％以上，則沒有特別限定，優(yōu)選為6％以上，更優(yōu)選為8％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為9％以上。麥角硫因含有物的純度測(cè)定，例如可以如下進(jìn)行：從培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌所得的培養(yǎng)物中獲得麥角硫因提取液，然后對(duì)獲得的麥角硫因提取液進(jìn)行冷凍干燥得到干燥粉末，接下來(lái)將所得的干燥粉末以適當(dāng)濃度溶于蒸餾水中，得到純度測(cè)定試樣，再接下來(lái)通過(guò)hplc等麥角硫因的定量方法對(duì)所得的純度測(cè)定試樣進(jìn)行測(cè)定，再接下來(lái)由測(cè)定結(jié)果和純度測(cè)定試樣計(jì)算出麥角硫因含有物的純度。本發(fā)明的制備方法的其他形態(tài)為利用在基因組dna上具有編碼酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的微生物，而非轉(zhuǎn)化體的制備方法。例如，本發(fā)明的制備方法的其他形態(tài)為以下麥角硫因或高純度麥角硫因含有物的制備方法，包括：使組氨酸和半胱氨酸作用于在基因組dna上具有編碼酶(1)、或者酶(1)和酶(2)的基因的曲霉屬微生物之類的曲霉等絲狀菌，得到麥角硫因或高純度麥角硫因含有物的工序。在本發(fā)明的制備方法中，產(chǎn)物麥角硫因會(huì)引發(fā)對(duì)所用微生物的增殖抑制或者生長(zhǎng)抑制。因此，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加銅離子等氧化劑將生產(chǎn)的麥角硫因二聚體化(形成s-s鍵)，可能能夠避免微生物的增殖抑制或者生長(zhǎng)抑制。因此，在本發(fā)明的制備方法中，在使組氨酸和半胱氨酸作用于微生物時(shí)，優(yōu)選存在銅離子等氧化劑。關(guān)于本發(fā)明的制備方法，只要能夠達(dá)到本發(fā)明的目的，可以在上述的工序的前段或者后段，又或者工序當(dāng)中，加入各種工序或操作。(麥角硫因的用途)利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌或本發(fā)明的制備方法而得到的麥角硫因，充分利用其作為具有各種生理活性的功能性生物物質(zhì)或者作為耐熱性強(qiáng)的水溶性物質(zhì)的特性，可以用作功能性食品、特定保健用食品飲料、營(yíng)養(yǎng)功能食品飲料、保健功能食品飲料、特殊用途食品飲料、營(yíng)養(yǎng)輔助食品飲料、健康輔助食品飲料、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、美容食品飲料、化妝品、藥品、類藥品、動(dòng)物飼料等或者用于制造他們的原料。以下進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例，但是本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例，只要能夠解決本發(fā)明的問(wèn)題，本發(fā)明可以采用各種形態(tài)。[例1.插入基因asegta、asegtb或asegtc的dna構(gòu)建體的制作](1)目標(biāo)基因的查找在粗糙脈孢菌(neurosporacrassa)中，作為與麥角硫因生物合成相關(guān)的酶，已知ncu04343和ncu1136(參照非專利文獻(xiàn)3和4)。另外，在非專利文獻(xiàn)3中提示了ncu04636與麥角硫因的生物合成相關(guān)的可能性。因此，將粗糙脈孢菌的編碼上述3種酶的基因作為查詢基因，基于醬油曲霉(aspergillussojae)nbrc4239株的基因組序列，檢索與分別編碼ncu04343、ncu04636和ncu11365的基因的序列同一性比較高的區(qū)域。檢索使用blast程序(tblastn)和醬油曲霉nbrc4239株的基因組序列(ddbj/embl/genbankdnadatabases、accessionnumbersforthe65scaffoldsequences；df093557-df093585、dnaresearch18，165-176，2011)。其結(jié)果，作為與ncu04343的基因序列的同一性比較高的序列區(qū)，發(fā)現(xiàn)了seqidno:1所示的基因。鑒于該基因是來(lái)源于醬油曲霉的egta基因，將其命名為asegta基因(seqidno:1)。作為與ncu04636的基因序列的同一性比較高的序列區(qū)，發(fā)現(xiàn)了seqidno:2所示的基因，將該基因命名為asegtb基因(seqidno:2)。作為與ncu11365的基因序列的同一性比較高的序列區(qū)，發(fā)現(xiàn)了seqidno:3所示的基因，將該基因命名為asegtc基因(seqidno:3)。使用遺傳信息處理軟件genetyx網(wǎng)絡(luò)版version12.0.1(genetyx公司)對(duì)氨基酸水平的序列同一性進(jìn)行比較，asegta蛋白質(zhì)(seqidno:4)、asegtb蛋白質(zhì)(seqidno:5)和asegtc蛋白質(zhì)(seqidno:6)與ncu04343、ncu04636和ncu11365的序列同一性分別為46％、75％和44％。另外，asegtc蛋白質(zhì)與ncu11365粟酒裂殖酵母的直向同源物spbc660.12c的序列同一性為27％。以上結(jié)果提示，基于asegta、asegtb和asegtc的堿基序列或氨基酸序列，即可查找其他曲霉屬微生物的egta基因、egtb基因和egtc基因。(2)醬油曲霉nbrc4239株的染色體dna的提取在150ml容量的錐形燒瓶中，用30ml的蒸餾水配制多聚蛋白胨糊精培養(yǎng)基(1％(w/v)多聚蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)kh2po4、0.1％(w/v)nano3、0.05％(w/v)mgso4·7h2o、0.1％(w/v)酪蛋白氨基酸，ph6.0)，接種醬油曲霉nbrc4239的分生孢子，在30℃下振蕩培養(yǎng)一夜。通過(guò)過(guò)濾從得到的培養(yǎng)液中回收菌體，除去紙巾(papertowel)中所含的水分，利用預(yù)先用液氮冷卻的乳缽和研杵，邊用液氮冷卻邊將菌體粉碎。利用dneasyplantminikit(qiagen公司)從得到的粉碎菌體中提取染色體dna。