相關申請

本申請要求2014年9月16日提交的美國臨時申請序列號62/071,179和2015年7月10日提交的美國臨時申請序列號62/231,592的權益，這些申請的內(nèi)容以引用的方式整體納入本發(fā)明。

本發(fā)明涉及基于龍舌蘭的烈酒，特別是各種特奎拉龍占蘭酒(tequila)的非酒精版本，其可用于通過這些飲品中所含單胺氧化酶(mao)抑制劑來治療多種疾病。

背景技術：

有大量的關于來自龍占蘭蒸餾烈酒的制備的文獻。例如，在《特奎拉龍舌蘭酒加工和風味》(tequilaprocessingandflavor)，pedroa.vazquez-landaverde和miriamg.rodriguez-olvera，centrodeinvestigaciónencienciaaplicadaytecnologfaavanzadadelinstitutopolitécniconacionalunidadquerretaro，cerroblanco141colinasdelcimatario，queretaro，qro.，mexico76090；2012americanchemicalsociety；萬維網(wǎng)上//pubs.acs.org，公開日期(網(wǎng)絡)2012年7月16日|doi：10.1021|bk-2012-1104.ch015在葡萄酒和其他酒精類飲料“flavorchemistryofwineandotheralcoholicbeverages”中qian，m.，等；acssymposiumseries；americanchemicalsociety：washington，dc，2012，中提供了從龍舌蘭仙人掌制備特奎拉龍舌蘭酒的詳細描述，其對處理龍舌蘭原料、發(fā)酵、蒸餾和陳化描述的公開內(nèi)容通過引用的方式納入本發(fā)明。簡言之，龍舌蘭仙人掌(agavecactus)的莖被加熱以使得復合糖水解，并切碎和碾碎以釋放糖漿。隨后用水稀釋糖漿以提供用于接種酵母的適合稀釋液。發(fā)酵后，對發(fā)酵培養(yǎng)物進行蒸餾以獲得餾出物。餾出物作為許多不同品牌的特奎拉龍舌蘭酒售賣。然而，餾出物可以在包裝和售賣前進行陳化。

上述參考來源中所示的具體描述如下：

將剝掉葉的成熟龍舌蘭(稱為“pifia”)切成兩半，四分之一或更多，以易于在106-116℃在烘箱(48小時)或高壓釜(12小時)中烘烤。這種熱處理的目的是水解復合糖如菊粉和淀粉，獲得葡萄糖和果糖以更容易發(fā)酵。糖主要導致乙醇形成，許多其他化合物來自該底物的發(fā)酵。通過pifias的熱處理導致形成了化合物，主要是美拉德相關的，如呋喃，吡喃，醛，氮化合物和硫化合物。最豐富的美拉德化合物是甲基-2-糠酸酯，2，3-二羥基-3，5-二氫-6-甲基-4(h)-吡喃-4-酮和5-羥甲基糠醛。吡嗪也是來自美拉德反應的重要化合物組。發(fā)現(xiàn)最豐富的吡嗪是2，5-二甲基吡嗪和三甲基吡嗪。

在烘烤步驟期間產(chǎn)生其它熱相關分解產(chǎn)物。在烘烤的pifias中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)短碳鏈和長碳鏈的游離脂肪酸，這可能是由于?；视偷乃?，β-環(huán)卟啉和β-大馬酮可能是類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，而4-甲基-5-(2-羥乙基)-噻唑是氨基酸硫胺素的分解產(chǎn)物。像對甲酚和4-乙基苯酚的酚類是酚酸的分解產(chǎn)物。

