相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2015年11月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)no.62/256,952的優(yōu)先權(quán)、2015年10月19日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)no.62/243,211的優(yōu)先權(quán)、2015年8月28日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)no.62/211,057的優(yōu)先權(quán)以及2014年12月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)no.62/093,491的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。

背景技術(shù)：

生物技術(shù)領(lǐng)域在過(guò)去20年中有極大增長(zhǎng)。這種增長(zhǎng)是由于許多因素造成的，其中一些因素包括可用于生物反應(yīng)器的設(shè)備的改進(jìn)，對(duì)生物系統(tǒng)的了解程度的增加以及關(guān)于材料(如單克隆抗體和重組蛋白)與人體各系統(tǒng)的相互作用的知識(shí)的增加。

設(shè)備的改進(jìn)允許如重組蛋白等生物衍生材料的更大量和更低成本的生產(chǎn)。這在藥物領(lǐng)域尤其普遍，其中許多類(lèi)型的新藥治療的成功直接歸因于通過(guò)基于蛋白質(zhì)的制造方法大量生產(chǎn)這些材料的能力。

在新的基于生物學(xué)的藥物的制造過(guò)程中使用的關(guān)鍵組件之一是生物反應(yīng)器和與之相關(guān)聯(lián)的輔助工藝。生物反應(yīng)器領(lǐng)域的增長(zhǎng)領(lǐng)域一直伴隨灌注過(guò)程。灌注過(guò)程與補(bǔ)料分批(fed-batch)過(guò)程的區(qū)別在于其較低的資本成本和連續(xù)(而不是分批)操作。

在補(bǔ)料分批過(guò)程中，將培養(yǎng)物在生物反應(yīng)器中接種。在生長(zhǎng)周期中逐漸添加另外量的選定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于提高產(chǎn)量和生長(zhǎng)。在收獲培養(yǎng)物后回收產(chǎn)物。不連續(xù)的補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器工藝由于其簡(jiǎn)單性以及還由于接續(xù)已知的發(fā)酵工藝而具有吸引力。然而，補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器具有高的啟動(dòng)成本，并且通常具有大的體積以便在生長(zhǎng)周期結(jié)束時(shí)獲得的產(chǎn)物的量具有成本效益。批次完成后，必須對(duì)生物反應(yīng)器清潔和消毒，導(dǎo)致非生產(chǎn)性停工時(shí)間。

灌注生物反應(yīng)器對(duì)供應(yīng)到生物反應(yīng)器中的連續(xù)供應(yīng)的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行處理，同時(shí)不斷地除去生長(zhǎng)抑制副產(chǎn)物。灌注生物反應(yīng)器工藝可以減少或消除非生產(chǎn)性停工時(shí)間。在灌注培養(yǎng)物(3000萬(wàn)到1億個(gè)細(xì)胞/ml)中獲得的細(xì)胞密度通常高于補(bǔ)料分批模式(500萬(wàn)到2500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)下的細(xì)胞密度。這些改進(jìn)導(dǎo)致收獲物的污染較少，產(chǎn)量較高，而成本卻沒(méi)有顯著增加。然而，灌注生物反應(yīng)器需要細(xì)胞保留裝置以防止在副產(chǎn)物被除去時(shí)培養(yǎng)物逸出。這些細(xì)胞保留系統(tǒng)為灌注過(guò)程增加了一定程度的復(fù)雜性，需要管理、控制和維護(hù)以實(shí)現(xiàn)成功的操作。之前，諸如細(xì)胞保留設(shè)備的失靈或故障等操作問(wèn)題一直是灌注生物反應(yīng)器的問(wèn)題，這在過(guò)去限制了它們的吸引力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在各種實(shí)施例中，本公開(kāi)涉及用于灌注生物制造的聲學(xué)裝置。更具體地，該裝置聯(lián)接到相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器。在生物反應(yīng)器內(nèi)生產(chǎn)生物分子，如重組蛋白或單克隆抗體。然后，使用聲學(xué)裝置連續(xù)地將這些期望產(chǎn)物與細(xì)胞分離，并且將細(xì)胞連續(xù)返回到生物反應(yīng)器。通常，含有細(xì)胞和期望產(chǎn)品的流體培養(yǎng)基通過(guò)或流過(guò)聲學(xué)裝置并且借助多維駐波(一個(gè)或多個(gè))來(lái)分離。流體培養(yǎng)基可以連續(xù)地流入裝置，其中期望的產(chǎn)品被連續(xù)地移除。聲學(xué)灌注裝置將健康的能活的細(xì)胞返回生物反應(yīng)器，同時(shí)收獲期望產(chǎn)物并使期望產(chǎn)物向下游流動(dòng)以進(jìn)行進(jìn)一步處理，例如額外的過(guò)濾、層析等。另外，生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)基被澄清，因?yàn)榧?xì)胞碎片也被允許進(jìn)入收獲物流，從而流出待循環(huán)至生物反應(yīng)器的流體培養(yǎng)基。這導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)基的總體使用量降低，相當(dāng)于大型生物反應(yīng)器每天可預(yù)期節(jié)省高達(dá)20,000美元的成本。

在各種實(shí)施例中公開(kāi)的是一種聲學(xué)灌注裝置，包括：聲學(xué)腔室；入口端口，入口流路從所述入口端口通往所述聲學(xué)腔室；出口端口，其用于將流過(guò)裝置的流體再循環(huán)回其源頭(例如生物反應(yīng)器)；至少一個(gè)收集端口，其用于收集離開(kāi)所述聲學(xué)腔室的流體的產(chǎn)物流；以及在所述至少一個(gè)收獲端口下方的所述聲學(xué)腔室中的至少一個(gè)超聲換能器，所述至少一個(gè)超聲換能器包括壓電材料，壓電材料由電壓信號(hào)驅(qū)動(dòng)以橫跨從所述聲學(xué)腔室通往至少一個(gè)收集或收獲端口的收集或收獲流路產(chǎn)生聲駐波。聲駐波可以是平面的或多維的，或者這些波的組合可以存在于聲學(xué)腔室中(通常來(lái)自多個(gè)換能器)。聲駐波可以被認(rèn)為是如下“力場(chǎng)”：其阻止全部的細(xì)胞但允許例如期望的生物分子(例如重組蛋白和/或單克隆抗體)和細(xì)胞碎片等較小的材料通過(guò)并從返回到生物反應(yīng)器的流體中移除。

出口端口通常在入口端口下方，并且通常位于裝置的底端。

如上所述，裝置可以在裝置的頂部具有一個(gè)或多個(gè)收集或收獲端口。在一些更具體的實(shí)施例中，裝置可以具有在裝置的頂端上彼此間隔開(kāi)的總共兩個(gè)收獲端口。

在特定實(shí)施例中，入口端口在裝置的第一端處位于第一高度處，所述至少一個(gè)超聲換能器處于高于第一高度的第二高度，并且底壁從入口端口延伸到出口端口。出口端口可以位于裝置的與第一端相反的第二端處。相對(duì)于入口端口和出口端口之間的連線(xiàn)，底壁可以是凹形的。該裝置可以包括在入口流路上方的上壁。入口端口、出口端口和至少一個(gè)收獲端口有時(shí)都位于裝置的前壁上。前壁本身可以是平面的(即平坦的)。

該裝置還可以包括位于所述聲學(xué)腔室中的與所述至少一個(gè)超聲換能器相對(duì)的反射器?？商娲兀b置可以具有位于收獲流路的相反兩側(cè)的、處于相同高度且相互面對(duì)的總共兩個(gè)超聲換能器，或者附加的超聲換能器可以位于收集/收獲流路的多側(cè)。反射器可以位于兩個(gè)超聲換能器之間。還可以存在適當(dāng)?shù)囟ㄎ灰孕纬善矫娴?、多維的或這種聲駐波(一個(gè)或多個(gè))的組合的多個(gè)換能器/反射器對(duì)。

在特定實(shí)施例中，聲駐波產(chǎn)生具有相同數(shù)量級(jí)的軸向力分量和橫向力分量的聲輻射力。

在本文公開(kāi)的裝置的其他實(shí)施例中，入口流路從入口端口向下通向裝置的底端并且經(jīng)過(guò)出口端口，然后向上通往聲學(xué)腔室。有時(shí)，入口端口和至少一個(gè)收獲端口都位于裝置的頂壁上，并且出口端口位于裝置的前壁上。至少一個(gè)超聲換能器可以安裝在裝置的后壁或前壁中。該聲學(xué)腔室的底壁可以是傾斜的平坦表面。反射器可以由透明材料制成。

入口流路可以被成形為在由聲駐波產(chǎn)生的聲場(chǎng)下方產(chǎn)生切向流路。在這里看到的另外的版本中，入口流路進(jìn)入裝置第一側(cè)的聲學(xué)腔室，并且出口端口位于(i)裝置的第一側(cè)，或者(ii)相反的第二側(cè)。入口端口可以位于裝置的前側(cè)，并且至少一個(gè)收獲端口可以位于裝置的頂壁上。至少一個(gè)換能器可以位于裝置的前側(cè)或后側(cè)。在更具體的實(shí)施例中，可以有兩個(gè)換能器，一個(gè)在前側(cè)，一個(gè)在后側(cè)。在另外其它的具體實(shí)施例中，在前側(cè)或后側(cè)設(shè)有超聲換能器以及與換能器相對(duì)的、位于相應(yīng)的后側(cè)或前側(cè)的反射器。

該裝置可以附接到具有用于附接的孔的安裝件。

還公開(kāi)了用于從含有細(xì)胞的流體培養(yǎng)基中分離細(xì)胞的方法。流體培養(yǎng)基流過(guò)上述結(jié)構(gòu)的具有至少一個(gè)超聲換能器的聲學(xué)灌注裝置。驅(qū)動(dòng)至少一個(gè)超聲換能器以產(chǎn)生聲駐波?？梢詮某隹诙丝谑占缓?xì)胞的流體，并且可以從至少一個(gè)收獲端口收集耗盡細(xì)胞的澄清流體。

在特定實(shí)施例中，通過(guò)收集/收獲流路的流量比通過(guò)入口流路的流量小至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。在具體的實(shí)施例中，通過(guò)入口端口進(jìn)入裝置的流體培養(yǎng)基的流量為約1升/分鐘，并且通過(guò)至少一個(gè)收集/收獲端口離開(kāi)裝置的耗盡細(xì)胞的流體的流量為約10毫升/分鐘?？商娲?，通過(guò)入口端口進(jìn)入的流量與通過(guò)至少一個(gè)收集/收獲端口離開(kāi)的流量的比率設(shè)定為使得聲駐波不被細(xì)胞的主體克服，或者換句話(huà)說(shuō)使得大量的細(xì)胞不會(huì)通過(guò)收集/收獲端口(一個(gè)或多個(gè))開(kāi)始離開(kāi)裝置。

所述方法還可以包括使用附接到裝置的至少一個(gè)收獲端口處的第一泵和附接到裝置的出口端口處的第二泵來(lái)拉動(dòng)流體培養(yǎng)基通過(guò)裝置。

本文還公開(kāi)了一種流動(dòng)裝置，其適于(i)接收含有初級(jí)流體和細(xì)胞的流動(dòng)混合物；和(ii)使用第一聲駐波從流動(dòng)混合物中連續(xù)地抽取耗盡細(xì)胞的收獲流體流，從而改變流動(dòng)混合物的細(xì)胞濃度?？梢栽诼曬v波的邊緣處產(chǎn)生壓力上升以及聲輻射力。這種“邊緣效應(yīng)”用作聲駐波邊緣處的屏障?？梢孕薷穆曬v波的頻率，使得可以阻止或允許不同的對(duì)比度因子材料穿過(guò)聲駐波。

裝置還可以包括二次流動(dòng)腔室，在二次流動(dòng)腔室中，耗盡細(xì)胞的收集流體流穿過(guò)頻率高于第一聲駐波的頻率的第二聲駐波。

本文還公開(kāi)了一種流動(dòng)裝置，包括：至少一個(gè)入口，其用于接收初級(jí)流體和細(xì)胞的流動(dòng)混合物；超聲換能器，其產(chǎn)生第一超聲波聲駐波并使用產(chǎn)生于第一超聲波聲駐波的邊緣處的壓力上升和聲輻射力，以將流動(dòng)混合物分離成初級(jí)高細(xì)胞濃度流體流和次級(jí)收獲流體流；出口端口，其用于初級(jí)高細(xì)胞濃度流體流；以及至少一個(gè)收集端口，其用于次級(jí)收獲流體流。還可以存在用于提取濃縮的流體/細(xì)胞混合物的排出端口。

裝置還可以包括二次流動(dòng)腔室，在二次流動(dòng)腔室中次級(jí)收獲流體流穿過(guò)頻率高于第一超聲波聲駐波的頻率的第二聲駐波。

下面更具體地描述這些和其它非限制性特征。

附圖說(shuō)明

以下是出于說(shuō)明本文公開(kāi)的示例性實(shí)施例的目的而不是出于對(duì)其進(jìn)行限制的目的而呈現(xiàn)的附圖的簡(jiǎn)要描述。

圖1示出了由超聲換能器和反射器產(chǎn)生的單個(gè)聲駐波。

圖2是將補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器系統(tǒng)與灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行比較的圖示。

圖3是顯示攪拌釜生物反應(yīng)器的各種組件的剖視圖。

圖4是本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置的一個(gè)示例性實(shí)施例的透視圖，其具有兩個(gè)收集或收獲端口和單個(gè)超聲換能器。

圖5示出了本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置的第二示例性實(shí)施例，其中單個(gè)反射器位于兩個(gè)超聲換能器之間。

圖6是示出與本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置聯(lián)接的灌注生物反應(yīng)器和再循環(huán)路徑的示意圖。