(3)構(gòu)建體用質(zhì)粒的制作按照如下方法，將翻譯延伸因子基因tef1的啟動(dòng)子序列ptef(tef1基因的上游748bp、seqidno:7)、堿性蛋白酶基因alp的終止子序列talp(alp基因的下游800bp、seqidno:8)、以及與尿苷需求性互補(bǔ)的轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因pyrg(上游407bp、編碼區(qū)896bp、seqidno:9)連接至質(zhì)粒puc19，制作構(gòu)建體用質(zhì)粒。使用上述所得的醬油曲霉nbrc4239株染色體dna作為模型dna、使用kod-plus-dna聚合酶(東洋紡社)作為pcr的酶、使用酶附帶的反應(yīng)試劑作為反應(yīng)試劑、使用mastercyclergradient(eppendorf公司)作為裝置，按照酶附帶的試驗(yàn)方案(protocol)，對(duì)ptef、talp和pyrg實(shí)施pcr。用于擴(kuò)增ptef、talp和pyrg的引物和pcr條件示于下表1-3中。應(yīng)予說(shuō)明，表內(nèi)的序列中，小寫字母的序列表示用于將ptef、talp和pyrg的各擴(kuò)增片段依次連接，進(jìn)而與puc19連接的附加序列。將擴(kuò)增的dna在1％(w/v)瓊脂糖凝膠中分離，使用qiaquickgelextracetionkit(qiagen公司)進(jìn)行純化。[表1][表2][表3]puc9使用in-fusionhdcloningkit(clontech公司)附帶的puc19線性化載體(linearizedvector)。使用上述in-fusionhdcloningkit按照試劑盒附帶的試驗(yàn)方案將擴(kuò)增的ptef、talp和pyrg連接至位于puc19的多克隆位點(diǎn)的in-fusion克隆位點(diǎn)，得到構(gòu)建體用質(zhì)粒。利用所得的構(gòu)建體用質(zhì)粒，按照制造商的指示對(duì)感受態(tài)細(xì)胞ecoscompetente.colijm109(日本基因公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而得到轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將得到的轉(zhuǎn)化大腸桿菌在含有50μg/ml的氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中37℃下振蕩培養(yǎng)一夜。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，回收菌體。對(duì)于得到的菌體，使用fastgeneplasmidminikit(日本genetics公司)，按照試劑盒附帶的試驗(yàn)方案提取質(zhì)粒dna。(4)目標(biāo)基因插入構(gòu)建體的制作按照如下方法在構(gòu)建體用質(zhì)粒的ptef和talp之間連接目標(biāo)基因asegta、asegtb或asegtc，制作dna構(gòu)建體。使用上述所得的構(gòu)建體用質(zhì)粒作為模型dna、使用kod-plus-dna聚合酶(東洋紡社)作為pcr的酶、使用酶附帶的反應(yīng)試劑作為反應(yīng)試劑、使用mastercyclergradient(eppendorf公司)作為裝置，按照酶附帶的試驗(yàn)方案來(lái)實(shí)施反向pcr，從而得到構(gòu)建體用質(zhì)粒的載體片段。所用的引物和pcr條件示于下表4中。將擴(kuò)增的載體片段在1％(w/v)瓊脂糖凝膠中分離，使用qiaquickgelextracetionkit(qiagen公司)進(jìn)行純化。[表4]為了擴(kuò)增來(lái)源于醬油曲霉的基因asegta(seqidno:1)、asegtb(seqidno:2)和asegtc(seqidno:3)，使用上述所得的醬油曲霉nbrc4239株染色體dna作為模型dna、使用kod-plus-dna聚合酶(東洋紡社)作為pcr的酶、使用酶附帶的反應(yīng)試劑作為反應(yīng)試劑、mastercyclergradient(eppendorf公司)作為，按照酶附帶的試驗(yàn)方案來(lái)實(shí)施pcr。用于擴(kuò)增asegta、asegtb和asegtc引物和pcr條件示于下表5-7中。應(yīng)予說(shuō)明，在表內(nèi)的序列中，小寫字母的序列表示用于連接至構(gòu)建體用質(zhì)粒(ptrf和talp之間)的附加序列。將擴(kuò)增的dna在1％(w/v)瓊脂糖凝膠中分離，使用qiaquickgelextracetionkit(qiagen公司)進(jìn)行純化。[表5][表6][表7]使用in-fusionhdcloningkit，按照試劑盒附帶的試驗(yàn)方案將如上述所擴(kuò)增的載體片段與asegta、asegtb或asegtc連接，得到插入了asegta、asegtb或asegtc的目標(biāo)基因插入dna構(gòu)建體。由此所的的dna構(gòu)建體是從5'末端側(cè)到3'末端側(cè)連接有來(lái)自puc19的dna片段、ptef的dna片段，asegta、asegtb或asegtc的dna片段、talp的dna片段，pyrg的dna片段、以及來(lái)自puc19的dna片段的構(gòu)建體。即，得到在puc19的mcs依次連接有ptef-asegta、asegtb或asegtc-taip-pyrg的序列的3種dna構(gòu)建體。利用所得的構(gòu)建體，按照制造商的指示對(duì)感受態(tài)細(xì)胞ecoscompetente.colijm109(日本基因公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而得到轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將得到的轉(zhuǎn)化大腸桿菌在含有50μg/ml的氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中37℃下振蕩培養(yǎng)一夜。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液離心，回收菌體。對(duì)于得到的菌體，使用fastgeneplasmidminikit(日本genetics公司)，按照試劑盒附帶的試驗(yàn)方案提取質(zhì)粒dna(dna構(gòu)建體)。通過(guò)確定插入至提取的質(zhì)粒dna中的各dna堿基序列，確認(rèn)得到插入了asegta、asegtb或asegtc的dna構(gòu)建體。[例2.轉(zhuǎn)化醬油曲霉的制作(1)](1)來(lái)自醬油曲霉nbrc4239株的pyrg破壞株將各dna構(gòu)建體用乙醇沉淀后，溶解于te，將配制成所需濃度的dna溶液按照以下順序用于來(lái)自醬油曲霉nbrc4239株的pyrg破壞株(pyrg基因的上游48bp、編碼區(qū)896bp、下游240bp)的轉(zhuǎn)化。