一旦烘烤了pifias，將其移至破碎磨和碾碎機，在其中它們釋放含高濃度糖和大部分化合物的所有糖漿。經(jīng)常洗去所得的龍舌蘭糊狀物以改善糖的提取。

毫無疑問，發(fā)酵是龍舌蘭加工中最重要和最復雜的階段。以水稀釋100％龍占蘭或混合糖漿至達到12-14°brix(80-100g/l糖)。發(fā)酵在30℃的恒溫罐中發(fā)生，但是有些過程在室溫下進行，所述室溫根據(jù)一年的季節(jié)可能會發(fā)生變化。發(fā)酵完全依賴酵母菌和較小程度上乳酸和乙酸細菌的代謝。在龍舌蘭醬中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多酵母菌菌株，其中最重要的是釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和非洲克勒克酵母(kloeckeraafricana)。酵母菌代謝碳水化合物，氨基酸，脂肪酸和其他有機化合物，將其轉(zhuǎn)化為乙醇，甘油，二氧化碳，并在較少程度上轉(zhuǎn)化成醛，酮，高級醇，有機酸和酯，這被稱為“發(fā)酵副產(chǎn)物”或“同類物”。通過酮酸(2-氧代酸)降解氨基酸形成高級醇，由于其類似麥芽口感和灼口的味道也稱為“雜醇”。最重要的是1-丙醇，2-甲基-1-丙醇，2-甲基丁醇，3-甲基丁醇和2-苯基乙醇，后者具有類似玫瑰的香氣。酵母細胞內(nèi)的脂肪酸的合成主要形成具有偶數(shù)個數(shù)的4至18個碳原子的飽和直鏈脂肪酸，而具有奇數(shù)碳數(shù)和不飽和度的低水平脂肪酸的出現(xiàn)取決于發(fā)酵條件。脂肪酸可與醇結(jié)合形成酯。

發(fā)酵在30至35℃下進行18至24小時。35℃的處理溫度比30℃產(chǎn)生更多的揮發(fā)性化合物。也已經(jīng)觀察到，在發(fā)酵期間補充氮源可以改變通過酵母菌導致的化合物形成，盡管效果根據(jù)所用的氮源而不同。通過加入20種氨基酸的混合物，非洲克勒克酵母(kloeckeraafricana)菌株k1能夠產(chǎn)生和耐受較高的乙醇濃度，同時某些酯，醇，乙醛和α-松油醇的產(chǎn)生增加。當使用釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)時必須補充硫酸鈉和氨基酸，戊醇和異丁醇的濃度降低，而丙醇和乙醛增加。

一旦發(fā)酵結(jié)束，醇含量達到約15％v/v，則是進行蒸餾的時間。將發(fā)酵的糊狀物在銅釜或不銹鋼釜中在78-80℃加熱，從而實現(xiàn)酒精的蒸發(fā)。蒸氣在冷卻的盤管中冷凝，并收集餾出物。第一餾出物達到～25％v/v的酒精濃度，并且需要也稱為精餾的第二次蒸餾，以達到～55％v/v的乙醇。然后用水將液體調(diào)節(jié)至38-40％v/v酒精。由于大多數(shù)化合物是揮發(fā)性的，因此在蒸餾期間其隨乙醇一起蒸發(fā)。在蒸餾過程中可以分離不同的揮發(fā)物餾分或“分餾成分”。開頭分餾成分包含高揮發(fā)性化合物，如乙醛和乙酸乙酯，而尾分餾成分則有較高沸點的化學物質(zhì)，如長鏈脂肪酸的乙酯。由于這兩個餾分都是不希望的，其可以與核心分餾成分分開。盡管甲醇沸點低，但是在尾分餾成分得到甲醇。在尾餾餾分中也蒸餾出乳酸乙酯，乙酸和糠醛。異丁基和異戊醇作為開頭產(chǎn)物，在核心分餾成分中發(fā)現(xiàn)正丙醇，苯乙醇表現(xiàn)出尾分餾成分產(chǎn)物性質(zhì)。