圖7是本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置的第三示例性實(shí)施例的正剖視圖。

圖8是圖7的聲學(xué)灌注裝置的外部透視圖。

圖9是本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置的第四示例性實(shí)施例的正剖視圖。

圖10是圖9的聲學(xué)灌注裝置的透視圖。

圖11是常規(guī)超聲換能器的縱截面圖。

圖12是本公開(kāi)的超聲換能器的縱截面圖；換能器內(nèi)存在氣隙，不存在背襯層或耐磨板。

圖13是本公開(kāi)的超聲換能器的縱截面圖；在換能器內(nèi)存在氣隙，并且存在背襯層和耐磨板。

圖14是在不同頻率下驅(qū)動(dòng)的方形換能器的電阻抗幅值對(duì)頻率的曲線(xiàn)圖。

圖15示出了從與流體流動(dòng)正交的方向觀看到的圖14的七個(gè)共振頻率(電阻抗幅值的最小值)的俘獲線(xiàn)配置。

圖16是聲壓幅值(右側(cè)標(biāo)尺，以pa為單位)和換能器平面外位移(左側(cè)標(biāo)尺，以米為單位)的計(jì)算機(jī)模擬；左側(cè)標(biāo)尺頂部的文字為“×10^-7”；向上指向的三角形所示的左側(cè)標(biāo)尺頂部的文字為“1.473×10^-6”；向下指向的三角形所示的左側(cè)標(biāo)尺底部的文字為“1.4612×10^-10”；右側(cè)標(biāo)尺頂部的文字為“×10⁶”；向上指向的三角形所示的右側(cè)標(biāo)尺頂部的文字為“1.1129×10⁶”；向下指向的三角形所示的右側(cè)標(biāo)尺底部的文字為“7.357”，三角形顯示對(duì)于給定標(biāo)尺在該圖中所示的最大值和最小值，橫軸是沿著x軸的腔室內(nèi)的位置，以英寸為單位，縱軸是沿著y軸的腔室內(nèi)的位置，以英寸為單位。

圖17示出了存在有復(fù)合波的晶體的平面內(nèi)位移和平面外位移。

圖18是與相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器進(jìn)行流體連接的本公開(kāi)的第一聲學(xué)灌注裝置的視圖，示出了將裝置的各個(gè)端口流體連接到相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器的多個(gè)軟管和將裝置的出口端口流體連接到相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器的出流泵。

圖19是圖5的另一種聲學(xué)灌注裝置的視圖，示出了在第一換能器和第二換能器之間的聲學(xué)室中的反射器；流體培養(yǎng)基也存在于裝置中，并且除了顯示出指示反射器與第一換能器和第二換能器之間的聲場(chǎng)的波之外，示出的箭頭還指示流動(dòng)方向。

圖20是顯示以?xún)煞N不同的灌注液/進(jìn)料速率從一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的流體培養(yǎng)基中除去細(xì)胞的效率的曲線(xiàn)圖。

圖21是顯示實(shí)驗(yàn)的收獲物流(也稱(chēng)為灌注液)濁度降低的曲線(xiàn)圖。

圖22是顯示對(duì)于圖20-21的曲線(xiàn)圖進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的不同流量而言細(xì)胞活力的曲線(xiàn)圖。

圖23是顯示用于另一實(shí)驗(yàn)的不同流量和流動(dòng)方法的總細(xì)胞密度和細(xì)胞保留的曲線(xiàn)圖。

圖24是顯示對(duì)于圖23的曲線(xiàn)圖進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的不同流量的細(xì)胞活力的曲線(xiàn)圖。

圖25是顯示用于另一實(shí)驗(yàn)的不同數(shù)量的超聲換能器的總細(xì)胞密度和細(xì)胞保留(cellretention)的曲線(xiàn)圖。

圖26是顯示針對(duì)圖25的曲線(xiàn)圖進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的不同數(shù)量的超聲換能器而言細(xì)胞活力的曲線(xiàn)圖。

圖27是被測(cè)試的另一種聲學(xué)灌注裝置的照片。

圖28是顯示灌注流量或換能器電壓對(duì)細(xì)胞保留的影響的曲線(xiàn)圖。

圖29a是來(lái)自vicell細(xì)胞分析儀的進(jìn)入裝置的進(jìn)料流中的粒子的顯微圖像；進(jìn)料流是含有cho細(xì)胞、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片的生物反應(yīng)器流體。圖29b是進(jìn)料的粒徑分布的曲線(xiàn)圖，示出了雙峰分布；在圖29b中，y軸是以10為間隔從0到200的粒子計(jì)數(shù)，x軸是以2為間隔從6到50的以微米為單位的粒徑；粒子的總數(shù)是5539，平均粒度為16.78微米，標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.76微米，模式(mode)粒度為10.56微米。

圖30a是離開(kāi)裝置的灌注液(或澄清的收獲物流)的顯微圖像。圖30b是灌注液的粒徑分布的曲線(xiàn)圖，其顯示出在低得多的尺寸下的單模式分布；在圖30b中，y軸是以20為間隔從0到300的粒子計(jì)數(shù)，x軸是以2為間隔從6到50的以微米為單位的粒徑，粒子的總數(shù)是2919，平均粒度為10.08微米，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.75微米，模式粒度為8.99微米。

圖31是示出了圖27的裝置內(nèi)的速度分布的cfd模型；標(biāo)尺頂部的文字為“×10^-2”，向上指向的三角形所示的標(biāo)尺頂部的文字為“0.678”，向下指向的三角形所示的標(biāo)尺底部的文字為“0”，三角形顯示對(duì)于給定標(biāo)尺在該圖中所示的最大值和最小值，標(biāo)尺以0.5為間隔從0延伸到5m/s，黑色表示標(biāo)尺頂部為5，白色表示標(biāo)尺底部為零。

圖32是圖27的裝置的正視圖，示出了流路、聲場(chǎng)和聲學(xué)邊緣效應(yīng)。

圖33是顯示兩種操作模式的圖27的聲學(xué)灌注裝置的復(fù)合照片；在左側(cè)，裝置處于啟動(dòng)或細(xì)胞沉降模式，在右側(cè)，裝置處于穩(wěn)定的細(xì)胞保留模式。

圖34示出了用于細(xì)胞保留的聲學(xué)裝置的模型模擬的幾何形狀；該模型包含兩種流體，一種是聲場(chǎng)內(nèi)的澄清流體，另一種是聲場(chǎng)、壓電換能器、鋼反射器和鋁外殼左側(cè)的高細(xì)胞密度流體；第一種流體是聲場(chǎng)內(nèi)的水，第二種流體是聲場(chǎng)外(左側(cè))水溶液中的cho細(xì)胞的15％濃度；模型中的藍(lán)色實(shí)線(xiàn)表示兩種流體之間的分離線(xiàn)。

圖35a、35b和35c是示出在幾種操作頻率下圖34的模型模擬的壓電材料、鋁外殼和鋼反射器的位移(左側(cè)標(biāo)尺)以及兩種流體中的聲壓(右側(cè)標(biāo)尺)的曲線(xiàn)圖；圖35a處于2.218mhz的頻率，圖35b處于2.2465mhz的頻率，圖35c處于2.3055mhz的頻率；對(duì)于所有三個(gè)曲線(xiàn)圖，左側(cè)標(biāo)尺頂部的文字指示讀數(shù)為“×10^-6”或“×10^-7”，以英寸為單位；右側(cè)標(biāo)尺頂部的文字指示讀數(shù)為“×10⁶”，以帕斯卡為單位；y軸以0.2的間隔從-0.8延伸到1.6，x軸以0.5的間隔從-0.5延伸到1.5。

圖36是示出在幾個(gè)操作頻率下作用在懸浮的cho細(xì)胞上的平均橫向力(n)和由功率歸一化的平均橫向力(n/w)的曲線(xiàn)圖。

圖37是本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置的照片(俯視圖)，箭頭表示流入入口端口；流出出口端口；澄清的流體從裝置的頂部流出，并且濃縮液從裝置的底部流出。

圖38是圖37的聲學(xué)灌注裝置的照片(側(cè)視圖)。

圖39是圖37的裝置的細(xì)胞保留與灌注液流量的曲線(xiàn)圖。

圖40是示出直接流過(guò)濾(dff)和切向流過(guò)濾(tff)的現(xiàn)有技術(shù)圖示。

圖41是示出灌注期間的第一種操作模式的圖，其中細(xì)胞被俘獲、聚集并與收獲物流分離，裝置豎直操作，箭頭指示重力方向。

圖42是示出灌注期間的第二操作模式的圖，其中防止細(xì)胞進(jìn)入聲駐波場(chǎng)，同時(shí)允許較小的離子通過(guò)該場(chǎng)并進(jìn)入收獲物流，裝置豎直操作，箭頭指示重力方向。

具體實(shí)施方式

通過(guò)參考以下優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述及本文包括的實(shí)例，可以更容易地理解本發(fā)明。在以下說(shuō)明書(shū)和隨后的權(quán)利要求書(shū)中，將參考定義為具有下述含義的大量術(shù)語(yǔ)。

盡管為了清楚起見(jiàn)在以下描述中使用了特定術(shù)語(yǔ)，但是這些術(shù)語(yǔ)旨在僅旨在指示用于圖示說(shuō)明而選擇的實(shí)施例的特定結(jié)構(gòu)，并且不旨在限定或限制本公開(kāi)的范圍。在以下的附圖和下面的描述中，應(yīng)當(dāng)理解，相似的數(shù)字標(biāo)號(hào)指代相似功能的組件。

除非上下文另有明確說(shuō)明，否則單數(shù)形式的“一”、“一個(gè)”和“該”也包括多個(gè)指示物。

術(shù)語(yǔ)“包含”在本文中用于要求存在所指明的組分并允許存在其它組分。術(shù)語(yǔ)“包括”應(yīng)被解釋為包括術(shù)語(yǔ)“由……組成”，其允許僅存在指明的組分以及可能由指明的組分的制造而產(chǎn)生的任何雜質(zhì)。

數(shù)值應(yīng)當(dāng)被理解為包括在被約簡(jiǎn)成相同有效數(shù)字時(shí)相同的數(shù)值以及與設(shè)定值之差比用于確定該值的本申請(qǐng)描述的常規(guī)測(cè)量技術(shù)類(lèi)型的實(shí)驗(yàn)誤差小的數(shù)值。

本文公開(kāi)的所有范圍包括所述端值并且是可獨(dú)立組合的(例如范圍“從2克到10克”包括端值2克和10克以及所有中間值)。本文公開(kāi)的范圍的端點(diǎn)和任何值不限于精確的范圍或值；它們足夠不準(zhǔn)確以包括近似這些范圍和/或值的值。

結(jié)合數(shù)量使用的修飾語(yǔ)“約”包括所述值，并具有上下文規(guī)定的含義。當(dāng)在范圍的上下文中使用時(shí)，修飾語(yǔ)“約”也應(yīng)被視為公開(kāi)由兩個(gè)端點(diǎn)的絕對(duì)值定義的范圍。例如，“約2至約10”的范圍也公開(kāi)了“從2到10”的范圍。術(shù)語(yǔ)“約”可以指所表示的數(shù)的加或減10％。例如，“約10％”可表示9％至11％的范圍，“約1”可指0.9-1.1。

應(yīng)注意的是，本文所使用的許多術(shù)語(yǔ)是相對(duì)性的術(shù)語(yǔ)。例如術(shù)語(yǔ)“上”和“下”是在位置中相對(duì)于彼此而言的，即沿給定取向，上部件位于比下部件高的位置，但是如果該設(shè)備被翻轉(zhuǎn)，則這些術(shù)語(yǔ)會(huì)發(fā)生改變。術(shù)語(yǔ)“入口”和“出口”針對(duì)相對(duì)于給定結(jié)構(gòu)而言從中流動(dòng)通過(guò)的流體，例如流體流動(dòng)通過(guò)入口而進(jìn)入該結(jié)構(gòu)，并且流體通過(guò)出口而從該結(jié)構(gòu)流出。術(shù)語(yǔ)“上游”和“下游”相對(duì)于流體流動(dòng)通過(guò)各種部件的方向而言，即流體在流動(dòng)通過(guò)下游部件之前流動(dòng)通過(guò)上游部件。應(yīng)注意的是，在一個(gè)環(huán)路中，第一組件可以被描述為同時(shí)位于第二組件的上游和下游。

術(shù)語(yǔ)“水平”和“豎直”用于表示相對(duì)于絕對(duì)基準(zhǔn)(即地面)的方向。然而，這些術(shù)語(yǔ)不應(yīng)當(dāng)被解釋為要求結(jié)構(gòu)彼此絕對(duì)平行或絕對(duì)垂直。例如第一豎直結(jié)構(gòu)和第二豎直結(jié)構(gòu)彼此不必平行。術(shù)語(yǔ)“頂部”以及“底部”或“基部”是相對(duì)于絕對(duì)基準(zhǔn)(即地球的表面)而言的，用來(lái)指頂部總是高于底部/基部的表面。術(shù)語(yǔ)“向上”和“向下”同樣相對(duì)于絕對(duì)基準(zhǔn)而言；向上始終克服地球的重力。

本發(fā)明提到“相同的數(shù)量級(jí)”。如果較大數(shù)字除以較小數(shù)字得到的商為小于10的值，則這兩個(gè)數(shù)字具有相同的數(shù)量級(jí)。

生物反應(yīng)器可用于制備如重組蛋白或單克隆抗體等生物分子。極其常見(jiàn)的是，將細(xì)胞在具有培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器容器中培養(yǎng)以產(chǎn)生期望產(chǎn)物，然后通過(guò)在聲學(xué)灌注裝置(例如本公開(kāi)的裝置)中從細(xì)胞和培養(yǎng)基中進(jìn)行分離來(lái)獲得期望產(chǎn)物。聲學(xué)過(guò)濾裝置允許提取出一些期望產(chǎn)物、培養(yǎng)基的一小部分和小于細(xì)胞的細(xì)胞碎片/碎屑，其余的被再循環(huán)回生物反應(yīng)器(特別是細(xì)胞)。使用包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)、ns0雜交瘤細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(bhk)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和人細(xì)胞(例如t細(xì)胞、b細(xì)胞、干細(xì)胞、血紅細(xì)胞)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物以及活/生物細(xì)胞通常被證明是生產(chǎn)/表達(dá)用于如藥物或疫苗等各種應(yīng)用的重組蛋白和單克隆抗體的非常有效的方式。存在兩種一般類(lèi)型的生物反應(yīng)器過(guò)程：補(bǔ)料分批和灌注。