(2)來(lái)源于醬油曲霉nbrc4239株的pyrg破壞株的轉(zhuǎn)化在500ml容量錐形瓶?jī)?nèi)的含有20mm尿苷的多聚蛋白胨糊精液體培養(yǎng)基100ml中接種來(lái)源于醬油曲霉nbrc4239株的pyrg破壞株的分生孢子，在30℃下進(jìn)行約20小時(shí)的振蕩培養(yǎng)后，回收菌體。由回收的菌體制備原生質(zhì)體。利用得到的原生質(zhì)體和20μg目標(biāo)基因插入dna構(gòu)建體，通過(guò)原生質(zhì)體peg法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后利用含有0.5％(w/v)瓊脂和1.2m山梨糖醇的czapek-dox基本培養(yǎng)基(difco公司；ph6)，在30℃下孵育5日以上，得到具有集落形成能力的轉(zhuǎn)化醬油曲霉。得到的轉(zhuǎn)化醬油曲霉，通過(guò)導(dǎo)入與尿苷需求性互補(bǔ)的基因pyrg，可以在未添加尿苷的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，從而可作為導(dǎo)入了目標(biāo)基因的菌株進(jìn)行選擇。[例3.轉(zhuǎn)化醬油曲霉的麥角硫因的生產(chǎn)(1)]如下表8所示，分別對(duì)作為對(duì)照的醬油曲霉nbrc4239株；由基因asegta、asegtb和asegtc中的任意一種基因轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)化醬油曲霉；以及由基因asegta和asegtb或asegtc轉(zhuǎn)化而成的轉(zhuǎn)化醬油曲霉各自的麥角硫因生產(chǎn)能力進(jìn)行如下比較。[表8]導(dǎo)入基因菌株名稱-對(duì)照株asegta、asegtb(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株asegta、asegtc(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株asegtaasegta轉(zhuǎn)化株asegtbasegtb轉(zhuǎn)化株asegtcasegtc轉(zhuǎn)化株在50ml容量錐形瓶?jī)?nèi)的dpy液體培養(yǎng)基(1％(w/v))多聚蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、05％(w/v)kh2po4、0.05％(w/v)mgso4·7h2o，ph未調(diào)整)10ml中，接種表8所示的各菌株的分生孢子，在30℃下以160rpm振蕩培養(yǎng)3日。然后在miracloth(calbiochem公司)上從培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中回收菌體。用40ml蒸餾水將回收的菌體洗滌后，將菌體夾在紙巾中，從而將水分?jǐn)D出得到濕菌體。稱量所得濕菌體的重量，添加相對(duì)于該濕菌體質(zhì)量的兩倍的水并攪拌，得到菌懸浮液。得到的菌懸浮液在98℃、15分鐘的條件下進(jìn)行加熱處理。經(jīng)該處理后，將懸浮液離心，作為上清回收菌體外液，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，從而得到麥角硫因提取液。關(guān)于得到的麥角硫因提取液，通過(guò)以下條件的hplc進(jìn)行分析。色譜柱：cosmosilhilic(4.6×250mm)洗脫液：乙腈∶10mm醋酸銨＝8∶2流速：1ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm溫度：室溫定量方法：使用麥角硫因樣品(enzolifesciences公司；cat.no.bml-fr111)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法。在表8所示的各菌株中選取麥角硫因的量最大的菌株，對(duì)這些菌株進(jìn)行麥角硫因(egt)產(chǎn)量的比較。比較結(jié)果如表9和圖1所示。在此，關(guān)于上述所得的asegta轉(zhuǎn)化株的濕菌體(用紙巾除去水分的菌體)的一部分，利用水分計(jì)(mx-50；a&d公司)測(cè)定水分含量，結(jié)果濕菌體的水分含量為77.7％。因此表9中，在計(jì)算干燥菌體單位的麥角硫因產(chǎn)量時(shí)，水分含量估算為78％。另外，使用了對(duì)照株(control)和asegta轉(zhuǎn)化株的麥角硫因提取液的hplc色譜圖如圖2所示。接著按照以下順序測(cè)定麥角硫因提取液中麥角硫因的純度。即，在500ml容量錐形瓶?jī)?nèi)的dpy液體培養(yǎng)基100ml中，接種asegta轉(zhuǎn)化株的分生孢子，在30℃下以160rpm振蕩培養(yǎng)3日、。然后在miracloth上從培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中回收菌體。用200ml蒸餾水將回收的菌體后，將菌體夾在紙巾中，從而將水分?jǐn)D出得到濕菌體。稱量所得濕菌體的重量，添加相對(duì)于該濕菌體質(zhì)量的兩倍的水并攪拌，得到菌懸浮液。得到的菌懸浮液在沸騰水浴中加熱15分鐘。加熱結(jié)束后，將懸浮液離心，作為上清回收菌體外液，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，從而得到麥角硫因提取液。將得到的麥角硫因提取液冷凍干燥，得到冷凍干燥粉末。將得到的冷凍干燥粉末以20mg/ml溶于蒸餾水中，作為純度測(cè)定試樣。對(duì)于該純度測(cè)定試樣，測(cè)定麥角硫因量的結(jié)果為2.3mg/ml。因此，計(jì)算出提取液中的egt的純度為9.2％。[表9]如表9和圖1所示，通過(guò)導(dǎo)入三種目標(biāo)基因中的一種或兩種基因而轉(zhuǎn)化的asegta轉(zhuǎn)化株、(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株和(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株與未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株、asegtb轉(zhuǎn)化株和asegtc轉(zhuǎn)化株相比，麥角硫因的產(chǎn)量更高。