熱在蒸餾期間對化合物產(chǎn)生起重要作用。因此，可能發(fā)生一些分解反應，發(fā)生醛，酮，呋喃，硫化合物，吡嗪和酚的形成。

用水調(diào)節(jié)至40％乙醇含量的精餾餾出物可以在橡木桶中陳化2個月至3年。醛蒸發(fā)和/或形成乙縮醛。通過在木桶中陳化，揮發(fā)性化合物如香草醛，愈創(chuàng)木酚，丁子香酚，甲酚和其它酚類物質(zhì)從木材遷移到餾出物，從而使風味變得復雜。乙酸酯不僅在發(fā)酵過程中，而且也在陳化過程中形成。已有報道，酯可以隨后在陳化過程中通過高濃度的脂肪酸與乙醇酯化而形成。

前面的描述在如上述參考文獻中所發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)鑒定了由其制備的為龍舌蘭提取物和/或烈酒成分的多種多樣化合物；然而，根據(jù)申請人的知識，人們尚未理解通常作為特奎拉龍舌蘭酒銷售的或其他源自龍舌蘭的飲料含有mao抑制活性。如已知的，mao抑制劑可用作情緒提升劑，抗抑郁藥和各種其他疾病，包括帕金森病的治療，由這些飲料的無酒精組分組成的非酒精“能量飲料”可用于這些上下文情況。

技術實現(xiàn)要素：

如上所述，本發(fā)明利用了由龍舌蘭提取物制備的烈酒中mao抑制劑的存在。mao抑制劑可以最初存在于提取物中或在發(fā)酵期間形成或在蒸餾或陳化期間形成，以及上述情況的組合。特別地，申請人已經(jīng)表明，通過施加真空來從這些商業(yè)上可獲得的烈酒中除去酒精破壞了至少一些mao抑制活性。因此，本發(fā)明的組合物必須通過保留這些揮發(fā)性組分的方法從這些烈酒制備。這些方法包括反滲透，離心柱和其它不會導致?lián)]發(fā)性化合物損失的方法。

因此，在一個方面，本發(fā)明涉及通過對源自龍舌蘭的酒精飲料施以反滲透或其它保留揮發(fā)性組分的方法來制備的組合物。在一個實施方式中，源自龍占蘭的酒精飲料已通過以下方式制備：加熱龍舌蘭仙人掌的莖以使得復合糖水解；切碎和碾碎加熱的莖以釋放糖漿；用水將所述糖漿稀釋至12-14brix水平并接種酵母菌；對接種后的稀釋糖漿進行發(fā)酵以獲得發(fā)酵產(chǎn)物；蒸餾發(fā)酵產(chǎn)物以獲得餾出物。

本發(fā)明也涉及通過給需要該治療的對象施用有效量的本發(fā)明組合物來治療以mao過度活動為特征的病癥的方法。這在抑郁癥或帕金森病的情況下尤為重要。

此外，本發(fā)明涉及在乙醇存在下檢測mao抑制活性的方法。顯著量的乙醇會干擾該檢測。因此，不考慮酒精存在的標準檢測將提供誤導的結(jié)果。

因此，在另一方面，本發(fā)明涉及在乙醇存在下檢測mao抑制劑的方法，該方法包括向檢測中中加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和乙醇脫氫酶。更詳細來說，該檢測包括向待分析的樣品中加入底物有效量的犬尿胺二氫溴酸鹽以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和乙醇脫氫酶；加入maoa或maob；在37℃下孵育：用強堿終止反應并以310nm的激發(fā)波長和405nm的發(fā)射波長評估結(jié)果。