雖然補(bǔ)料分批反應(yīng)器目前是規(guī)范，主要是由于許多科學(xué)家和技術(shù)人員對(duì)該過(guò)程的熟悉程度，灌注技術(shù)的發(fā)展速度非?？?。許多因素有利于使用灌注生物反應(yīng)器過(guò)程，主要是因?yàn)樗欣谶B續(xù)生產(chǎn)。灌注生物反應(yīng)器的資本和啟動(dòng)成本較低，需要較小的上游和下游容量，產(chǎn)量可以更高，過(guò)程是持續(xù)的，并且該過(guò)程與補(bǔ)料分批方法相比使用更小的體積和更少的種子步驟。灌注生物反應(yīng)器過(guò)程也更適合開(kāi)發(fā)、擴(kuò)大規(guī)模、優(yōu)化、參數(shù)敏感性研究和驗(yàn)證。

灌注生物反應(yīng)器也可用于產(chǎn)生將被用于細(xì)胞治療過(guò)程的細(xì)胞。在這種灌注生物反應(yīng)器中，如cart細(xì)胞、jurkatt細(xì)胞等生物細(xì)胞在灌注生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。在本公開(kāi)的灌注裝置中使用的聲駐波可以用于在轉(zhuǎn)染過(guò)程之后分離能活的細(xì)胞和不能活的細(xì)胞。這允許用這種t細(xì)胞療法接種患者的療效得到改善，因?yàn)閮H使用能活的細(xì)胞。通過(guò)灌注過(guò)程將不能活的細(xì)胞和細(xì)胞碎片分離出來(lái)，這些物質(zhì)進(jìn)入二次流并離開(kāi)生物反應(yīng)器。

灌注生物反應(yīng)器技術(shù)的最新發(fā)展也有利于其使用?？刂萍夹g(shù)和一般支持設(shè)備正在改善灌注生物反應(yīng)器，增加灌注過(guò)程的穩(wěn)定性。灌注過(guò)程現(xiàn)在可以擴(kuò)大到具有高達(dá)1000升(l)的體積的生物反應(yīng)器。用于灌注生物反應(yīng)器的更好的細(xì)胞保留系統(tǒng)產(chǎn)生比以前所見(jiàn)更低的細(xì)胞損失和更大的細(xì)胞密度。與約2000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的補(bǔ)料分批細(xì)胞密度相比，現(xiàn)在可以實(shí)現(xiàn)大于5000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。較低的污染和感染率提高了灌注生物反應(yīng)器的產(chǎn)量。因此，灌注過(guò)程導(dǎo)致收獲物中產(chǎn)物濃度更高、產(chǎn)量更高而成本未顯著增加。

因?yàn)閬?lái)自表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物的生物分子的連續(xù)生產(chǎn)以及在該過(guò)程中所述生物分子在收獲前的更短停留時(shí)間，灌注生物反應(yīng)器是特別有吸引力的。靶細(xì)胞因過(guò)濾過(guò)程(例如切向流過(guò)濾(tff)或交替切向流過(guò)濾(atf))被阻止，同時(shí)從灌注生物反應(yīng)器中提取表達(dá)的生物分子。然后將細(xì)胞返回生物反應(yīng)器以確保它們接收營(yíng)養(yǎng)和氧氣以維持整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生。在灌注反應(yīng)器過(guò)程中，細(xì)胞繼續(xù)繁殖，因此在整個(gè)灌注生產(chǎn)過(guò)程中還需要排出一些細(xì)胞培養(yǎng)物群。

tff過(guò)濾過(guò)程和atf過(guò)濾過(guò)程具有幾個(gè)問(wèn)題，例如生物分子產(chǎn)物的堵塞/結(jié)垢和損失(特別是在高細(xì)胞密度下)，這些都與過(guò)濾中使用的中空纖維膜的性質(zhì)直接相關(guān)。因此，期望找到不堵塞并最小化期望生物分子產(chǎn)物的損失的新過(guò)濾工藝。此外，tff和atf將保留生物反應(yīng)器內(nèi)的所有細(xì)胞碎片和細(xì)粒，這是不希望的。因此，能夠區(qū)分細(xì)胞保留同時(shí)允許細(xì)胞碎片和細(xì)粒通過(guò)的工藝可能是有利的。

簡(jiǎn)而言之，本公開(kāi)涉及能夠從一個(gè)或多個(gè)壓電換能器產(chǎn)生多維聲駐波的聲學(xué)灌注裝置，其中換能器電氣地使得它們以多模式位移模式移動(dòng)，而不是以“活塞”振動(dòng)模式移動(dòng)。通過(guò)這種聲駐波產(chǎn)生方式，產(chǎn)生比以?xún)H產(chǎn)生一個(gè)大駐波的“活塞”模式激發(fā)壓電換能器的情況下更高的橫向俘獲力。因此，以與壓電換能器相同的輸入功率，多維聲駐波與平面聲駐波相比可具有更高的橫向俘獲力。輸入功率可調(diào)節(jié)為受控流量。這可以用于促進(jìn)來(lái)自生物反應(yīng)器的流體流的蛋白質(zhì)流體純化。可替代地，聲駐波也可以是平面駐波，其中壓電換能器在活塞模式下被激發(fā)，產(chǎn)生平面波。聲駐波也可以是平面聲駐波和多維聲駐波的組合。所有這些駐波產(chǎn)生“邊緣效應(yīng)”，使得來(lái)自生物反應(yīng)器的細(xì)胞被阻止，并且允許從細(xì)胞、細(xì)胞碎片和小碎屑表達(dá)的生物分子產(chǎn)物通過(guò)。

聲泳(acoustophoresis)是從流體分散物中分離粒子的低功率、無(wú)壓降、無(wú)堵塞的固態(tài)方法(即，其用于實(shí)現(xiàn)更典型地用多孔過(guò)濾器進(jìn)行的分離，但是它沒(méi)有過(guò)濾器的缺點(diǎn))。特別地，本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置適于與用于具有高流量的流動(dòng)系統(tǒng)中的分離的大尺度生物反應(yīng)器一起使用。聲學(xué)灌注裝置被設(shè)計(jì)成產(chǎn)生高強(qiáng)度的多維超聲波駐波，多維超聲波駐波產(chǎn)生能夠在低流量下克服流體阻力以及浮力或重力的組合作用的聲輻射力。結(jié)果，輻射力用作防止目標(biāo)粒子(例如，生物細(xì)胞)與駐波平面交叉的過(guò)濾器。如上所述，駐波的俘獲能力可以根據(jù)需要改變，例如通過(guò)改變流體的流量、聲輻射力和聲學(xué)過(guò)濾裝置的形狀，以通過(guò)俘獲和沉降使細(xì)胞保留最大。該技術(shù)為分離二次相提供了綠色和可持續(xù)的替代方案，而且大大降低了能源成本。對(duì)于小至1微米的粒度，已經(jīng)證明了優(yōu)異的粒子分離效率。

通常，聲場(chǎng)在粒子上的散射導(dǎo)致作為三維俘獲場(chǎng)的三維聲輻射力。當(dāng)粒子相對(duì)于波長(zhǎng)較小時(shí)，聲輻射力與粒子體積(例如，半徑的立方)成比例。它與頻率和聲學(xué)對(duì)比因子(acousticcontrastfactor)成比例。它還與聲能(例如，聲壓幅值的平方)成比例。對(duì)于諧波激發(fā)，力的正弦空間變化將粒子驅(qū)動(dòng)到駐波內(nèi)的穩(wěn)定位置。當(dāng)施加在粒子上的聲輻射力比流體阻力和浮力/重力的組合作用更強(qiáng)時(shí)，粒子被俘獲在聲駐波場(chǎng)內(nèi)。橫向和軸向聲力對(duì)俘獲的粒子的作用導(dǎo)致因增強(qiáng)的重力(比宿主流體(hostfluid)重的粒子)或浮力(比宿主流體輕的粒子)沉降的粒子的濃縮、附聚和/或聚結(jié)而形成緊密堆積的簇。另外，二次粒子間力，如bjerkness力，有助于粒子附聚。

大多數(shù)生物細(xì)胞類(lèi)型具有比懸浮著這些生物細(xì)胞的培養(yǎng)基更高的密度和更低的可壓縮性，使得細(xì)胞和培養(yǎng)基之間的聲學(xué)對(duì)比因子具有正值。結(jié)果，軸向聲輻射力(arf)將細(xì)胞向駐波壓力波節(jié)驅(qū)動(dòng)。聲輻射力的軸向分量將具有正對(duì)比因子的細(xì)胞驅(qū)動(dòng)到壓力節(jié)面(nodalplane)，而具有負(fù)對(duì)比因子的細(xì)胞或其它粒子被驅(qū)動(dòng)到壓力波腹面(anti-nodalplane)。聲輻射力的徑向或橫向分量是俘獲細(xì)胞的力。arf的徑向或橫向分量大于流體阻力和重力的組合作用。對(duì)于小細(xì)胞或乳劑，阻力fd可表示為：

其中uf和up是流體和細(xì)胞速度，rp是粒徑，μf和μp是流體和細(xì)胞的動(dòng)態(tài)粘度，并且是動(dòng)態(tài)粘度的比率。浮力fb表示為：

對(duì)于要被俘獲在多維超聲波駐波中的細(xì)胞，細(xì)胞上的力平衡必須為零，因此可以找到用于橫向聲輻射力flrf的表達(dá)式，其由下式給出：

flrf＝fd+fb。

對(duì)于已知尺寸和材料性質(zhì)的細(xì)胞，并且對(duì)于給定的流量，該等式可用于估計(jì)橫向聲輻射力的大小。

用于計(jì)算聲輻射力的理論模型是基于由戈?duì)柨品?gor'kov)開(kāi)發(fā)的公式。主聲輻射力fa被定義為場(chǎng)勢(shì)u的函數(shù)，

其中場(chǎng)勢(shì)u被定義為

f1和f2是單極子和偶極子貢獻(xiàn)，由下式定義

其中p是聲壓，u是流體粒子速度，λ是細(xì)胞密度ρp與流體密度ρf的比率，σ是細(xì)胞聲速cp與流體聲速cf的比率，vo是細(xì)胞的體積，而<>表示波周期的時(shí)間平均。

戈?duì)柨品虻睦碚摫幌拗圃谙鄬?duì)于流體和粒子中的聲場(chǎng)的波長(zhǎng)而言為小的粒度，并且也沒(méi)有考慮到流體和粒子的粘度對(duì)輻射力的影響。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于計(jì)算粒子的聲輻射力的附加數(shù)值模型，對(duì)于相對(duì)于波長(zhǎng)的粒度沒(méi)有任何限制。這些模型還包括流體和粒子粘度的影響，因此更準(zhǔn)確地計(jì)算聲輻射力。實(shí)施的模型基于yuriiilinskii和evgeniazabolotskaya的理論操作，如aipconferenceproceedings，vol.1474-1，pp.255-258(2012)中所描述的。

期望地，超聲換能器(一個(gè)或多個(gè))在流體中產(chǎn)生多維駐波，其在懸浮粒子上施加橫向力以伴隨軸向力。在文獻(xiàn)中公布的典型結(jié)果表明，橫向力比軸向力小兩個(gè)數(shù)量級(jí)。相比之下，本申請(qǐng)中公開(kāi)的技術(shù)提供了與軸向力相同數(shù)量級(jí)的橫向力。然而，在本文進(jìn)一步描述的某些實(shí)施例中，該裝置使用產(chǎn)生多維聲駐波的換能器和產(chǎn)生平面聲駐波的換能器。為了本公開(kāi)的目的，橫向力與軸向力數(shù)量級(jí)不同的駐波被認(rèn)為是“平面聲駐波”。由本公開(kāi)的超聲換能器(一個(gè)或多個(gè))產(chǎn)生的總聲輻射力(arf)的橫向力分量是顯著的，并且足以克服高達(dá)1cm/s的線(xiàn)性速度下的流體阻力，并且產(chǎn)生緊密堆積的簇，并且與總聲輻射力的軸向力分量具有相同的數(shù)量級(jí)。

將本公開(kāi)的技術(shù)與現(xiàn)有的過(guò)濾技術(shù)進(jìn)行對(duì)比可能是有幫助的。圖40顯示了兩種現(xiàn)有技術(shù)的過(guò)濾方法。圖40的左側(cè)示出了直接流過(guò)濾(dff)。在dff中，流體和粒子的整個(gè)進(jìn)料流4005被引向過(guò)濾器。過(guò)濾器4010阻止大于過(guò)濾器孔徑的粒子4020，而較小粒子4030和流體通過(guò)過(guò)濾器。圖40的右側(cè)示出了切向流過(guò)濾(tff)。在tff中，進(jìn)料流不朝向過(guò)濾器。相反，進(jìn)料流切向地朝向過(guò)濾器，使得大部分進(jìn)料流在過(guò)濾器表面上切向地通過(guò)。通常，該進(jìn)料流被再循環(huán)以多于一次通過(guò)過(guò)濾器。更小的濾液流4006被拉動(dòng)穿過(guò)含有較小粒子4030的過(guò)濾膜。tff相比于dff的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是切向流減少了過(guò)濾器的堵塞和結(jié)垢以及位于過(guò)濾器頂部的凝膠層的形成。

在本公開(kāi)的裝置中，在啟動(dòng)期間，通過(guò)俘獲細(xì)胞并將其生長(zhǎng)成緊密堆積的簇的過(guò)程來(lái)澄清由聲駐波聲透射的流體，使得發(fā)生細(xì)胞簇的連續(xù)重力分離。由于有限量的新細(xì)胞流入該體積，這導(dǎo)致經(jīng)受聲駐波的流體的快速澄清。當(dāng)達(dá)到該狀態(tài)時(shí)，該系統(tǒng)可以被描述為包括兩種流體：含有期望產(chǎn)物和小細(xì)胞碎片/碎屑的第一流體(已經(jīng)通過(guò)聲駐波)，以及含有生物反應(yīng)器流體和所有細(xì)胞的第二流體(被聲駐波阻止)。兩種流體可能具有不同的有效聲學(xué)特性，例如聲密度和聲速，這兩種流體之間具有良好限定的界面。界面通常位于聲駐波場(chǎng)的下邊緣附近，產(chǎn)生“聲學(xué)邊緣效應(yīng)”。第一流體(即，已經(jīng)被澄清并包含產(chǎn)物、一些細(xì)胞和細(xì)胞碎片的流體)在界面的下游，并且代表收獲物流并且占據(jù)由聲駐波場(chǎng)所聲透射的流體的體積。第二流體(即含有生物反應(yīng)器流體和大部分細(xì)胞的流體)在界面的上游。這兩種不同的流體可以在圖33中看到。