另外，asegta轉(zhuǎn)化株雖然麥角硫因產(chǎn)量高，但asegtb轉(zhuǎn)化株和asegta轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量與對(duì)照株沒有區(qū)別，并且(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株和(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量大于asegta轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量與asegtb轉(zhuǎn)化株或者asegtc轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量之和，鑒于此可知(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株和(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株相對(duì)于asegta轉(zhuǎn)化株、asegtb轉(zhuǎn)化株、asegtc轉(zhuǎn)化株，麥角硫因產(chǎn)量累加性地、甚至于協(xié)同性地增強(qiáng)。另外，(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株，通過(guò)利用培養(yǎng)常規(guī)絲狀菌時(shí)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，一次實(shí)施3日培養(yǎng)可生產(chǎn)以干燥菌體計(jì)37.3mg/g的麥角硫因。與此相對(duì)，例如對(duì)比文獻(xiàn)1中使用添加了高濃度氨基酸的培養(yǎng)基對(duì)姬菇(pleurotuscornucopiae)的菌絲體進(jìn)行兩階段共計(jì)28的培養(yǎng)，才能得到以干燥菌體計(jì)34mg/g的麥角硫因。因此，可知只要使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌，可以采用常規(guī)的絲狀菌的培養(yǎng)方法簡(jiǎn)便且短時(shí)間地生產(chǎn)高產(chǎn)量的麥角硫因。另外，如圖2所示，從與對(duì)照株的比較可知，asegta轉(zhuǎn)化株能夠高效地生產(chǎn)高純度的麥角硫因。這從使用asegta轉(zhuǎn)化株而得到的麥角硫因提取液中的麥角硫因純度測(cè)定結(jié)果中可以得到印證。同樣地，也獲知了在(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株和(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株中，能夠高效地生產(chǎn)高純度的麥角硫因。[例4.轉(zhuǎn)化醬油曲霉的確認(rèn)]在試管內(nèi)的dpy液體培養(yǎng)基10ml中接種表8所示的各菌株的分生孢子，在30℃下振蕩培養(yǎng)3日后，回收菌體。利用珠式細(xì)胞破碎裝置(beadcelldisrupter，ms-100r；tomy精工公司)在冷卻條件下對(duì)回收的菌體進(jìn)行破碎，將破碎后的菌體粉末懸浮于0.1％(w/v)sds水溶液中，從而得到sds懸浮液。在得到的sds懸浮液中添加1/4容量的樣品緩沖液(lanemarkerreducingsamplebuffer，immunopure(5×)；thermofisherscientific公司)并攪拌，然后在98℃、3分鐘的條件下進(jìn)行加熱處理。經(jīng)該處理后，對(duì)于離心所回收的上清，采用相當(dāng)于0.2mg菌體的量，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，實(shí)施sds-page。結(jié)果如圖3所示。如圖3所示，asegta蛋白質(zhì)根據(jù)氨基酸序列設(shè)想的分子量為95.7kda，sds-page中在90kda附近可見兩條帶。同樣地，asegtb蛋白質(zhì)根據(jù)氨基酸序列設(shè)想的分子量為56.4kda，sds-page中可見50kda的弱帶。另外，asegtc蛋白質(zhì)根據(jù)氨基酸序列設(shè)想的分子量為51.2kda，sds-page中可見50kda的帶。從圖3可知，對(duì)照株幾乎未表達(dá)asegta蛋白質(zhì)、asegtb蛋白質(zhì)和asegtc蛋白質(zhì)，而(asegta+asegtb)轉(zhuǎn)化株和(asegta+asegtc)轉(zhuǎn)化株表達(dá)了asegta蛋白質(zhì)和asegtb蛋白質(zhì)或asegtc蛋白質(zhì)。另外，asegta轉(zhuǎn)化株、asegtb轉(zhuǎn)化株和asegtc轉(zhuǎn)化株表達(dá)了各自所對(duì)應(yīng)的asegta蛋白質(zhì)、asegtb蛋白質(zhì)和asegtc蛋白質(zhì)。[例5.插入了基因aoegta、aoegtb和aoegtc的dna構(gòu)建體的制作](1)目標(biāo)蛋白質(zhì)的查找基于米曲霉(aspergillusoryzae)rib40株的全蛋白質(zhì)，以醬油曲霉的asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)的各氨基酸序列作為查詢序列，檢索序列同一性高的蛋白質(zhì)。檢索使用dogan(http：//www.bio.nite.go.jp/dogan/project/view/ao)。結(jié)果，作為與asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)的各氨基酸序列的序列同一性比較高的蛋白質(zhì)，分別發(fā)現(xiàn)了ao090012000265(seqidno:26)、ao090020000619(seqidno:27)和ao090026000291(seqidno:28)。應(yīng)予說(shuō)明，ao090012000265作為類似s.pombe的egt1，記載在非專利文獻(xiàn)5的table2。確認(rèn)ao090012000265、ao090020000619和ao090026000291分別與asegta、asegtb和asegtc蛋白質(zhì)具有97％、99％和93％的序列同一性。從米曲霉的基因組dna中識(shí)別分別編碼ao090012000265、ao090020000619和ao090026000291的基因，鑒于來(lái)源于米曲霉的egta、egtb和egtc基因，將這些基因命名為基因aoegta(seqidno:23)、aoegtb(seqidno:24)和aoegtc(seqidno:25)。(2)米曲霉rib40株的染色體dna的提取除使用米曲霉rib40株的分生孢子以外，按照上述例1-(2)相同的方法實(shí)施。