附圖說明

圖1顯示了按以標準商業(yè)檢測試劑盒評估的，不同年數(shù)的特奎拉龍舌蘭酒中mao抑制活性的評估結(jié)果。

圖2顯示了使用犬尿胺作為底物評估各種品牌和年數(shù)特奎拉龍舌蘭酒的mao抑制活性的結(jié)果。

圖3顯示了將特奎拉龍舌蘭酒分離成各種餾分后，使用犬尿胺作為底物的mao抑制檢測的結(jié)果。

圖4是顯示基于犬尿胺檢測的各種柱餾分的mao抑制活性的圖。

圖5顯示已施以反滲透的特奎拉龍舌蘭酒樣品中mao抑制檢測的結(jié)果，并將濃縮物中的活性與濾液中的活性進行比較。

發(fā)明實施方式

由龍占蘭植物提取物制成的酒精飲料的無酒精形式的是本發(fā)明的主題。這些酒精飲料包括普奎龍舌蘭酒(pulque)，特奎拉龍舌蘭酒，梅茲卡龍舌蘭酒(mezcal)，索托龍舌蘭酒(sotol)，巴卡諾拉龍舌蘭酒(bacanora)或其他由源自龍舌蘭植物的糖制成的發(fā)酵物。在本發(fā)明中，酒精在其它揮發(fā)性化合物被保留的條件下被除去。

這些組合物具有單胺氧化酶(mao)抑制性質(zhì)，并由此可用作情緒提升劑，抗抑郁藥或某些疾病如帕金森病的治療。本發(fā)明還涉及通過在酒精存在下評估m(xù)ao活性，分級和制備或混合不同提取物以選擇所需生理刺激劑或抗抑郁作用以用作能量飲料和/或情緒提升劑的方法。在本發(fā)明的分級/評價工具方面，不同的基于龍舌蘭的飲料接受每種形式的mao，a+b的單胺氧化酶(mao)抑制分級，其表示為相對于不存在抑制劑的對照物的抑制百分比。實施例6顯示了對于梅茲卡龍舌蘭酒(mescal)，特奎拉龍舌蘭酒，巴卡諾拉龍舌蘭酒，索托龍舌蘭酒和奎普龍舌蘭酒分級的實例。實施例7顯示了當分析通過反滲透獲得的餾分時的類似結(jié)果。

如本文所示，可以直接分析各種源自龍舌蘭的飲料中其maoa和maob抑制劑的含量。這使得可以有評級系統(tǒng)，其中特定飲料的結(jié)果可以包括在標簽上。例如，各種飲料可以在基于其與其他品牌相同飲料相比的含量的等級上來分級。評級可以是針對maoa和maob的抑制劑的組合或者獨立地針對每種。因此，對于1-10的等級，10是最佳評級，1是最差，與相同檢測中的競爭品牌所顯示的40％抑制相比，顯示80％的maoa抑制的飲料可以給予9，相比較低活性飲料為5。可以設計抑制與特定等級的相關性，以向消費者提供有幫助的信息。所使用的等級或所選擇的評級當然不一定是1-10，而是可以任意選擇其他等級，如a-f。

用于測量抑制百分比的mao檢測法接受具有高濃度乙醇的樣品。本發(fā)明的檢測方法對于準確測量mao活性的抑制是必要的，并且必須耐受有大于40％乙醇的樣品，其是待分級的對象樣品的主要成分。蒸餾龍占蘭烈酒通常遇到的酒精范圍為普奎龍舌蘭酒的6％到某些特奎拉龍占蘭酒和梅茲卡龍舌蘭酒的約60％，但更常見是會有40％酒精(80標準酒精度)的樣品。由于某些(但不是全部)來自基于龍舌蘭飲料的mao抑制劑的揮發(fā)性，特別重要的是不要在減壓下或通過在大氣壓下蒸餾從樣品中蒸發(fā)乙醇。