聲駐波場(chǎng)在兩個(gè)流體之間的界面上施加聲輻射壓力(即壓力上升)和聲場(chǎng)的聲學(xué)邊緣處的力，從而阻止上游細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)。界面上出現(xiàn)的輻射壓力和該力允許包含產(chǎn)物的第一流體通過(guò)界面，同時(shí)將細(xì)胞保留在上游流體中。借助在兩種流體之間的界面處的聲輻射力的作用阻止的細(xì)胞可以連續(xù)地返回到生物反應(yīng)器，以確保它們接收營(yíng)養(yǎng)和氧氣以維持整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生。

界面下方的流場(chǎng)的循環(huán)運(yùn)動(dòng)把由聲場(chǎng)保留的細(xì)胞傳送回生物反應(yīng)器。循環(huán)流動(dòng)由初級(jí)再循環(huán)流驅(qū)動(dòng)，并可通過(guò)聲學(xué)腔室?guī)缀巫兓M(jìn)行優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)最大的系統(tǒng)效率。這將在下面參考圖33進(jìn)一步討論。

在灌注期間，本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置具有多種可能的操作模式。這些模式之一可能在裝置中占主導(dǎo)，或者它們可以同時(shí)發(fā)生，這取決于裝置內(nèi)的細(xì)胞和流體的分布。在圖41所示的第一操作模式(模式1)中，含有細(xì)胞的流體4020(亮色)進(jìn)入聲駐波場(chǎng)4040，聲駐波場(chǎng)4040在此產(chǎn)生于換能器4008與反射器4009之間。多維聲駐波在特定點(diǎn)俘獲細(xì)胞，將細(xì)胞打包成緊密堆積的簇4022，并通過(guò)增強(qiáng)的重力沉降來(lái)連續(xù)地分離簇。細(xì)胞簇沉降，進(jìn)入切向流路(由箭頭4001指示)，并通過(guò)再循環(huán)流重導(dǎo)向到生物反應(yīng)器。較小的粒子4030(較暗的顏色)不被聲駐波所俘獲并穿過(guò)聲駐波，以便被收獲。收獲物流動(dòng)方向由箭頭4002表示。該裝置的取向是重要的，并且也示出了重力方向。

在圖42中示出了第二種操作模式(模式2)，其中聲泳系統(tǒng)為細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)的屏障并且防止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)。這里，通過(guò)聲駐波的邊緣效應(yīng)，在兩種流體之間建立了細(xì)胞的屏障。第一澄清流體流4050包含收獲物流以及在聲駐波場(chǎng)內(nèi)的較小粒子/期望副產(chǎn)物4030。第二流體流4055在聲駐波場(chǎng)的上游包含保留的細(xì)胞4020。收獲物流動(dòng)方向由箭頭4002表示。在這種操作模式中，實(shí)現(xiàn)了聲學(xué)邊緣效應(yīng)(由虛線(xiàn)4007表示)。非常典型地，聲學(xué)邊緣效應(yīng)阻止細(xì)胞并防止它們進(jìn)入聲場(chǎng)，而包含產(chǎn)生的生物分子和細(xì)胞碎片的流體流的一部分被允許穿過(guò)由聲學(xué)邊緣產(chǎn)生的屏障。在聲學(xué)邊緣下方的切向流路(箭頭4001)收集保留的細(xì)胞并使它們流回到主再循環(huán)流中并返回到生物反應(yīng)器。這也將在下面參考圖32進(jìn)一步討論。此外，示出了重力方向。

在灌注應(yīng)用中，聲泳裝置的設(shè)置類(lèi)似于tff的設(shè)置。含有細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)粒和產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))的進(jìn)料流從生物反應(yīng)器流入灌注系統(tǒng)。流的一部分沿著聲駐波的下邊緣以切向方式流動(dòng)并且再循環(huán)回到生物反應(yīng)器。較小部分的進(jìn)料流被收獲，即轉(zhuǎn)向并流動(dòng)穿過(guò)聲駐波。這里，聲駐波功能與tff中的過(guò)濾器非常相似，防止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)。收獲物流含有較小的粒子，例如細(xì)胞碎屑和細(xì)粒以及期望的生物分子產(chǎn)物。由聲駐波保留的細(xì)胞通過(guò)再循環(huán)流輸送回生物反應(yīng)器。在本文中進(jìn)一步討論的圖32還示出了使用切向流動(dòng)流的灌注裝置。

與細(xì)胞澄清或油/水應(yīng)用相反，灌注應(yīng)用通常需要高細(xì)胞密度，例如>5000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml以及較低的收獲速度。兩種流體流也具有不同的有效聲學(xué)特性，即聲速和培養(yǎng)基/細(xì)胞混合物的密度。隨著細(xì)胞密度增加，兩種流體流的聲學(xué)特性差異也將更加顯著。聲駐波場(chǎng)現(xiàn)在將在富含細(xì)胞的第二流體流上施加聲輻射壓力，即壓力上升，并在懸浮在流體中的細(xì)胞上施加聲輻射力。該輻射壓力和輻射力作用在兩種流體之間的與聲場(chǎng)的上游邊緣重合的界面處。當(dāng)聲輻射力的這種“聲學(xué)邊緣”效應(yīng)足夠強(qiáng)時(shí)，它將防止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)。同樣重要的是收集保留的細(xì)胞并將其運(yùn)送回生物反應(yīng)器的切向流路。

聲學(xué)邊緣效應(yīng)也可以被稱(chēng)為聲壁效應(yīng)，并且由聲場(chǎng)的邊緣對(duì)懸浮的粒子施加強(qiáng)的橫向力而產(chǎn)生，即在收獲物流的方向上并且垂直于聲駐波的軸線(xiàn)，從而阻止相對(duì)較大尺寸的粒子進(jìn)入聲場(chǎng)并且僅允許澄清的流體(即含有較小尺寸的產(chǎn)物的流體)進(jìn)入聲場(chǎng)，從而產(chǎn)生聲學(xué)灌注細(xì)胞保留裝置。以這種方式，只有澄清的流體才能逸出，細(xì)胞被輻射力保持。這個(gè)力從來(lái)不是正的，這意味著它總是將細(xì)胞保持在界面處，即，力作用在上游流動(dòng)方向上，不允許它們逃逸聲學(xué)邊緣。功率曲線(xiàn)中的多個(gè)峰值(參見(jiàn)下面的圖37的討論)示出了存在多種操作模式，包括平面共振模式和多維操作模式，表明這種類(lèi)型的操作同樣可以通過(guò)利用平面駐波和多重駐波來(lái)產(chǎn)生。在具有1”×1”尺寸的系統(tǒng)中，每30khz存在平面共振。圖37顯示了表明存在多維模式的額外峰值的證據(jù)。每單位功率，這些模式可以與平面共振模式同等有效或甚至更有效。如上所述，然后可以通過(guò)流場(chǎng)的擦洗運(yùn)動(dòng)(即，在界面下方的再循環(huán)流)來(lái)拾取由聲輻射力阻擋的細(xì)胞，并且這些細(xì)胞連續(xù)地返回到生物反應(yīng)器，以確保它們接收營(yíng)養(yǎng)和氧氣來(lái)保持整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生。

澄清的流體含有期望產(chǎn)物和細(xì)胞碎片，所有這些都小于全部能活的細(xì)胞。以這種方式，返回到生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基澄清細(xì)胞碎片。細(xì)胞碎片在不產(chǎn)生期望產(chǎn)物的情況下吸收培養(yǎng)基，使灌注過(guò)程效率降低。因此，通過(guò)使用本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置去除這些細(xì)胞碎片而獲得了效率增益和成本節(jié)省?？梢允褂冒愿哳l率操作的另一換能器-反射器對(duì)的第二裝置或二次流動(dòng)腔室在下游實(shí)現(xiàn)澄清流體的進(jìn)一步澄清。以與上述相同的方式，這樣俘獲并附聚尺寸約為10微米或更小的可能意外通過(guò)原始聲駐波的粒子。可以使用在3mhz至20mhz的更高頻率下操作的另一個(gè)換能器-反射器對(duì)來(lái)俘獲、附聚和脫離出已經(jīng)通過(guò)初始聲駐波和“邊緣效應(yīng)”的小細(xì)胞碎片和碎屑。含有期望生物分子的這種三重澄清流體可以隨后直接進(jìn)入無(wú)菌過(guò)濾器。例如，原始聲學(xué)灌注裝置可以在高達(dá)約4mhz的頻率下操作。可以想到，該第二和第三聲駐波場(chǎng)的頻率將為約6mhz至約20mhz，并且可能更高，以俘獲較小尺寸的細(xì)胞碎片。

在低細(xì)胞密度(例如200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)的生物反應(yīng)器啟動(dòng)期間，所描述的第一操作模式占主導(dǎo)地位(圖33，左圖)。當(dāng)生物反應(yīng)器中的細(xì)胞密度隨時(shí)間而增加時(shí)，操作模式逐漸從模式1切換到模式2，并且兩種模式可以同時(shí)共存。

當(dāng)使用聲駐波在具有已經(jīng)高的細(xì)胞密度(例如，5000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)的生物反應(yīng)器中灌注時(shí)，該裝置通常以第一操作模式(圖33，左圖)開(kāi)始，直到澄清聲駐波內(nèi)的流體體積，此時(shí)操作逐漸切換到所描述的第二操作模式(圖33，右圖)。有時(shí)，在操作中，通常表現(xiàn)為兩種流體之間的界面的擾動(dòng)或振蕩的不穩(wěn)定性可能增長(zhǎng)得足夠強(qiáng)，使得細(xì)胞進(jìn)入聲駐波內(nèi)的流體體積，此時(shí)在短時(shí)間內(nèi)，裝置以組合的操作模式起作用，其中兩種模式都是有效的(即，如上所述，邊緣效應(yīng)防止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)，而聲場(chǎng)澄清已經(jīng)進(jìn)入聲駐波場(chǎng)內(nèi)的流體體積的細(xì)胞)。一旦緊密堆積的細(xì)胞簇已經(jīng)沉降(即，一旦聲駐波中的流體體積已被充分地澄清)，操作模式于是再次是包括聲學(xué)邊緣效應(yīng)的所描述的第二操作模式。重要的是要注意，如上所述，裝置可以在兩種/任一種操作模式下操作，而無(wú)需進(jìn)行外部切換。換句話(huà)說(shuō)，流體流的性質(zhì)(例如流中的細(xì)胞濃度)和聲場(chǎng)決定了哪個(gè)模式占主導(dǎo)地位。

與先前在文獻(xiàn)中描述的現(xiàn)有的聲學(xué)過(guò)濾器的使用相比，本公開(kāi)的聲駐波灌注裝置的操作方式不同。以前，操作聲泳，使得產(chǎn)生蛋白質(zhì)的材料，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(cho細(xì)胞)(重組蛋白治療劑工業(yè)生產(chǎn)中最常用的宿主)，被俘獲在超聲駐波內(nèi)(即保留在靜止位置)。通過(guò)使各個(gè)細(xì)胞向平面聲駐波的壓力節(jié)面遷移而將細(xì)胞保留在聲場(chǎng)中。在那里，由于細(xì)胞被保留在駐波中，所以還對(duì)流過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行物理擦洗，由此當(dāng)它們與已經(jīng)保持在駐波內(nèi)的細(xì)胞接觸時(shí)，更多的細(xì)胞被俘獲。然后間歇地關(guān)閉駐波，以使細(xì)胞從駐波中脫離出來(lái)并返回生物反應(yīng)器。

相反，在本公開(kāi)中，超聲波駐波被用作毯子(blanket)或選擇器或“力場(chǎng)”。流體流過(guò)灌注裝置，使得重力首先用作在生物細(xì)胞上，導(dǎo)致它們下沉，而不是將生物細(xì)胞俘獲在駐波之內(nèi)。在過(guò)濾裝置的頂部附近產(chǎn)生駐波，并且起到過(guò)濾器的作用，以防止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)并通過(guò)過(guò)濾裝置的頂部離開(kāi)(即，作用類(lèi)似于阻止細(xì)胞進(jìn)入聲場(chǎng)的力場(chǎng))。因此，產(chǎn)生兩個(gè)輸出流，一個(gè)輸出流保留細(xì)胞并通過(guò)裝置底部的端口排出，另一個(gè)輸出流在細(xì)胞中耗盡，并通過(guò)裝置頂部的端口排出(將兩個(gè)輸出流中的細(xì)胞濃度彼此進(jìn)行比較)。這幾乎不依賴(lài)于聲場(chǎng)內(nèi)的細(xì)胞的附聚，從而在某些應(yīng)用中特別有利，這是因?yàn)椴恍枰晫W(xué)過(guò)濾裝置中的細(xì)胞的保留時(shí)間。

換句話(huà)說(shuō)，聲學(xué)灌注裝置具有以不同流速流動(dòng)的兩個(gè)流體流。攜帶表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、產(chǎn)物和其他生物反應(yīng)器成分的主要流體流進(jìn)入該裝置并部分轉(zhuǎn)入次級(jí)的較低體積的較低流量的流體流。該次級(jí)流體流穿過(guò)多維聲駐波，其中多維聲駐波(或通常為聲駐波)阻止主要細(xì)胞培養(yǎng)物，并允許表達(dá)的生物分子、單克隆抗體和重組蛋白連同其他小粒子如亞微米和微米尺寸的細(xì)胞碎屑一起通過(guò)并在生物反應(yīng)器外部/下游進(jìn)一步被收集和處理。然后將含有主要細(xì)胞培養(yǎng)物的主要流體流再循環(huán)回生物反應(yīng)器。