(3)構(gòu)建體用質(zhì)粒的制作采用上述例1-(3)制作的載體片段。(4)目標(biāo)基因插入構(gòu)建體的制作目標(biāo)基因?yàn)閍oegta、aoegtb和aoegtc基因，采用上述得到的米曲霉rib40株的染色體dna作為模型dna，除此之外，按照上述例1-(4)相同的方法實(shí)施。應(yīng)予說(shuō)明，用于擴(kuò)增aoegta、aoegtb和aoegtc基因的引物和pcr條件示于下表10-12中。[表10][表11][表12]應(yīng)予說(shuō)明，與上述例1-(4)相同，通過(guò)確定所提取的質(zhì)粒dna中插入的dna堿基序列，確認(rèn)得到插入了基因aoegta、aoegtb或aoegtc的dna構(gòu)建體。[例6.轉(zhuǎn)化米曲霉的制作]使用插入了基因aoegta、aoegtb或aoegtc的dna構(gòu)建體，對(duì)來(lái)源于日本特開2013-034416號(hào)公報(bào)記載的米曲霉rib40的pyrg破壞株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，除此之外按照上述例2-(1)和(2)相同的方法實(shí)施。[例7.轉(zhuǎn)化米曲霉的麥角硫因的生產(chǎn)]如下表13所示，對(duì)照株即米曲霉rib40株、由基因aoegta轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化米曲霉、以及由基因asegta和asegtb或asegtc轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化米曲霉各自的麥角硫因生產(chǎn)能力比較如下。[表13]導(dǎo)入基因菌株名稱-對(duì)照株aoegta、aoegtb(aoegta+aoegtb)轉(zhuǎn)化株aoegta、aoegtc(aoegta+aoegtc)轉(zhuǎn)化株aoegtaaoegta轉(zhuǎn)化株除接種了表13所示的各菌株的分生孢子以外，按照上述例3相同的方法實(shí)施。在表13所示的各菌株中，選取麥角硫因的量最大的菌株，對(duì)這些菌株進(jìn)行麥角硫因(egt)產(chǎn)量的比較。比較結(jié)果如圖5所示。如圖5所示，與轉(zhuǎn)化醬油曲霉相同，轉(zhuǎn)化米曲霉的麥角硫因的產(chǎn)量比未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株高。另外(aoegta+aoegtb)轉(zhuǎn)化株和(aoegta+aoegtc)轉(zhuǎn)化株的麥角硫因的產(chǎn)量比aoegta轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量高。根據(jù)這些結(jié)果，可以獲知，在米曲霉的轉(zhuǎn)化株中也能高效地生產(chǎn)麥角硫因。[例8.插入了基因anegta的dna構(gòu)建體的制作](1)目標(biāo)蛋白質(zhì)的查找基于數(shù)據(jù)庫(kù)non-redundantproteinsequences(nr)，將醬油曲霉的asegta蛋白質(zhì)的氨基酸序列作為查詢序列，檢索序列同一性高的蛋白質(zhì)。檢索使用了blastp(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastp&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)。結(jié)果，在與asegta蛋白質(zhì)的氨基酸序列的序列同一性高的蛋白質(zhì)中，黑曲霉aspergillusnigercbs513.88株的同源蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)了xp_001397117.2(seqidno:34)。確認(rèn)xp_001397117.2與asegta蛋白質(zhì)具有73％的序列同一性。從黑曲霉的基因組dna中識(shí)別編碼xp_001397117.2的基因，鑒于來(lái)源于醬油曲霉的egta基因，將該基因命名為基因asegta(seqidno:33)。(2)黑曲霉iam2533株的染色體dna的提取除使用黑曲霉iam2533株的分生孢子以外，按照上述例1-(2)相同的方法實(shí)施。(3)構(gòu)建體用質(zhì)粒的制作采用上述例1-(3)制作的載體片段。(4)目標(biāo)基因插入構(gòu)建體的制作目標(biāo)基因?yàn)閍negta基因，采用上述得到的黑曲霉iam2533株的染色體dna作為模型dna，除此之外按照上述例1-(4)相同的方法實(shí)施。應(yīng)予說(shuō)明，用于擴(kuò)增anegta基因而使用的引物和pcr條件示于下表14中。[表14]應(yīng)予說(shuō)明，與上述例1-(4)相同，通過(guò)確定所提取的質(zhì)粒dna中插入的dna堿基序列，確認(rèn)得到插入了基因anegta的dna構(gòu)建體。確認(rèn)所克隆的基因anegta的序列后，基因組信息與公開的a.nigercbs513.88株的預(yù)測(cè)基因(ani_1_792134)的序列一致(對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為上述xp_001397117.2)。[例9.轉(zhuǎn)化醬油曲霉的制作(2)]除利用插入了基因anegta的dna構(gòu)建體以外，按照上述例2-(1)和(2)相同的方法實(shí)施。[例10.轉(zhuǎn)化醬油曲霉的麥角硫因生產(chǎn)(2)]除了接種對(duì)照株即醬油曲霉nbrc4239株、以及由基因anegta轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉的分生孢子以外，按照上述例3相同的方法實(shí)施。選取各菌株中麥角硫因的量為最大的菌株，對(duì)這些菌株進(jìn)行麥角硫因(egt)產(chǎn)量的比較。比較結(jié)果如表15所示。[表15]如圖15所示，與由基因asegta轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉相同，由基因anegta轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉的麥角硫因的產(chǎn)量比未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株高。根據(jù)這些結(jié)果，可以獲知，在由來(lái)源于不同物種的異源基因anegta轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醬油曲霉也能夠高效地生產(chǎn)麥角硫因。