本發(fā)明的組合物可以用作食品添加劑和/或包含在食品或藥物中，或用于治療抑郁癥，帕金森病或一般不適。組合物也可用作咖啡或脫咖啡因產(chǎn)品中的輔助劑或替代品。組合物可以與藥學上或營養(yǎng)上可接受的兩種或更多種載體，賦形劑和/或稀釋劑混合。因此，一般來說，本發(fā)明的組合物可以包含在果汁或其他軟飲料如可樂或水果味蘇打水中，或者可以直接食用。組合物還可以包括在食品中，如未煮的液體，例如沙拉醬，并與沙拉的固體組分一起食用。要食用或施予受試者的組合物的量高度依賴于待治療疾病性質(zhì)以及被確定為組合物本身中的mao抑制劑的濃度。可用于各種醫(yī)學適應癥的mao抑制劑的水平是本領域已知的，并且可以遵循這些指南。對作為食品補充劑的用途，這是營養(yǎng)學家或其他從業(yè)者的判斷問題。

因此，本發(fā)明包括含有本發(fā)明組合物的食品和飲料，本發(fā)明組合物的量能有效具有所需的生理效應。

從飲料起始材料中除去乙醇的一個成功的方法是反滲透(ro)。有大約100道爾頓分子量截留的ro膜將乙醇與微生物或蒸餾期間形成的mao的抑制劑或可能天然存在于起始材料中的抑制劑分離。在不使用真空或蒸餾的情況下完成mao抑制劑的分離。因此，本發(fā)明組合物可以例如通過用蒸餾水將0.75升特奎拉龍舌蘭酒(或其他蒸餾龍舌蘭飲料)稀釋至7.5-75升的體積來制備，稀釋體積取決于最終所需的乙醇濃度。例如，將0.75升80標準酒精度(40體積％酒精)的特奎拉龍舌蘭酒稀釋至7.5升，在該點稀釋的物質(zhì)為4體積％酒精。稀釋的特奎拉龍舌蘭酒在配有～100道爾頓分子量截留膜(tangentmembranes，inc.，romini)的反滲透單元中循環(huán)，其中稀釋的材料被濃縮回0.75升的體積。通過將材料再次稀釋至7.5升或更高體積并且繼續(xù)通過ro單元循環(huán)來實現(xiàn)另外的乙醇減少。為了產(chǎn)生如根據(jù)本發(fā)明的能量飲品的組合物，可以繼續(xù)進行稀釋和隨后的循環(huán)，直到產(chǎn)品被認為無酒精。隨后活性mao抑制劑包含于濃縮的無酒精部分中，然后可以根據(jù)需要補充維生素，礦物質(zhì)，氨基酸，蛋白質(zhì)或咖啡因，并且可以如上所述包括在其它食品或飲品制品中。

在產(chǎn)生本發(fā)明的組合物中，重要的方面是某些mao抑制劑為揮發(fā)性化合物，并且如果通過加熱蒸餾或在減壓下蒸發(fā)乙醇來產(chǎn)生組合物，例如，會發(fā)生重要mao抑制劑的損失。

提供以下實施例來展示而不是限制本發(fā)明。

實施例1

使用市售檢測來檢測各種特奎拉龍占蘭酒使用市售的mao活性試劑盒來測試不同的市售特奎拉龍舌蘭酒s或梅茲卡龍舌蘭酒，s1，s1dw，s2和s3的樣品。該試劑盒購自西格瑪阿爾德里奇公司(sigma-aldrich)(目錄號mak136單胺氧化酶活性試劑盒)，其包括已知的mao抑制劑化合物，氯吉靈和帕吉林作為對照以及酪胺作為酶底物。該試劑盒中還包含辣根過氧化物酶以與酪胺氧化產(chǎn)生的過氧化氫相互作用，來與包含的標記物紅反應。maoa和/或b的作用產(chǎn)生了導致熒光發(fā)射的事件級聯(lián)。s1和s3是特奎拉龍舌蘭酒，s1為s3的陳年版本，而s1dw是在氬氣流干燥后的蒸餾水重構(gòu)s1樣品。s2是梅茲卡龍舌蘭酒樣品，由藍龍舌蘭以外的龍占蘭種類制成。dw是蒸餾水。計算相對于緩沖液對照樣(無抑制劑)的抑制百分比的熒光數(shù)據(jù)。作為對照，包括已知的maoa抑制劑氯吉靈和已知的maob抑制劑帕吉林。如圖1所示，取決于樣品可以實現(xiàn)maoa或b的選擇性抑制。