在另一個(gè)應(yīng)用中，聲學(xué)灌注裝置可以用作用于細(xì)胞治療應(yīng)用的保留裝置和細(xì)胞清洗裝置。在連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中，例如自體和同種異體細(xì)胞治療，有必要純化、隔離、然后增殖最初以非常低的細(xì)胞密度收獲的細(xì)胞。相對(duì)較少的細(xì)胞在生物反應(yīng)器中接種，其中細(xì)胞數(shù)必須增加。對(duì)于各種應(yīng)用，都需要諸如濃縮、清洗和培養(yǎng)基交換的進(jìn)一步處理步驟。所有這些應(yīng)用中的共同點(diǎn)是需要連續(xù)地循環(huán)、添加和/或移除培養(yǎng)基，同時(shí)將細(xì)胞保留在生物反應(yīng)器(可能是傳統(tǒng)型的或單次使用型的)中，而不影響其生存力。本文所述的聲學(xué)細(xì)胞保留系統(tǒng)在一定范圍的細(xì)胞再循環(huán)速率下操作，在一定范圍的灌注(或培養(yǎng)基移除速率)下高效地保留細(xì)胞，并且可被調(diào)整以通過(guò)功率或頻率操縱完全保留或選擇性地傳遞一定百分比的細(xì)胞。功率和流量都可以被監(jiān)控并用作自動(dòng)化控制系統(tǒng)中的反饋。還可以使用特定的流路，使得主要流體流的小體積被“啜飲(sipoff)”并且表達(dá)的生物分子與主要細(xì)胞培養(yǎng)物分離。

聲泳的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是聲輻射力不會(huì)傷害或有害地影響生物細(xì)胞或期望的生物分子產(chǎn)物。此外，灌注是連續(xù)的，使得細(xì)胞培養(yǎng)物保持能活且可以從其中連續(xù)回收期望的產(chǎn)物。

在灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，期望能夠?qū)⒛芑畹纳锛?xì)胞從流體流中的表達(dá)材料(即細(xì)胞培養(yǎng)基)和細(xì)胞碎屑中過(guò)濾和分離出來(lái)。如前所述，這樣的生物細(xì)胞可以包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞，其細(xì)胞基因組被操縱以表達(dá)大的生物分子。這樣的生物分子可以包括重組蛋白或單克隆抗體，并且是要回收的期望產(chǎn)物。

本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置被設(shè)計(jì)成保持可以充當(dāng)過(guò)濾器的高強(qiáng)度多維聲駐波，從而允許更小的粒子(例如重組蛋白質(zhì)或細(xì)胞碎屑)通過(guò)，同時(shí)排除較大的粒子(如能活的細(xì)胞)。通常，裝置由振蕩器和放大器(未示出)驅(qū)動(dòng)，并且裝置性能由計(jì)算機(jī)(未示出)監(jiān)視和控制。有時(shí)由于聲流可能需要調(diào)制駐波的頻率或電壓幅值。這可以通過(guò)幅度調(diào)制和/或通過(guò)頻率調(diào)制來(lái)完成。也可以利用駐波傳播的占空比來(lái)獲得某些結(jié)果(即聲波束可以在不同的時(shí)間段或以不同的速率接通和關(guān)斷)。

圖1示出了由設(shè)置為共振以形成駐波102的反射器板101和超聲換能器103組成的單駐波系統(tǒng)100。通常由換能器103施加在100khz至100mhz的范圍內(nèi)的激發(fā)頻率。在換能器103和反射器101之間產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)多維駐波。理想的駐波是頻率和強(qiáng)度相等并且在相反方向上(即從換能器到反射器以及返回)行進(jìn)的兩個(gè)傳播波的總和。傳播波相互相長(zhǎng)干涉，從而產(chǎn)生駐波。虛線(xiàn)105用于表示波的零幅值。波節(jié)是波具有最小幅值的點(diǎn)，并且用附圖標(biāo)記107表示。波腹點(diǎn)是波具有最大幅值的點(diǎn)，并且用附圖標(biāo)記109表示。

圖2是將補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器系統(tǒng)201(左側(cè))與灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)202(右側(cè))進(jìn)行比較的示意圖。從左側(cè)的補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器開(kāi)始描述，生物反應(yīng)器210包括反應(yīng)容器220。細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)進(jìn)料入口222饋送到反應(yīng)容器中。攪拌器225用于使培養(yǎng)基在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中循環(huán)。這里，將攪拌器描繪為一組旋轉(zhuǎn)葉片，但是可以考慮引起循環(huán)的任何類(lèi)型的系統(tǒng)。生物反應(yīng)器允許種子培養(yǎng)物通過(guò)生長(zhǎng)/生產(chǎn)周期生長(zhǎng)，在此期間，碎屑、廢物和不可用的細(xì)胞將在生物反應(yīng)器中積聚，并且也將會(huì)產(chǎn)生期望產(chǎn)物(例如生物分子，如單克隆抗體、重組蛋白質(zhì)、激素等)。由于這種積聚，補(bǔ)料分批過(guò)程的反應(yīng)容器通常比灌注過(guò)程中的反應(yīng)容器大得多。然后在生產(chǎn)周期結(jié)束時(shí)收獲期望產(chǎn)物。反應(yīng)容器220還包括用于去除材料的出口224。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)而描述右側(cè)的灌注生物反應(yīng)器202，同樣，生物反應(yīng)器包括具有用于細(xì)胞培養(yǎng)基的進(jìn)料入口222的反應(yīng)容器220。攪拌器225用于使培養(yǎng)基在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中循環(huán)。反應(yīng)容器的出口224流體連接到本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置230的入口232，并將生物反應(yīng)器內(nèi)容物(包含細(xì)胞和期望產(chǎn)物)連續(xù)地供給到過(guò)濾裝置。灌注裝置位于反應(yīng)容器的下游，并將期望產(chǎn)物與細(xì)胞分離。聲學(xué)灌注裝置230具有兩個(gè)單獨(dú)的出口：產(chǎn)物出口234和再循環(huán)物出口236。產(chǎn)物出口234將聲學(xué)灌注裝置230流體地連接到灌注裝置下游的容納容器240，容納容器240從灌注裝置接收期望產(chǎn)物(加上培養(yǎng)基)的流動(dòng)。從此處，可進(jìn)一步進(jìn)行處理/純化以隔離/回收期望產(chǎn)物。例如，在該聲學(xué)灌注裝置的更下游，可以設(shè)置附加的過(guò)濾器，例如atf、tff、深度過(guò)濾器、離心機(jī)等。再循環(huán)物出口236將聲學(xué)灌注裝置230向回流體地連接到反應(yīng)容器220的再循環(huán)物入口226，并用于將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基送回反應(yīng)容器中以繼續(xù)生長(zhǎng)/生產(chǎn)。換句話(huà)說(shuō)，在反應(yīng)容器和灌注裝置之間存在流體回路。灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)202中的反應(yīng)容器220具有連續(xù)的產(chǎn)物生產(chǎn)能力，因此可以變得更小。過(guò)濾過(guò)程對(duì)灌注生物反應(yīng)器的生產(chǎn)能力至關(guān)重要。較差的過(guò)濾過(guò)程將僅允許低生產(chǎn)能力并導(dǎo)致期望產(chǎn)物的低產(chǎn)量。

圖3是可用于本公開(kāi)的系統(tǒng)的通用生物反應(yīng)器300的縱截面圖。如圖所示，生物反應(yīng)器包括具有內(nèi)部體積323的反應(yīng)容器320。容器頂部的進(jìn)料入口322用于將細(xì)胞培養(yǎng)基饋送到容器中。存在攪拌器325。出口324顯示為處于容器的底部。熱護(hù)套310圍繞反應(yīng)容器，并用于調(diào)節(jié)細(xì)胞/培養(yǎng)基的溫度。通氣裝置312位于容器的底部，用于向內(nèi)部容積提供氣體。傳感器314顯示為處于容器的右上部。示出了用于將細(xì)胞培養(yǎng)基饋送到容器中的泵316以及從容器中除去細(xì)胞培養(yǎng)基的另一個(gè)泵318。

上述灌注系統(tǒng)使用本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置。生物反應(yīng)器的內(nèi)容物連續(xù)地流過(guò)聲學(xué)灌注裝置以俘獲期望產(chǎn)物。

圖4是可以與前述系統(tǒng)一起使用的聲學(xué)灌注裝置400的第一實(shí)施例。該裝置包括入口端口410、出口端口430、第一收集端口470、底壁420和聲學(xué)腔室450。聲學(xué)腔室450也可以稱(chēng)為流體單元(fluidcell)。

入口端口410位于上述裝置的第一端412處。通常，入口端口410流體連接到相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器并且用作入口，含有細(xì)胞、細(xì)粒和產(chǎn)物的流體培養(yǎng)基通過(guò)該入口被引入到上述裝置中。入口流路451從入口端口410通往包含內(nèi)部容積的聲學(xué)腔室450。上壁411可以位于從入口端口通向聲學(xué)腔室的入口流路上方，上壁具有基本水平的取向。入口流路具有橫截面面積452(由虛線(xiàn)繪制的矩形示出)。

入口端口410位于出口端口430上方的第一高度402處，出口端口430限定裝置的底端。換句話(huà)說(shuō)，出口端口430位于聲學(xué)腔室450下方或者在入口端口410下方，或位于裝置的底端416處。出口端口430設(shè)置在入口端口410下方確保流過(guò)裝置的流體因重力被動(dòng)地受到朝向出口端口430的推動(dòng)，并且在裝置內(nèi)產(chǎn)生液壓頭。出口端口430也可以被稱(chēng)為流體循環(huán)端口，這是因?yàn)樗拗髁黧w通過(guò)出口端口430從裝置再循環(huán)或返回到相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器。如這里所示，出口端口430也位于裝置的與第一端412相反的第二端414。第一端412和第二端414可以被認(rèn)為是x軸上的相反兩端，而底端416和頂端418可以被認(rèn)為是z軸上的相反兩端。

第一收集端口470在裝置的頂端418處位于聲學(xué)腔室450上方，并且流體地連接到聲學(xué)腔室。裝置可以包括與第一收集端口470間隔開(kāi)的額外的收集端口，例如第二收集端口472。第一收集端口470和第二收集端口472通常用于從裝置收獲和回收期望的生物分子副產(chǎn)物的一部分。收集流路或收獲流路453從聲學(xué)腔室通往收集端口470,472。收集流路具有橫截面積454(由虛線(xiàn)繪制的矩形示出)。在一些特定實(shí)施例中，收集流路的橫截面積454大于入口流路的橫截面面積452。這是使通過(guò)收集端口470,472的流體流量可以比進(jìn)入的流體流量低得多的一種方法。當(dāng)用于灌注生物制造時(shí)，收集端口也可以稱(chēng)為灌注端口或收獲端口。因?yàn)槭斋@了耗盡細(xì)胞但富含有期望的生物分子產(chǎn)物、細(xì)胞碎屑和其他細(xì)粒的流體，收集端口也可以被稱(chēng)為收獲端口，而收集流路也可以稱(chēng)為收獲流路。

在該實(shí)施例中，底壁420從裝置的入口端口410延伸到出口端口430?？梢愿淖兊妆?20的確切形狀以獲得期望的流體流動(dòng)。如圖所示，底壁420從裝置的入口端口410向出口端口430彎曲。相對(duì)于入口端口410和出口端口430之間的線(xiàn)，如虛線(xiàn)401所示，底壁420具有凹曲線(xiàn)。出口流路432從聲學(xué)腔室450通往出口端口430。

如這里所示，第一超聲換能器460位于裝置的側(cè)壁440上的第二高度404處，第二高度404位于第一高度402上方(即，更接近裝置的頂端418)并且在收集端口470,472下方。位于聲學(xué)腔室450上方和收集端口470,472下方的該體積在此被識(shí)別為收獲區(qū)域或收集區(qū)域456。第一超聲換能器460包括壓電材料，壓電材料可由電壓信號(hào)驅(qū)動(dòng)以跨越收集流路453在聲學(xué)腔室450中產(chǎn)生多維駐波。因此，聲輻射力場(chǎng)將聲學(xué)腔室450與收集端口470,472分離。

在圖4的實(shí)施例中，該裝置包括位于與第一超聲換能器460相反的壁上的反射器480。反射器也位于第二高度(即，與換能器相同的高度)處。換能器460和反射器480一起產(chǎn)生如圖1所示的多維聲駐波。

在所示該實(shí)施例中，入口端口410、出口端口430和收集端口470,472均位于裝置的前壁475上。還可以想到，根據(jù)需要，這些端口可以面向任何其他方向。前壁475在這里被示出為具有平坦或平面的表面，并且具有恒定的厚度。然而，如果需要，例如前壁的形狀也可以改變，以改變橫截面面積452,454。最后，裝置的后壁附接到安裝件490，安裝件490包含孔492以用于將灌注裝置附接到表面來(lái)進(jìn)行操作。

在使用中，含有生物細(xì)胞和較小分子的流體培養(yǎng)基通過(guò)入口端口410進(jìn)入聲學(xué)腔室450。在聲學(xué)腔室內(nèi)部，重力用于將生物細(xì)胞朝向出口端口430向下拖動(dòng)。在聲學(xué)腔室中發(fā)生被動(dòng)沉降過(guò)程，在裝置的底端416處產(chǎn)生具有相對(duì)較高濃度的生物細(xì)胞的流體，并且在裝置的頂端418處產(chǎn)生具有相對(duì)較低濃度的生物細(xì)胞的流體。絕大多數(shù)進(jìn)入的流體，以及絕大多數(shù)的細(xì)胞群不會(huì)穿過(guò)聲駐波(一個(gè)或多個(gè))。具有高濃度生物細(xì)胞的流體被泵送回生物反應(yīng)器，并且通過(guò)收集端口(一個(gè)或多個(gè))470,472抽出并收集具有相對(duì)低濃度的生物細(xì)胞的流體(并且還含有期望的生物分子)。該裝置的聲駐波(一個(gè)或多個(gè))用于防止大量生物細(xì)胞通過(guò)收集端口(一個(gè)或多個(gè))470,472離開(kāi)。

在各種實(shí)施例中，通過(guò)收集流路或收獲流路453的流量與通過(guò)入口流路451的流量相比小至少一個(gè)數(shù)量級(jí)。在更特定的實(shí)施例中，通過(guò)入口端口進(jìn)入裝置的流體培養(yǎng)基的流量約為1升每分鐘(l/min)，通過(guò)收集端口(一個(gè)或多個(gè))離開(kāi)裝置的細(xì)胞被耗盡的流體的流量約為10毫升每分鐘(ml/min)。在一些測(cè)試中，具有2升至10升尺寸的生物反應(yīng)器已經(jīng)用含有高達(dá)10％酵母和高達(dá)5000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的溶液進(jìn)行了測(cè)試。通過(guò)入口端口的流量為約0.75l/min至約3l/min，通過(guò)收集流路(即，所有收集端口在一起)的流量為約1ml/min至約30ml/min。已經(jīng)實(shí)現(xiàn)95％的細(xì)胞回收率。