[例11.轉(zhuǎn)化大腸桿菌的制作]基于asegta和asegtc各自的氨基酸序列，從密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)、gc含量等觀點(diǎn)出發(fā)為了大腸桿菌表達(dá)而將基因序列最優(yōu)化，在基因的上游添加ecorv序列(gatatc)、并且在下游添加spei序列(actagt)，從而得到ecegta(seqidno:37)和ecegtc(seqidno:38)。構(gòu)建pute120k'作為表達(dá)用載體。即，利用nhei和hpai消化日本特開平6-292584號(hào)公報(bào)記載的pute100k'，除去lac啟動(dòng)子。然后，在pkk223-3(ge公司)的tac啟動(dòng)子區(qū)域的3'末端添加nhei位點(diǎn)，5'末端添加ecorv位點(diǎn)，利用pcr進(jìn)行擴(kuò)增和純化。接著，nhei消化后，插入至pute100k'原本的lac啟動(dòng)子所在的部位，制作pute120k'。利用ecorv和spei對(duì)pute120k'進(jìn)行限制酶處理，然后連接ecegta或者ecegtc，制作插入了ecegta或者ecegtc的質(zhì)粒pute120k'-ecegta和pute120k'-ecegtc。使用上述構(gòu)建體用質(zhì)粒培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，對(duì)質(zhì)粒pute120k'-ecegta和pute120k'-ecegtc進(jìn)行純化。接著，利用bamhi和spei對(duì)pute120k'-ecegtc進(jìn)行限制酶處理，切下含有基因ecegtc的片段，進(jìn)行純化。另外，利用bamhi和spei對(duì)pute120k′-ecegta進(jìn)行限制酶處理，插入含有上述基因ecegtc的片段，制作質(zhì)粒pute120k′-ecegta-ecegtc。利用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109株，得到轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用含有0.1mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)的ty培養(yǎng)基(1％(w/v)細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)細(xì)胞用酵母提取物、0.5％(w/v)nacl、ph7.0)，將轉(zhuǎn)化大腸桿菌在25℃下培養(yǎng)16小時(shí)，在全部培養(yǎng)液和回收菌體的熱水提取液中檢測(cè)出了麥角硫因。[例12.轉(zhuǎn)化大腸桿菌的麥角硫因的生產(chǎn)(1)]如下表16所示，導(dǎo)入了對(duì)照株即表達(dá)用載體pute120k’的大腸桿菌、由基因ecegta或者ecegtc轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化大腸桿菌、以及由基因ecegta和ecegtc的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化大腸桿菌各自的麥角硫因生產(chǎn)能力比較如下。[表16]導(dǎo)入基因菌株名稱pute120k’對(duì)照株ecegtaecegta轉(zhuǎn)化株ecegtcecegtc轉(zhuǎn)化株ecegta，ecegtc(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株在19ml容量試管內(nèi)的ty培養(yǎng)基2.5ml中接種表16所示的各菌株，在37℃、16小時(shí)、180rpm的振蕩條件下進(jìn)行種子培養(yǎng)(seed-culture)。將種子培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液0.02ml接種至在19ml容量試管內(nèi)的含有氨芐青霉素和0.5mmiptg的ty培養(yǎng)基2.5ml中，在25℃、24小時(shí)、180rpm的振蕩條件下進(jìn)行主培養(yǎng)(main-culture)。應(yīng)予說(shuō)明，用于主培養(yǎng)的ty培養(yǎng)基準(zhǔn)備了以下3個(gè)系統(tǒng)：未添加氨基酸的系統(tǒng)(ty-)，添加了0.005％(w/v)組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的系統(tǒng)(ty+)，以及添加了0.01％(w/v)組氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸的系統(tǒng)(ty++)。從培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中通過(guò)離心(12000rpm、4℃、10分鐘)回收作為沉淀物的菌體。向從1ml培養(yǎng)液所得的菌體中添加0.5ml水，得到菌懸浮液。將得到的菌懸浮液在98℃、10分鐘的條件下進(jìn)行加熱處理。經(jīng)該處理后，將懸浮液離心，作為上清回收菌體外液，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，從而得到麥角硫因提取液。對(duì)于從所得的麥角硫因提取液和主培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中得到的培養(yǎng)上清(經(jīng)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾處理后)，按照以下條件進(jìn)行l(wèi)c-ms分析。lc裝置：agilent1100系列(安捷倫公司)質(zhì)量分析裝置：qstarelite(absciex公司)色譜柱：cosmosilhilic(4.6×250mm)洗脫劑：乙腈+0.1％甲酸:水+0.1％甲酸＝75:25(v/v)流速：250μl/ml檢測(cè)：esipositive注入：10μl溫度：室溫定量法：使用麥角硫因樣品(enzolifesciences公司；cat.no.bml-fr111)的標(biāo)準(zhǔn)曲線法。對(duì)于表16所示的各菌株進(jìn)行麥角硫因(egt)產(chǎn)量的比較。應(yīng)予說(shuō)明，對(duì)于(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株，使用任選的兩株。