實施例2

使用僅用犬尿胺的檢測來測試各種特奎拉龍舌蘭酒

在該實施例中使用不同的檢測法，其中只有犬尿胺是底物和檢測標記物。該測定使用犬尿胺作為mao底物，并且其為maoa和b兩者的底物。由此是更理想的方法，因為消除了對過氧化物酶或光譜干擾的影響。犬尿胺氧化導致360nm和320nm處的od變化。產(chǎn)物也是熒光性的，并且可以通過以320nm的激發(fā)波長在400nm的發(fā)射強度的增加來檢測。

根據(jù)以下方案在透明聚苯乙烯96孔板中設置檢測：向孔中加入磷酸鹽緩沖液(205μl/100mm/ph7.2)，隨后加入10μm的20μl每種提取物樣品和對照抑制劑氯吉靈(對于maoa)和帕吉林(對于maob)。重組人maoa和maob(0.5mg/ml蛋白質(zhì))購自并向每個檢測提供3μg該蛋白質(zhì)。一些檢測以無蛋白質(zhì)進行作為對照，也由提供。使抑制劑，緩沖液和蛋白質(zhì)在設定在37℃的powerwave^tm光密度讀數(shù)板讀數(shù)器中預孵育10分鐘。然后向每個孔中加入犬尿胺底物，并將該板在37℃下進一步孵育30分鐘。在od360nm對板進行讀取，計算從0到30分鐘的吸光度變化，并轉(zhuǎn)化成％抑制。樣品s40，s41，s42分別為龍舌蘭銀酒(blanco)，未滿一年陳的龍舌蘭酒(reposado)和陳釀龍舌蘭酒(anejo)，并且是相同制造商在0，1和2級陳化的特奎拉龍舌蘭酒。s1，s3為如實施例1的特奎拉龍舌蘭酒，s2是梅茲卡龍舌蘭酒。從時間0到30分鐘的360nm處的光密度變化計算抑制百分數(shù)。

結(jié)果示于圖2中。

(含有40％乙醇的用作樣品的一種特奎拉龍占蘭酒(dj1942)測試沒有乙醇脫氫酶和nad檢測的干擾效應并且顯示出干擾)。

實施例3

陳化的影響

使用犬尿胺檢測來測試三種不同年數(shù)的特奎拉龍舌蘭酒，s40，s41，s42，并比較這些樣品的水和二氯甲烷提取物。相比年數(shù)較短的餾出物，陳化的特奎拉龍舌蘭酒顯示增加的mao抑制活性，如圖3所示。

實施例4

mao抑制劑活性分級

用去離子水將特奎拉龍舌蘭酒(1750ml)稀釋至5000ml并分成三份，每份以二氯甲烷(4×100ml)提取。合并提取物，以去離子水(2×100ml)洗滌，并過無水硫酸鈉干燥。通過使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑，將樣品體積減少至10ml，然后加入干二氧化硅，并在室溫下除去溶劑。將樣品吸附的二氧化硅干負載在具有50ml床體積的二氧化硅柱上，并使用己烷∶乙酸乙酯(100％己烷，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80，10∶90，100％乙酸乙酯)的梯度對柱進行操作。在柱運行期間，收集7ml餾分。樣品檢測如下：

a和b的mao檢測設置于黑色thermoscientific^tm96孔板(#7205)中，每個檢測含有溶解于dmso中的1μl樣品，87μl的100mmph7.4的磷酸鉀緩沖液，3μl0.75mm犬尿胺儲備液。僅使用dmso的對照樣(0抑制劑)，作為maoa抑制對照的1μldmso中的50微摩爾氯吉靈和作為maob抑制對照的1μldmso中的50微摩爾帕吉林的組被加入到每個板上。當優(yōu)化檢測時，板上有時包括無蛋白質(zhì)組。