本公開(kāi)的聲學(xué)灌注裝置可以過(guò)濾非常高的細(xì)胞密度，約1億個(gè)細(xì)胞每毫升，可能在約6000萬(wàn)至約1.2億個(gè)細(xì)胞每毫升的范圍內(nèi)，而其他過(guò)濾技術(shù)(如atf)僅能夠以小于8000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞每毫升的密度進(jìn)行過(guò)濾。與中空纖維膜不同，如果需要，還可以調(diào)節(jié)聲駐波(一個(gè)或多個(gè))以允許細(xì)胞通過(guò)，并允許細(xì)粒/碎屑通過(guò)。這可以作為生物反應(yīng)器的清潔操作。連續(xù)的穩(wěn)態(tài)操作可以在沒(méi)有壓力波動(dòng)的情況下進(jìn)行，并且產(chǎn)物流不會(huì)在生物反應(yīng)器或過(guò)濾裝置中積聚。

聲學(xué)灌注裝置可以由本領(lǐng)域已知的適當(dāng)材料制成。這些材料包括高密度聚乙烯(hdpe)、其他塑料和可能的金屬和玻璃。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)裝置透明是非常方便的，從而可以在視覺(jué)上確認(rèn)流體流動(dòng)和超聲換能器的操作。

圖5示出了聲學(xué)灌注裝置500的另一實(shí)施例。該實(shí)施例非常類(lèi)似于圖4所示的裝置400。主要區(qū)別在于圖5的聲學(xué)灌注裝置500在收集區(qū)域456中具有在裝置的一個(gè)側(cè)壁上的第一超聲換能器460和在裝置的相反側(cè)壁440上的第二超聲換能器562。換句話(huà)說(shuō)，兩個(gè)換能器460,562位于收集流路453的相反兩側(cè)。利用這種布置，反射器580位于第一超聲換能器460和第二超聲換能器562之間的收集區(qū)域456內(nèi)。換能器被取向成使得反射器580、第一超聲換能器460和第二超聲換能器562如上所述在流體單元450中產(chǎn)生多維駐波(一個(gè)或多個(gè))，或換句話(huà)說(shuō)，換能器彼此面對(duì)。還示出了附接到裝置的出口端口430處的流出泵592，流出泵592用于控制流過(guò)裝置的流體培養(yǎng)基的流量。這里未示出的是附接到過(guò)濾裝置500的收集端口(不可見(jiàn))處的泵。

現(xiàn)在轉(zhuǎn)而參考圖6，示出了包括本公開(kāi)的相關(guān)聯(lián)的生物反應(yīng)器610和聲學(xué)灌注裝置630的處理系統(tǒng)。該系統(tǒng)設(shè)置為用作灌注生物反應(yīng)器。生物反應(yīng)器610包括具有進(jìn)料入口622、出口624和再循環(huán)物入口626的反應(yīng)容器620。新鮮培養(yǎng)基通過(guò)加料管650加入進(jìn)料入口622中。一些反應(yīng)器還將包括出口端口或排出端口(這里未示出)以除去或“排出”細(xì)胞以保持反應(yīng)器內(nèi)的恒定的細(xì)胞密度。利用攪拌器625混合反應(yīng)容器的內(nèi)容物(附圖標(biāo)號(hào)605)。期望產(chǎn)物(例如重組蛋白)由位于容器620內(nèi)的細(xì)胞連續(xù)產(chǎn)生，并存在于生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基中。灌注生物反應(yīng)器中的產(chǎn)物和細(xì)胞通過(guò)管652從反應(yīng)容器中抽出，并通過(guò)入口端口632進(jìn)入聲學(xué)灌注裝置630。其中一部分期望產(chǎn)物與細(xì)胞分離。期望產(chǎn)物可以通過(guò)第一收集端口634(其是產(chǎn)品回收端口)和管654被抽出到收容容器640中，或者在真正連續(xù)的生產(chǎn)系統(tǒng)的情況下，可以被抽出到一些其它下游純化過(guò)程。細(xì)胞在分離后返回到灌注生物反應(yīng)器，從聲學(xué)灌注裝置的出口端口636(其是流體再循環(huán)端口)通過(guò)管656傳遞到反應(yīng)容器的再循環(huán)物入口626，從而形成再循環(huán)路徑。聲學(xué)灌注裝置的多維駐波(一個(gè)或多個(gè))用于在裝置的流體單元和收集端口之間產(chǎn)生分離屏障，從而在收集端口634中收集數(shù)量極大減少的生物細(xì)胞。

圖7和圖8是聲學(xué)灌注裝置的另一示例性實(shí)施例的視圖。圖7是正剖視圖，圖8是外部透視圖。值得注意的是，該實(shí)施例被特別設(shè)計(jì)成使用可以使用vi類(lèi)材料(例如，醫(yī)療裝置級(jí)hdpe)或者甚至作為單個(gè)或焊接的注射成型部件通過(guò)清潔加工技術(shù)來(lái)制造。以這種方式，該實(shí)施例是伽馬穩(wěn)定的單次使用型裝置的示例。沖洗該裝置以除去生物負(fù)載(bioburden)，然后進(jìn)行伽馬照射(通常為25-40kgy)以消滅可能破壞健康細(xì)胞培養(yǎng)物的任何潛在污染物，例如灌注生物反應(yīng)器中存在的那些。

首先參考圖7，在該裝置700中，入口端口710和收集端口770都位于裝置的頂端718處或裝置的頂壁776上。出口端口730位于裝置的底端716處。這里，入口端口710和出口端口730都在裝置的第一側(cè)712。入口流路751是通道755的形式，其從入口端口向下朝向底端延伸并且經(jīng)過(guò)出口端口，通道與聲學(xué)腔室750隔開(kāi)(這里，隔開(kāi)由內(nèi)壁756造成)。流體將在通道中向下流動(dòng)，然后向上升至聲學(xué)腔室750。聲學(xué)腔室的底壁720是向下朝出口端口730傾斜的傾斜平坦表面。超聲換能器760的位置在此顯示為兩個(gè)正方形，在裝置的頂端和底端之間。收集流路753位于換能器上方。

現(xiàn)在參考圖8，裝置700被示出為形成在三維矩形外殼706內(nèi)。可以看出，裝置的底端716處的出口端口730位于前壁775上。同樣，收集端口770和入口端口710位于頂壁776上。由透明材料制成的觀察窗708位于前壁中。通過(guò)該觀察窗可以看出，超聲換能器安裝在裝置外殼的后壁778中。觀察窗用作反射器以產(chǎn)生多維聲駐波。

圖9和圖10是聲學(xué)灌注裝置的又一示例性實(shí)施例的視圖。圖9是正剖視圖，圖10是透視圖。

首先參考圖9，在該裝置900中，入口端口910沿著裝置的第一側(cè)912位于裝置的前側(cè)975。出口端口930(最好地在圖10中看到)定位成與入口端口910正相對(duì)并且處于相同的高度，并且也位于第一側(cè)912。在該實(shí)施例中，存在主要流體流，其幾乎直接從入口端口910流到出口端口930，并且入口流路951僅從裝置的第一側(cè)面912將小的側(cè)流轉(zhuǎn)向聲學(xué)腔室950。收集端口970位于裝置的頂端918處或裝置的頂壁976上。次級(jí)出口端口980也位于裝置的第一側(cè)912，從第一側(cè)壁979延伸并且位于入口端口910的下方，并且可以用作排出端口。聲學(xué)腔室的底壁920被成形為金字塔狀，以向下朝頂點(diǎn)傾斜。排出管線(xiàn)981從聲學(xué)腔室950的底部延伸到次級(jí)出口端口980。在這里，預(yù)期次級(jí)出口端口可用于俘獲可被丟棄或也可返回生物反應(yīng)器的小流量高濃度的細(xì)胞(細(xì)胞排出)。

現(xiàn)在參考圖10，裝置的前壁975具有矩形空間960，并且裝置的后壁978具有矩形空間962?？梢栽O(shè)想，可以以任意取向?qū)⒁粋€(gè)換能器和一個(gè)反射器放置在這兩個(gè)矩形空間960/962中，或可以將兩個(gè)換能器放置在兩個(gè)矩形空間中。在該視圖中，入口端口910和出口端口930均可見(jiàn)。入口端口910位于裝置的前側(cè)，并且出口端口930位于裝置的后側(cè)(但是，如果需要可以反轉(zhuǎn))。澄清流路953位于換能器上方。雖然這里未示出，但是類(lèi)似于圖4中的安裝件可以附接到裝置的第二側(cè)914。

現(xiàn)在更詳細(xì)地描述在聲學(xué)過(guò)濾裝置中使用的超聲換能器(一個(gè)或多個(gè))可能是有幫助的。圖11是常規(guī)的超聲換能器的剖視圖。該換能器具有在底端的耐磨板50、環(huán)氧樹(shù)脂層52、陶瓷壓電元件54(例如由鋯鈦酸鉛(pzt)制成)、環(huán)氧樹(shù)脂層56和背襯層58。在陶瓷壓電元件的任一側(cè)設(shè)有電極：正電極61和負(fù)電極63。環(huán)氧樹(shù)脂層56將背襯層58附接到壓電元件54。整個(gè)組件被容納在外殼60中，外殼60可以由例如鋁制成。外殼用作接地電極。電適配器62提供用于使導(dǎo)線(xiàn)穿過(guò)外殼并連接到附接于壓電元件54的引線(xiàn)(未示出)的連接。通常，背襯層被設(shè)計(jì)成利用在寬范圍頻率上的均勻位移來(lái)增加阻尼并且產(chǎn)生寬帶的換能器，并且被設(shè)計(jì)成抑制壓電元件的特定振動(dòng)本征模式的激發(fā)。耐磨板通常設(shè)計(jì)為阻抗變換器，以更好地匹配被換能器輻射到的培養(yǎng)基的特性阻抗。

圖12是本公開(kāi)的超聲換能器81的縱截面圖，其用于本公開(kāi)的聲學(xué)過(guò)濾裝置中。換能器81成形為方形，并且具有鋁外殼82。鋁外殼具有頂端和底端。換能器外殼也可以由諸如醫(yī)用級(jí)hdpe等塑料或其他金屬制成。壓電元件是一種鈣鈦礦陶瓷塊，均由較大的二價(jià)金屬離子(通常為鉛或鋇)的柵格中的小的四價(jià)金屬離子(通常為鈦或鋯)和o^2-離子組成。作為示例，pzt(鋯鈦酸鉛)壓電元件86限定換能器的底端，并且從外殼的底端的外部露出。壓電元件借助位于壓電元件和外殼之間小的彈性層98(例如環(huán)氧樹(shù)脂、硅樹(shù)脂或類(lèi)似材料)被支撐在壓電元件的周邊。換句話(huà)說(shuō)，不存在耐磨板或背襯材料。然而，在一些實(shí)施例中，存在將壓電元件與產(chǎn)生聲駐波的流體隔開(kāi)的塑料或其它材料層。壓電元件/晶體也具有外表面(其被露出)和內(nèi)表面。

螺釘88借助于螺紋將外殼的鋁頂板82a附接到外殼的主體82b。頂板包括用于為換能器供電的連接器84。pzt壓電元件86的頂面與由絕緣材料94隔開(kāi)的正極90和負(fù)極92連接。電極可以由諸如銀或鎳等任何導(dǎo)電材料制成。電功率通過(guò)壓電元件上的電極提供給pzt壓電元件86。注意，壓電元件86沒(méi)有背襯層或環(huán)氧樹(shù)脂層。換句話(huà)說(shuō)，在換能器中，在鋁頂板82a和壓電元件86之間存在內(nèi)部容積或氣隙87(即氣隙完全為空)。在一些實(shí)施例中，可以提供最小的背襯58和/或耐磨板50，如圖13所示。

換能器設(shè)計(jì)可以影響系統(tǒng)的性能。典型的換能器是將陶瓷壓電元件結(jié)合到背襯層和耐磨板上的分層結(jié)構(gòu)。由于換能器承載有由駐波提供的高機(jī)械阻抗，常規(guī)的耐磨板設(shè)計(jì)指導(dǎo)，例如對(duì)駐波應(yīng)用而言的半波長(zhǎng)厚度或?qū)椛鋺?yīng)用而言的四分之一波長(zhǎng)厚度以及制造方法可能不合適。相反，在本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施例中，換能器沒(méi)有耐磨板或背襯，從而允許壓電元件在具有高q因子的一個(gè)本征模式下振動(dòng)，或者以幾個(gè)本征模式的組合振動(dòng)。振動(dòng)的陶瓷壓電元件/盤(pán)直接暴露于流過(guò)流體單元的流體。

移除背襯(例如使壓電元件以空氣作為背襯)也允許陶瓷壓電元件在極小阻尼的高階振動(dòng)模式(例如高階模位移)下振動(dòng)。在具有帶有背襯的壓電元件的換能器中，壓電元件像活塞一樣以更均勻的位移振動(dòng)。移除背襯允許壓電元件以不均勻位移模式振動(dòng)。壓電元件的振型越高階，壓電元件具有越多的節(jié)線(xiàn)(nodalline)。雖然俘獲線(xiàn)與波節(jié)的相關(guān)性不一定是一一對(duì)應(yīng)的而且以更高頻率驅(qū)動(dòng)壓電元件不一定會(huì)產(chǎn)生更多的俘獲線(xiàn)，但壓電元件的高階模位移產(chǎn)生更多的俘獲線(xiàn)。

可以想到，在本公開(kāi)的聲學(xué)過(guò)濾裝置的一些實(shí)施例中，壓電元件可以具有對(duì)壓電元件的q因子影響最小(例如小于5％)的背襯。背襯可以由諸如輕木、泡沫或軟木等大致透聲材料制成，大致透聲材料在向壓電元件提供一些機(jī)械支撐的同時(shí)允許壓電元件以高階振型振動(dòng)并且保持高q因子。背襯層可以是實(shí)心的，或者可以為具有貫穿該層的孔的柵格，使得該柵格以特定的高階振動(dòng)模遵循振動(dòng)壓電元件的波節(jié)，從而在允許其余壓電元件自由振動(dòng)的同時(shí)在波節(jié)位置處提供支撐。柵格結(jié)構(gòu)或透聲材料的目標(biāo)在于在不降低壓電元件的q因子或不干擾特定振型的激勵(lì)的情況下提供支撐。