比較結(jié)果如圖6所示。如圖6所示，在對(duì)照株和ecegtc轉(zhuǎn)化株中，不論培養(yǎng)上清中還是麥角硫因提取液中均未確認(rèn)到麥角硫因量。由此可以獲知，對(duì)照株和ecegtc轉(zhuǎn)化株無(wú)麥角硫因生產(chǎn)能力，或者麥角硫因的生產(chǎn)能力非常微小。另一方面，在ecegta轉(zhuǎn)化株和(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株中，能夠確認(rèn)麥角硫因生產(chǎn)能力。另外，(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株所得的麥角硫因量大于ecegta轉(zhuǎn)化株所得的麥角硫因量，這些差異在培養(yǎng)上清中顯著。另外，比較向培養(yǎng)基中添加組氨酸、蛋氨酸和半胱甘酸的影響進(jìn)行比較，在ecegta轉(zhuǎn)化株和(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株的任一者中，通過(guò)向培養(yǎng)基中添加組氨酸、蛋氨酸和半胱甘酸，使麥角硫因的量增加。根據(jù)以上結(jié)果可以獲知，ecegta轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量高，但由于無(wú)法檢測(cè)出ecegtc轉(zhuǎn)化株的麥角硫因產(chǎn)量，因此(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株相對(duì)于ecegta轉(zhuǎn)化株，麥角硫因產(chǎn)量累加性地、甚至于協(xié)同性地增強(qiáng)。[例13.轉(zhuǎn)化大腸桿菌的麥角硫因生產(chǎn)(2)]在19ml容量試管內(nèi)的含50μ/ml氨芐青霉素的ty培養(yǎng)基(1％(w/v)細(xì)菌用胰蛋白胨、0.5％(w/v)細(xì)胞用酵母提取物、(1％(w/v)nacl、ph7.0)2.5ml中，接種表16所示的各菌株，在37℃、一夜、180rpm的振蕩條件下進(jìn)行種子栽培。然后，將得到的種子培養(yǎng)液0.8ml接種至500ml容量磨口錐形瓶?jī)?nèi)的含0.2mmiptg+50μg/ml的氨芐青霉素的ty培養(yǎng)基100ml中，在25℃、24小時(shí)、150rpm的振蕩條件下進(jìn)行主培養(yǎng)。從培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中通過(guò)離心(12000rpm、4℃、10分鐘)回收作為沉淀物的菌體。向從1ml培養(yǎng)液所得的菌體中添加5ml蒸餾水并攪拌，得到菌懸浮液。將得到的菌懸浮液在98℃、10分鐘的條件下進(jìn)行加熱處理。經(jīng)該處理后，將懸浮液離心，作為上清回收菌體外液，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，從而得到麥角硫因提取液。對(duì)于從所得的麥角硫因提取液和主培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中得到的培養(yǎng)上清(經(jīng)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾處理后)，按照上述例12記載的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms分析。另外，對(duì)于從40ml培養(yǎng)液中得到的菌體，通過(guò)在60℃的培養(yǎng)箱內(nèi)干燥來(lái)測(cè)定干燥菌體的重量。麥角硫因(egt)產(chǎn)量的比較結(jié)果如表17所示。[表17]如表17所示，可以獲知，與上述例12相同，對(duì)照株和ecegtc轉(zhuǎn)化株沒有麥角硫因生產(chǎn)能力或者該生產(chǎn)能力非常微??；(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株所得的麥角硫因量大于ecegtc轉(zhuǎn)化株所得的麥角硫因量。這些差異在培養(yǎng)上清中顯著；(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化株相對(duì)于ecegta轉(zhuǎn)化株，麥角硫因產(chǎn)量累加性地、甚至于協(xié)同性地增強(qiáng)。[例14.轉(zhuǎn)化大腸桿菌的麥角硫因生產(chǎn)(3)]在19ml容量試管內(nèi)的含1μ/ml氨芐青霉素的ty培養(yǎng)基2.5ml中，接種表16所示的(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在30℃、16小時(shí)、140rpm的振蕩條件下進(jìn)行種子培養(yǎng)。然后，將得到的種子培養(yǎng)液全量接種在31缸式發(fā)酵槽(jarfermenter，丸菱生物工程公司)內(nèi)的含有0.1mmiptg、0.1％(w/v)組氨酸、0.1％(w/v)蛋氨酸和0.6％(w/v)硫代硫酸鈉的高密度培養(yǎng)用培養(yǎng)基2000ml中，控制25℃、0.01mpa、750rpm的條件進(jìn)行主培養(yǎng)。從培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中通過(guò)離心(12000rpm、4℃、5分鐘)回收作為沉淀物的菌體。向從1ml培養(yǎng)液所得的菌體中添加1ml蒸餾水并攪拌，得到菌懸浮液。將得到的菌懸浮液在100℃、15分鐘的條件下進(jìn)行加熱處理。經(jīng)該處理后，將懸浮液離心，作為上清回收菌體外液，用0.45μm的過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，從而得到麥角硫因提取液。對(duì)于從所得的麥角硫因提取液和主培養(yǎng)后的培養(yǎng)物中得到的培養(yǎng)上清(經(jīng)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾處理后)，按照上述例3記載的條件進(jìn)行hplc分析。另外，菌體濃度利用吸光度(od600nm)進(jìn)行分析。培養(yǎng)中的吸光度(ob600nm)、麥角硫因提取液和培養(yǎng)上清中的麥角硫因量的測(cè)定結(jié)果示于圖7中。如圖7所示，麥角硫因提取液中(菌體內(nèi))的麥角硫因量最大為0.64mg/ml，培養(yǎng)上清中(菌體外)的麥角硫因量最大為0.05mg/ml。另外，菌體濃度(od600)最大為47.1。