以在9μl緩沖液中的750ng蛋白質(zhì)將重組人maoa和maob(supersomes^tm)加入到每個相應檢測的孔中。

將板在37℃保溫30分鐘，然后向每個孔中加入100μl2nnaoh。在激發(fā)波長310和發(fā)射波長405的條件下在熒光分光光度計中對板進行讀取。

為了鑒定柱餾分中的抑制活性，將25μl的每個餾分置于1.5ml微量離心管中，并在savant^tmspeedvac^tm中蒸發(fā)至干。向每個管中加入dmso(5μl)，根據(jù)上述方法檢測1μl的maoa和b抑制活性。圖4顯示了所收集的餾分的maoa和b抑制活性。

在餾分6至13中可以看到顯著的mao抑制。

實施例5

含mao抑制劑的油的制備

將特奎拉龍舌蘭酒(100ml)以去離子水稀釋至200ml，以二氯甲烷(3×50ml)提取。合并提取物，并通過無水硫酸鈉柱。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑，得到30mg油狀物。該油狀物的樣品抑制maoa75％，抑制maob87％。

將特奎拉龍舌蘭酒(100ml)以去離子水稀釋至200ml，以二氯甲烷(3×50ml)提取。合并提取物，并通過無水硫酸鈉柱。通過在70℃的水浴上加熱的kudernadanish裝置中蒸發(fā)除去溶劑，得到17mg油狀物。油狀物的樣品顯示出55％的maoa抑制和88％的maob抑制。

實施例6

各種特奎拉龍舌蘭酒樣品本身的測定

如上所述，有mao抑制活性的樣品不能在減壓下蒸發(fā)，否則化合物將與乙醇共蒸發(fā)。因此，樣品應在無乙醇蒸發(fā)的情況下進行檢測，以消除mao抑制化合物的損失，并來準確地評級所分析產(chǎn)物的mao抑制活性。在黑色thermoscientific^tm96孔板(#7205)中如下設置檢測：

每個檢測在有100mmph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水的93μl總體積中包括5μl的樣品，0.975μg犬尿胺二氫溴酸鹽，0.75微摩爾煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)。

將乙醇脫氫酶稀釋至0.25單位/ml，并向孔中加入3μl。將板在25至37℃孵育15分鐘。

將以5mg/ml提供的人重組maoa和b(corning)以每份20μl等分在的小瓶中，并用246μl的緩沖液稀釋用于檢測，然后將4μl的每種mao加入其各自孔中。

將板在37℃下保溫30分鐘，加入2nnaoh(100μl)，并在激發(fā)波長310和發(fā)射波長405的條件下對板進行讀取。

使用該檢測，測試了各種特奎拉龍舌蘭酒樣品，結(jié)果如表1所示。

表1各種源自龍舌蘭的飲料的分級

實施例7

反滲透(ro)的影響

使用配有～100mwco過濾器的tangentmembranes，inc.的romini將乙醇從特奎拉龍占蘭酒分離，同時保留mao抑制化合物。這里，以蒸餾水將1.5升陳釀特奎拉龍舌蘭酒(dja)稀釋至15升，并在romini中循環(huán)，直到體積減少回1.5升。評估10，20，30和40μl濃縮樣品和濾液的mao抑制活性(圖5)。

如圖5所示，濃縮物保留了maoa和b抑制劑，而mao抑制劑不存在于僅含有來自稀釋樣品的乙醇和水的濾液中。

表2顯示了各種飲料以及稀釋的特奎拉龍舌蘭酒原料(標記稀釋的ro對照)，第一ro濃縮物，第二ro濃縮物，第一ro濾液和第二ro濾液的結(jié)果。在mao抑制檢測中顯示濾液具有較少的抑制活性，而大部分活性隨濃縮物保留。

表2