將壓電元件放置成與流體直接接觸也通過(guò)避免環(huán)氧樹(shù)脂層和耐磨板的減振和能量吸收效應(yīng)而有助于高q因子。換能器的其它實(shí)施例可以具有耐磨板或耐磨表面，以防止含鉛的pzt接觸宿主流體。例如這在如哺乳動(dòng)物細(xì)胞的血液分離、生物制藥灌注或補(bǔ)料分批過(guò)濾等生物應(yīng)用中是可取的。這些應(yīng)用可使用諸如鉻、電解鎳或無(wú)電鍍鎳等耐磨層。也可以使用化學(xué)氣相沉積來(lái)施加一層聚對(duì)二甲苯(例如parylene)或其它聚合物。有機(jī)和生物相容性涂層，如硅樹(shù)脂或聚氨酯也可用作耐磨表面。

在一些實(shí)施例中，對(duì)于諸如油/水乳液分離和如灌注等其它方法的應(yīng)用，超聲換能器具有標(biāo)稱(chēng)的2mhz共振頻率。每個(gè)換能器可以消耗約28w的功率，用于以3gpm的流量進(jìn)行液滴俘獲。這轉(zhuǎn)化為0.25kwhr/m³的能源成本。這表明這項(xiàng)技術(shù)的能源成本非常低。理想地，每個(gè)換能器由其自己的放大器供電和控制。在其他實(shí)施例中，超聲換能器使用例如具有1”×1”尺寸的方形壓電元件?？商娲?，超聲換能器可以使用矩形壓電元件，例如具有1”×2.5”尺寸。為了獲得足夠的聲學(xué)俘獲力，每個(gè)換能器的功率耗散在每1”×1”換能器橫截面積和每英寸聲駐波跨度上為10w。對(duì)于4”跨度的中等尺度系統(tǒng)，每個(gè)1”×1”方形換能器消耗40w。較大的1”×2.5”矩形換能器在中等尺度系統(tǒng)中使用100w。三個(gè)1”×1”方形換能器的陣列將消耗總共120w，并且兩個(gè)1”×2.5”換能器的陣列將消耗大約200w。緊密間隔的換能器的陣列代表該技術(shù)的替代的潛在實(shí)施例。換能器尺寸、形狀、數(shù)量和位置可以根據(jù)需要而改變以產(chǎn)生期望的多維聲駐波圖案。

換能器的尺寸、形狀和厚度確定了在不同激發(fā)頻率下的換能器位移，這進(jìn)而影響分離效率。通常，換能器以接近厚度共振頻率(半波長(zhǎng))的頻率操作。換能器位移的梯度通常產(chǎn)生細(xì)胞/生物分子的更多俘獲位置。高階模式位移在所有方向上的聲場(chǎng)中產(chǎn)生具有強(qiáng)梯度的三維聲駐波，從而在所有方向上產(chǎn)生同樣強(qiáng)的聲輻射力，產(chǎn)生多個(gè)俘獲線(xiàn)，其中俘獲線(xiàn)的數(shù)量與換能器的特定振型相關(guān)。

為了研究換能器位移曲線(xiàn)對(duì)聲學(xué)俘獲力和分離效率的影響，使用1”×1”方形換能器重復(fù)了10次實(shí)驗(yàn)，除了激發(fā)頻率之外，所有條件都相同。圖14中用圓圈圈起來(lái)的數(shù)字1-9和字母a表示的十個(gè)連續(xù)的聲共振頻率被用作激發(fā)頻率。條件為實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為30分鐘，1000ppm油濃度為約5微米sae-30油滴，流量為500ml/min，施加功率為20瓦。使用油滴，因?yàn)橛捅人芏鹊?，并且可以使用聲泳將油與水分離。

圖14示出了作為2.2mhz換能器共振附近的頻率的函數(shù)的方形換能器的測(cè)量到的電阻抗幅值。換能器電阻抗中的最小值對(duì)應(yīng)于水柱的聲共振，并表示潛在的操作頻率。在激發(fā)了多維駐波的其他頻率處存在額外的共振。數(shù)值模擬已經(jīng)表明，在這些聲共振頻率處，換能器位移分布顯著變化，從而直接影響聲駐波和產(chǎn)生的俘獲力。由于換能器在其厚度共振附近操作，電極表面的位移基本上是異相的。換能器電極的典型位移不均勻，并且根據(jù)激發(fā)頻率而變化。例如，在具有一條油滴俘獲線(xiàn)的一個(gè)激發(fā)頻率處，位移在電極中間具有單個(gè)最大值，并且在換能器邊緣附近具有最小值。在另一個(gè)激發(fā)頻率處，換能器分布具有多個(gè)最大值，從而產(chǎn)生多條俘獲油滴線(xiàn)。較高階換能器位移圖案導(dǎo)致對(duì)于俘獲油滴而言俘獲力更高且產(chǎn)生多個(gè)穩(wěn)定俘獲線(xiàn)。

當(dāng)油-水乳液經(jīng)過(guò)換能器時(shí)，觀察并表征油滴俘獲線(xiàn)。對(duì)于圖14中標(biāo)識(shí)的十個(gè)共振頻率中的七個(gè)共振頻率，如圖15所示，表征涉及跨越流體通道的俘獲線(xiàn)的數(shù)量的觀察和圖案。換能器的不同位移分布可以在駐波中產(chǎn)生不同的(更多)俘獲線(xiàn)，位移分布中的更多梯度通常會(huì)產(chǎn)生更高的俘獲力和更多的俘獲線(xiàn)。

圖16是示出與9俘獲線(xiàn)圖案匹配的壓力場(chǎng)的數(shù)值模型。數(shù)值模型是二維模型；因此僅觀察到三條俘獲線(xiàn)。在垂直于紙面的第三維中存在另外兩組三條俘獲線(xiàn)。

換能器所產(chǎn)生的聲輻射力的橫向力可以通過(guò)以更高階振型驅(qū)動(dòng)換能器來(lái)增加，這與晶體有效地作為具有均勻位移的活塞而移動(dòng)的振動(dòng)形式相反。聲壓與換能器的驅(qū)動(dòng)電壓成比例。電功率與電壓的平方成比例。換能器通常是薄的壓電板，具有在z軸上的電場(chǎng)以及在z軸上的主要位移。換能器通常在一側(cè)與空氣(即，換能器內(nèi)的氣隙)耦合，另一側(cè)與細(xì)胞培養(yǎng)基的流體培養(yǎng)基耦合。在板中產(chǎn)生的波的類(lèi)型被稱(chēng)為復(fù)合波。壓電板中的復(fù)合波的子集類(lèi)似于泄漏的對(duì)稱(chēng)(也稱(chēng)為壓縮或膨脹)蘭姆波。板的壓電性質(zhì)通常導(dǎo)致對(duì)稱(chēng)蘭姆波的激發(fā)。這些波是漏波，因?yàn)樗鼈冚椛涞剿畬又校@導(dǎo)致在水層中產(chǎn)生聲駐波。蘭姆波存在于無(wú)限大的薄板上，該薄板的表面具有無(wú)應(yīng)力條件。因?yàn)楸緦?shí)施例的換能器本質(zhì)上是有限的，所以實(shí)際的模式位移更復(fù)雜。

圖17示出了橫跨板厚度的平面內(nèi)位移(x位移)和平面外位移(y-位移)的典型變型，平面內(nèi)位移在板的厚度上是偶函數(shù)，平面外位移是奇函數(shù)。由于板的有限尺寸，位移分量在板的整個(gè)寬度和長(zhǎng)度上變化。通常，(m,n)模式是換能器的如下位移模式，其中在寬度方向上的換能器位移具有m個(gè)波動(dòng)，在長(zhǎng)度方向上具有n個(gè)波動(dòng)，并且具有如圖17所示的厚度變化。m和n的最大數(shù)是晶體尺寸和激發(fā)頻率的函數(shù)。不呈現(xiàn)形式(m,n)的附加三維模式是存在的。

驅(qū)動(dòng)換能器使得壓電元件以通式(m,n)的高階模式振動(dòng)，其中m和n無(wú)關(guān)地為1或更大。通常，換能器將以比(2,2)高階的模式振動(dòng)。更高階模式將產(chǎn)生更多的波節(jié)和波腹，導(dǎo)致產(chǎn)生水層中的三維駐波，三維駐波的特征在于在所有方向的聲場(chǎng)中具有強(qiáng)梯度，不僅在駐波方向上，而且在橫向上。結(jié)果，聲梯度導(dǎo)致在橫向上產(chǎn)生更強(qiáng)的俘獲力。

在實(shí)施例中，驅(qū)動(dòng)換能器的電壓信號(hào)可以具有正弦、方形、鋸齒、脈沖或三角波形；并具有500khz至10mhz的頻率。電壓信號(hào)可以用脈沖寬度調(diào)制驅(qū)動(dòng)，這產(chǎn)生任何期望的波形。電壓信號(hào)還可以具有幅度或頻率調(diào)制啟動(dòng)/停止能力，以消除流(streaming)。

換能器用于產(chǎn)生壓力場(chǎng)，該壓力場(chǎng)產(chǎn)生在與駐波方向正交的方向上以及在駐波方向上均具有相同數(shù)量級(jí)的聲輻射力。當(dāng)力具有大致相同的數(shù)量級(jí)時(shí)，尺寸為0.1微米至300微米的粒子將更有效地朝向“俘獲線(xiàn)”移動(dòng)，使得粒子不會(huì)通過(guò)壓力場(chǎng)并繼續(xù)通過(guò)過(guò)濾裝置的收集端口離開(kāi)。相反，粒子將保留在聲學(xué)腔室內(nèi)以被再循環(huán)回生物反應(yīng)器。

提供以下示例以說(shuō)明本公開(kāi)的裝置、組件和方法。這些示例僅僅是說(shuō)明性的，并不旨在將本公開(kāi)內(nèi)容限于本文所述的材料、條件或工藝參數(shù)。

示例

示例1

圖18示出了如上詳細(xì)描述的聲學(xué)灌注裝置的實(shí)驗(yàn)裝置。除了底壁不彎曲，而是從第一端水平地延伸然后直接轉(zhuǎn)向出口端口之外，這種聲學(xué)灌注裝置非常類(lèi)似于圖5所示的裝置。管連接到入口端口、出口端口和兩個(gè)收集端口。泵也可見(jiàn)地流體連接到出口端口。

圖19是本公開(kāi)的另一種聲學(xué)灌注裝置的照片，類(lèi)似于圖5所示的實(shí)施例，該聲學(xué)灌注裝置具有兩個(gè)超聲換能器和在裝置底端的從入口端口通往出口端口的凹入底壁。含有流體培養(yǎng)基的細(xì)胞也存在于該裝置中。在該照片中，如上所述，在反射器與第一和第二換能器之間的收集區(qū)域中產(chǎn)生聲駐波。由此產(chǎn)生的聲場(chǎng)由波和附圖標(biāo)記1664表示。從入口端口通過(guò)裝置到出口端口的流體培養(yǎng)基的流型用表示流體流入裝置的方向的箭頭(附圖標(biāo)記1610)和表示流體通過(guò)裝置朝向出口端口流動(dòng)的方向的箭頭(附圖標(biāo)記1630)示出。最后，用指示流動(dòng)方向的箭頭(附圖標(biāo)記1670)示出了期望產(chǎn)物的通過(guò)第一和第二收集端口從裝置出來(lái)的一般流型。

已經(jīng)使用圖19的聲學(xué)灌注裝置和本公開(kāi)的分離方法在不同的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞系上來(lái)測(cè)試聲泳分離。圖20-28顯示了使用beckmancoultercellviabilityanalyzer(貝克曼庫(kù)爾特細(xì)胞活力分析儀)改變不同參數(shù)且測(cè)量不同值的各種測(cè)試結(jié)果。

使用聲學(xué)過(guò)濾裝置的灌注流量為約2ml/min至約10ml/min，或者對(duì)于2.7l工作容積生物反應(yīng)器，流量為約1vvd至約5vvd。vvd是指“容器容積每天”，或一天中生物反應(yīng)器容器的容積循環(huán)通過(guò)聲學(xué)過(guò)濾裝置的次數(shù)。通過(guò)灌注端口收集灌注流量(qp)。相比之下，進(jìn)料流量(qf)為約40ml/min至約200ml/min。

進(jìn)料溶液的起始cho細(xì)胞密度為50×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。反應(yīng)器尺寸為2.7l，宿主流體的進(jìn)料體積為1.5l?？偣策M(jìn)行了一系列七次測(cè)試(t1-t7)，以研究在2.7l溶劑反應(yīng)器中改變vvd和流動(dòng)分流的影響。試驗(yàn)的參數(shù)如下表1所示。

表1：2.7l反應(yīng)器和1.5l進(jìn)料體積的系統(tǒng)結(jié)果

結(jié)果包括在45v的dc電壓下在89-93％之間的細(xì)胞澄清效率，而與如圖20所示的流量無(wú)關(guān)。注意，t1的dc電壓固定在60v，而對(duì)于測(cè)試t2-t7將dc電壓降低至45v的固定量。換能器電壓幅值是這些值的一半。

結(jié)果進(jìn)一步包括與進(jìn)料相比的90-94％的灌洗液濁度降低，如圖21所示。該圖顯示進(jìn)料、再循環(huán)流體(qc)和灌注液(qp)的濁度。進(jìn)料進(jìn)入入口端口，再循環(huán)流體離開(kāi)出口端口并再循環(huán)，灌注液離開(kāi)聲過(guò)濾裝置的灌注端口。應(yīng)注意，測(cè)試t1和t2的濁度測(cè)量導(dǎo)致硬件錯(cuò)誤，因此僅顯示測(cè)試t3-t7，這相當(dāng)于灌注流中相對(duì)于進(jìn)料流的6-10％濁度，而不管流量如何。

圖22由beckmancoultercellviabilityanalyzer產(chǎn)生，并顯示了在儀器誤差(即±6％)內(nèi)的每個(gè)流量的細(xì)胞存活率，在所有測(cè)試中對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)在79-84％的范圍內(nèi)。