根據(jù)該結(jié)果，通過(guò)高密度培養(yǎng)(ecegta+ecegtc)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以在培養(yǎng)液中制備大量的麥角硫因。根據(jù)上述例11-例14的結(jié)果可以獲知，基于來(lái)源于醬油曲霉的asegta蛋白質(zhì)和asegtc蛋白質(zhì)各自的氨基酸序列，從密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)、gc含量等觀點(diǎn)出發(fā)，利用為使宿主生物表達(dá)而最優(yōu)化的基因egta、或者egta和egtc，通過(guò)對(duì)宿主生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，，與宿主生物原本的麥角硫因生產(chǎn)能力無(wú)關(guān)，能夠在宿主生物中生產(chǎn)麥角硫因。另外，根據(jù)上述例11-例14的結(jié)果可以獲知，通過(guò)大量或者高密度地培養(yǎng)麥角硫因生產(chǎn)轉(zhuǎn)化株，能夠大量制備麥角硫因。這些結(jié)果表明，對(duì)于轉(zhuǎn)化絲狀菌，也能夠通過(guò)大量或者高密度培養(yǎng)工業(yè)規(guī)模地制備麥角硫因。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的轉(zhuǎn)化絲狀菌或制備方法，能夠用于制備高純度的麥角硫因。由于麥角硫因?yàn)楦吆虬被?，因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模地制造用于制造具有抗氧化功能的化妝品或營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑等抗氧化產(chǎn)品的原料。序列表<110>龜甲萬(wàn)株式會(huì)社<120>麥角硫因生產(chǎn)能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化絲狀菌及麥角硫因的制備方法<130>15df0403pct<160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>2925<212>dna<213>醬油曲霉<400>1atgtcacctttggctctctctcctaagaccgttgacattgtcaacatctttcagaatgat60gtggagttctccctcgtaaatgagatccataagggtattagtcctcccgctggcgttagg120aagtcaatgccaacgatgcttctttacgatgccaatggcctcaagctttttgagaacatc180acctatgtgaaggagtattatctaacaaatgcggaaattgaggtcttggagacaaattcc240aggaggatagttgaacggattccagacaatgcgcaactgcttgaattaggtagcgggtgc300gtcatccttccaaatcaaatcgtaacctttcaggctgcgtagcgtatcattaccgttctc360cggttttaaccgccttttaggaatcttcggaaaattgagattctgctacgggagtttgag420cgcgtgggaaagcgcgtggattattatgccctggacctgtctctatcagaactgcagcgc480acattcgcagaggtgtccattgatgattacacacacgttggcctccatggtctccatgga540acctacgatgatgccgtcacttggcttaacagccccgaaaacaggaagcggcccacggtg600atcatgtctatgggttcctctttagggaactttgaccgtcccggcgcagcaaagtttctc660tcgcagtatgctagccttcttggtccatccgatatgatgatcattggtctggatggctgc720aaggacccgggcaaagtatacagggcatacaatgattcagaaggtgttacacggcagttc780tacgagaacggactagtgcatgcaaatgttgttcttggatacgaagccttcaaatctgat840gagtgggaagtagtgactgactacgataccgtggagggacgacactgggcagcctactca900cccaagaaggacgtcactatcaacggggtccttcttaagaagggtgagaaacttttcttt960gaagaggcgtacaagtacggaccagaggaacgcgatcaactgtggcgtgatgccaagtta1020attcagtctacggaaatgggcaatgggtctgacgattaccgtgagtagcaaatggctgcc1080tcatttcaatagacgtgtatgctgactctggcttttcgcaaaatagatctccatcttctg1140acatcggctaccctcaacctccccacgtctccctctcaatatgcagctcatcctataccc1200agctttgaagaatggcagtccctgtggacagcatgggataatgctacaaaggctatggtc1260cctcgcgaggagcttctgtcaaagccgatcaagctacggaactctttgatcttctatctg1320ggacacattcctacattcttgggttagtctacatggcttactattcccaacacatagctt1380gatgctaattatgcaaacagacatccatctgacccgagccctgcgcggaaaattaacaga1440gccaaagtcttataaactaattttcgaacgtgggattgatcctgatgtagatgaccccga1500gaagtgccactcccatagcgagatcccagacgagtggccagctcttgatgacattctaga1560ctaccaagagcgagtcagaagcagagttagatccatctaccaaatcgagggccttgcaga1620gaacagaatcctgggtgaggcgctttggattggatttgagcacgaagtgatgcacctcga1680gacattcctgtacatgttgatccagagcgaaaggatacttcccccgcccgccactgagcg1740gccggacttcaaaaaactgtatcaagaagctcggagaagcatgaaagcaaatgagtggtt1800ctctgttcctgaacagacacttactattggccttgatggtgctgataccaacgacgtacc1860cccaacgacctatggg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