使用指定為“cho系a”的溶液進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)試。該溶液的起始細(xì)胞密度為50×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，濁度為2400ntu，細(xì)胞存活率約為80％。使用本公開(kāi)的裝置在反應(yīng)器尺寸為2.7l的系統(tǒng)中分離溶液。進(jìn)料流體的體積在1.5l和2.0l之間。灌注流量為2ml/min至10ml/min，或1至5vvd。進(jìn)行了一系列六次測(cè)試，以研究改變vvd和流動(dòng)分流對(duì)2.7l溶劑反應(yīng)器的聲學(xué)過(guò)濾性能的影響。試驗(yàn)的參數(shù)如下表2所示。

表2：2.7l反應(yīng)器和1.5l-2.0l進(jìn)料體積的系統(tǒng)結(jié)果

圖23示出了測(cè)量到的進(jìn)料流、再循環(huán)流和灌注流的總細(xì)胞密度。用于測(cè)試的生物反應(yīng)器細(xì)胞保留顯示約90％的灌注效率。圖24顯示了測(cè)試的測(cè)量細(xì)胞存活率，揭示了整個(gè)測(cè)試的存活率沒(méi)有顯著變化。

接下來(lái)，使用指定為“cho系b”的溶液進(jìn)行另外的測(cè)試。該溶液的起始細(xì)胞密度為75×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml，濁度為2300ntu，細(xì)胞存活率約為80％。使用本公開(kāi)的裝置在反應(yīng)器尺寸為2.7l的系統(tǒng)中分離溶液。進(jìn)行了四次試驗(yàn)(t1-t4)。兩個(gè)測(cè)試(t1，t3)使用具有單個(gè)換能器的裝置。另外兩個(gè)測(cè)試(t2，t4)使用具有兩個(gè)串聯(lián)換能器的裝置(使得流體穿過(guò)兩個(gè)駐波)。試驗(yàn)的參數(shù)如下表3所示。

表3：2.7l反應(yīng)器和1.5l-2.0l進(jìn)料體積的系統(tǒng)結(jié)果

圖25顯示了測(cè)量到的進(jìn)料流、再循環(huán)流和灌注流的總細(xì)胞密度。用于測(cè)試的生物反應(yīng)器細(xì)胞保留顯示大于90％的灌注效率。當(dāng)使用兩個(gè)換能器而不是單個(gè)換能器時(shí)，結(jié)果進(jìn)一步證明了高了大約3-5％的效率。圖26顯示了測(cè)試的測(cè)量細(xì)胞存活率，揭示了整個(gè)測(cè)試中存活率沒(méi)有顯著變化。實(shí)際上，在低vvd下操作提供了許多優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)基成本降低。

在生物應(yīng)用中，預(yù)期的是系統(tǒng)的所有部分(即，生物反應(yīng)器、聲學(xué)過(guò)濾裝置、與之流體連接的管道等)可以彼此分離并且是可棄式的。避免離心機(jī)和過(guò)濾器允許更好地分離cho細(xì)胞，而不會(huì)降低細(xì)胞的存活率。換能器也可以被驅(qū)動(dòng)以產(chǎn)生快速的壓力變化，以防止或清除由于cho細(xì)胞附聚引起的阻塞。換能器的頻率也可以改變以對(duì)于給定功率獲得最佳效果。

示例2

圖27示出了類(lèi)似于圖8所示的聲學(xué)灌注裝置的另一實(shí)驗(yàn)裝置。管連接到入口端口、出口端口和收集端口。

以轉(zhuǎn)換器電壓的40v峰-峰值，15-30ml/min的灌注流量和2l/min的再循環(huán)流量測(cè)試該裝置。每45-60分鐘取樣一次，確定細(xì)胞保留率。圖28顯示結(jié)果。y軸是保留率，以百分比表示(通過(guò)比較輸出細(xì)胞計(jì)數(shù)與輸入或生物反應(yīng)器/培養(yǎng)物細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)進(jìn)行計(jì)算)。x軸是施加的dc電壓(以v為單位)和灌注或收獲流量(以ml/min為單位)二者；v和ml/min的數(shù)值范圍相同只是巧合。灌注流量高達(dá)20ml/min時(shí)，細(xì)胞保留效率保持高于95％，并在直到約25ml/min之前都保持高于90％。圖33是表示處于啟動(dòng)或者細(xì)胞沉降模式(左)和穩(wěn)態(tài)細(xì)胞保持模式(右)的裝置的組合照片。

接下來(lái)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定什么因素將影響細(xì)胞保留。灌注流量變化，換能器電壓也變化。當(dāng)灌注流量變化時(shí)，換能器電壓保持在40v峰-峰值，再循環(huán)流量保持在2l/min。當(dāng)換能器電壓變化時(shí)，灌注流量保持在20ml/min，再循環(huán)流量保持在2l/min。結(jié)果表明，對(duì)于該具體實(shí)施方案，約15ml/min至約28ml/min的灌注流量是最佳的，并且約15v峰-峰值至約28v峰-峰值的換能器電壓是最佳的。

可以通過(guò)檢查進(jìn)入裝置并從裝置收獲的觀察到的細(xì)胞樣品來(lái)證明對(duì)由聲學(xué)灌注裝置提供的添加功能的更好理解。圖29a是進(jìn)料懸浮液的顯微圖像(來(lái)自vi-cell細(xì)胞計(jì)數(shù)器)，這里是具有約5600萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml的能活細(xì)胞培養(yǎng)物群?？捎^察到幾個(gè)大的、圓的健康的細(xì)胞。圖29b是顯示群中細(xì)胞直徑分布的直方圖。直徑分布是強(qiáng)雙峰的，在約11微米和約23微米的值附近。這兩個(gè)峰大致對(duì)應(yīng)于較小的碎屑和非能活細(xì)胞、以及較大的能活細(xì)胞。應(yīng)該注意的是，這個(gè)樣品來(lái)自一個(gè)特別“臟”的細(xì)胞群。一般來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)細(xì)胞系將會(huì)更加清潔得多，大約11微米的峰值將會(huì)小得多，甚至不存在。

圖30a是另一種顯微圖像(來(lái)自vi-cell細(xì)胞計(jì)數(shù)器)，這次是從聲學(xué)灌注裝置收獲的流的顯微圖像。在該圖像中，與圖29a相比，觀察到非常少的明亮的大細(xì)胞。相反，圖像中填充有更小、更暗的粒子或碎屑。在這種情況下的實(shí)驗(yàn)條件是灌注速率為4ml/min，循環(huán)速率為2l/min，dc輸入電壓為30v。該定性觀察由圖30b中的直方圖證實(shí)，其顯示了灌注液中的直徑分布。參見(jiàn)圖30b，粒子分布現(xiàn)在是單峰的，其峰值約為9微米。這表明較大的能活的細(xì)胞已經(jīng)被俘獲并保留，或者被大大地阻止在灌注液中排出。只有較小的細(xì)胞與細(xì)胞碎屑、細(xì)粒和碎片一起通過(guò)，從亞微米到微米級(jí)尺寸。

做出該裝置的計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)(cfd)模型。圖31顯示了500秒后裝置內(nèi)的速度分布。單位是米/秒(m/s)。如預(yù)期的那樣，在從入口端口到出口端口向下導(dǎo)向的通道中發(fā)現(xiàn)最高的速度。在流體單元中以及收集端口外部，速度接近于零。這是重要的，原因有二：聲場(chǎng)在具有更低、更均勻速度的流動(dòng)中更有效，并且因?yàn)樯镏圃熘惺褂玫募?xì)胞對(duì)流動(dòng)敏感，并且誘導(dǎo)剪切速率。

圖32是示出該實(shí)施例的若干方面的視圖。流體通過(guò)入口端口710流入(箭頭780)裝置并進(jìn)入聲學(xué)腔室的聲學(xué)邊緣783的上方。聲學(xué)腔室下方的流體的體積750包含由箭頭782指示的切向流路。如箭頭781所示，具有相對(duì)大量的能活細(xì)胞的流體將通過(guò)出口730離開(kāi)。由駐波產(chǎn)生的聲學(xué)邊緣效應(yīng)用附圖標(biāo)記783標(biāo)記，并將大細(xì)胞與可以通過(guò)聲駐波場(chǎng)784的較小的細(xì)胞碎片、粒子碎屑、期望的生物分子等等分離。然后，該收獲流動(dòng)流785通過(guò)收獲端口770離開(kāi)。切向流路是入口流路的一部分，并且位于由聲駐波產(chǎn)生的聲學(xué)邊緣783的下方。切向流路將由于重力作用而將從聲駐波場(chǎng)784掉落的細(xì)胞簇和由聲學(xué)邊緣效應(yīng)保留的細(xì)胞傳送出去。

示例3

通過(guò)觀察數(shù)值研究的結(jié)果可以理解解釋聲學(xué)灌注裝置的操作的另一種方式。在數(shù)值研究中，具有不同有效聲學(xué)特性(即聲速和密度)的兩種流體在數(shù)值模擬軟件comsol中用它們之間的界面建模。計(jì)算聲場(chǎng)，由此使用戈?duì)柨品蚍匠逃?jì)算在流體速度方向上作用在粒子上的橫向輻射力。

圖34示出了利用壓電換能器、鋼反射器、鋁外殼和兩種流體的模擬的幾何形狀：第一流體是聲場(chǎng)內(nèi)的水，第二流體是在聲場(chǎng)外水溶液中的cho細(xì)胞的15％濃度，第二流體具有比水流體更高的密度和更高的聲速。

在圖34的模型中，如實(shí)線(xiàn)所示分離兩種流體。在該設(shè)置中，通過(guò)系統(tǒng)的流體速度在從左到右的水平方向上。因此，為了作為保留裝置，聲場(chǎng)需要在細(xì)胞上產(chǎn)生作用于負(fù)x方向(即與流體速度相反)上的力。利用流體密度為1000kg/m³以及聲速為1500m/s對(duì)水進(jìn)行建模。對(duì)cho細(xì)胞進(jìn)行建模，其密度為1050kg/m³，聲速為1550m/s。在各種激發(fā)頻率下進(jìn)行聯(lián)接多物理數(shù)值模擬，包括壓電材料的全壓電模擬，兩種流體的聲學(xué)模擬以及鋼和鋁主體中的線(xiàn)性彈性模擬。換能器以40v的峰值電壓驅(qū)動(dòng)。

圖35a-35c示出了在2.218mhz、2.2465mhz和2.3055mhz的操作頻率下，兩種流體中的聲壓和模型的壓電材料、鋁外殼和鋼反射器的位移。在兩個(gè)流體之間的界面處計(jì)算橫向輻射力(即在流體流動(dòng)方向上水平地)以及換能器消耗的實(shí)際電功率。顯示了換能器和鋼的結(jié)構(gòu)位移以及流體中的聲壓。

圖36示出了作用在懸浮的cho細(xì)胞上的橫向輻射力(n)和由功率歸一化的橫向輻射力(n/w)對(duì)頻率。該曲線(xiàn)圖表明，在共振頻率(即功率的局部最大值)下，界面上的平均橫向輻射力為負(fù)，意味著它處于負(fù)x方向。結(jié)果是產(chǎn)生聲壁效應(yīng)或聲學(xué)邊緣效應(yīng)。也就是說(shuō)，聲場(chǎng)的邊緣在懸浮粒子上施加強(qiáng)的橫向力，從而阻止較大的粒子進(jìn)入聲場(chǎng)，并且僅允許第一流體(即，僅包含較小粒子的流體，例如期望的產(chǎn)物，并排除所有細(xì)胞)進(jìn)入聲場(chǎng)，從而產(chǎn)生聲學(xué)灌注細(xì)胞保留裝置。以這種方式，只有澄清的流體才能逸出，細(xì)胞被輻射力保持。這個(gè)力永遠(yuǎn)不會(huì)是正的，這意味著該力總是將細(xì)胞保持在界面處，不允許它們逃離聲學(xué)邊緣。功率曲線(xiàn)中的多個(gè)峰值顯示了包括平面共振模式和多維操作模式在內(nèi)的多種操作模式的存在，表明可以通過(guò)利用平面和多維駐波等可以產(chǎn)生這種類(lèi)型的操作。在具有1”×1”尺寸的系統(tǒng)中，約每30khz存在平面共振。該曲線(xiàn)圖顯示了表明存在多維模式的額外峰值的證據(jù)。每單位功率，這些模式可以與平面共振模式同等有效或甚至更有效。如上所述，由聲輻射力阻擋的細(xì)胞然后可以通過(guò)流場(chǎng)的擦洗運(yùn)動(dòng)(即，界面下方的再循環(huán)流)來(lái)拾取，并且連續(xù)返回到生物反應(yīng)器以確保它們接收營(yíng)養(yǎng)和氧氣而保持整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的產(chǎn)生。

示例4

圖37和圖38示出了類(lèi)似于圖9所示的聲學(xué)灌注裝置的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置。管連接到入口端口、出口端口、收集端口和次級(jí)出口端口(用于流量集中細(xì)胞)。包括箭頭以說(shuō)明流體流動(dòng)。箭頭表示流入入口端口的流動(dòng)；流出出口端口的流動(dòng)；灌注液流出裝置的頂部的流動(dòng)以及濃縮液流出裝置的底部的流動(dòng)。通過(guò)入口端口流到出口端口是再循環(huán)流量。從裝置頂部流出的灌注液是灌注流量，其含有耗盡細(xì)胞并含有期望產(chǎn)物的澄清流體。從裝置底部流出的濃縮液是濃縮的細(xì)胞流。濃縮的細(xì)胞流可以用于細(xì)胞排出操作，或者如果需要，可以將細(xì)胞返回到生物反應(yīng)器。

在40v峰-峰值的換能器電壓下測(cè)試該裝置，灌注流量(從頂部流出)為1-10ml/min，再循環(huán)流量為0.75-1l/min，濃縮液速率(從底部流出)為15ml/min。確定不同灌注流量的細(xì)胞保留率。圖39顯示了結(jié)果。y軸是保留率，1.00表示100％保留。灌注流量高達(dá)7ml/min時(shí)，細(xì)胞保留效率保持高于98％，并在10ml/min的流量處恰好低于90％。

已經(jīng)參考示例性實(shí)施例描述了本公開(kāi)。顯然，在閱讀和理解上述詳細(xì)描述后，本領(lǐng)域其他技術(shù)人員將會(huì)進(jìn)行修改和更改。意圖是將本公開(kāi)解釋為包括所有這些修改和更改，只要它們落在所附權(quán)利要求或其等同內(nèi)容的范圍內(nèi)。