發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明提供了充當(dāng)bace1抑制劑的化合物。本發(fā)明的單獨方面涉及包括所述化合物的藥物組合物以及這些化合物治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的用途。
背景技術(shù)：
：癡呆是臨床綜合征，其特征在于無法通過正常衰老解釋的多個認(rèn)知區(qū)缺陷、功能顯著下降和無譫妄。另外，經(jīng)常存在神經(jīng)精神癥狀和局灶性神經(jīng)表現(xiàn)?；诓∫?qū)W，將癡呆進(jìn)一步分類。阿爾茨海默病(ad)是癡呆的最常見原因，其次是混合型ad和血管性癡呆、路易體癡呆(dlb)以及額顳葉癡呆。β-淀粉樣沉積物和神經(jīng)原纖維纏結(jié)被認(rèn)為是與ad相關(guān)的主要病理性表征，ad由記憶、認(rèn)知、推理、判斷以及定向喪失表征。隨著疾病發(fā)展，還受影響的是運(yùn)動、感覺和語言能力，直到出現(xiàn)多種認(rèn)知功能的整體缺損。β-淀粉樣沉積物主要是aβ肽的凝集體，該凝集體進(jìn)而作為β-成淀粉樣途徑的一部分的淀粉樣前體蛋白(app)蛋白水解的產(chǎn)物，αβ肽產(chǎn)生自一種或多種γ-分泌酶在c-末端裂解app以及β-分泌酶1(bace1)在n-末端裂解app，該β-分泌酶1又稱天冬氨酰蛋白酶2。bace1活性與自app生成αβ肽直接相關(guān)。研究表明bace1的抑制妨礙αβ肽的產(chǎn)生。此外，bace1與其底物app共定位于高爾基體和胞吞區(qū)室中(willemm(威廉m)等人semin.celldev.biol(細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)研討會)，2009，20，175-182)。小鼠敲除研究已經(jīng)證實了不存在淀粉樣蛋白肽形成，同時這些動物是健康且能育的(ohnom(大野m)等人neurobiol.dis.(疾病神經(jīng)生物學(xué))，2007，26，134-145)。過量表達(dá)app的小鼠中bace1遺傳消除已經(jīng)證實了斑塊形成的不存在和認(rèn)知缺陷的逆轉(zhuǎn)(ohnom(大野m)等人neuron(神經(jīng)元)；2004，41，27-33)。在散發(fā)性ad患者的腦中評估bace1水平(hampel(漢佩爾)和shen(沈)，scand.j.clin.lab.invest.(臨床與實驗室研究斯堪的納維亞雜志)2009，69，812)。這些匯聚的發(fā)現(xiàn)表明，bace1的抑制可以作為用于治療ad以及aβ沉積的減少對其而言有益的障礙的治療靶標(biāo)。astrazeneca(阿斯利康公司)于2012年10月通告了azd3839的發(fā)現(xiàn)，azd3839是一種用于治療ad的有效的bace1抑制劑臨床候選物(jeppsson,f.(杰普遜，f.)等人，j.biol.chem.(生物化學(xué)雜志)，2012，287，41245-41257)。導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)azd3839的努力被進(jìn)一步描述于ginman,t.(吉恩曼，t.)等人j.med.chem.(藥物化學(xué)雜志)，2013，56，4181-4205中。ginman(吉恩曼)公開物描述了克服與azd3839的發(fā)現(xiàn)與鑒定相聯(lián)系的問題。這些問題涉及這些化合物的弱的血腦屏障穿透性和p-糖蛋白介導(dǎo)的外排，從而導(dǎo)致缺乏腦暴露。ginman(吉恩曼)原稿假定腦暴露中的這些差異在很大程度上歸因于核心結(jié)構(gòu)并且提供了結(jié)構(gòu)活性關(guān)系數(shù)據(jù)，其中根據(jù)核心亞型，將報道的化合物的體外特性給出于四個表中。在表4中，描述了一系列含脒化合物，這些化合物從活性視角被認(rèn)為是令人感興趣的。然而，數(shù)據(jù)暗示含脒核心未展示出有利的血腦屏障穿透曲線。來自hoffmann-laroche(豪夫邁·羅氏公司)和sienabiotech(錫耶納生物技術(shù)公司)的研究人員也報道了含脒化合物的發(fā)現(xiàn)(woltering,t.j.(沃爾特林，t.j)等人，bioorg.med.chem.lett.(生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊)2013，23，4239-4243)。發(fā)現(xiàn)這些化合物(該文章中的化合物17和18)不具有任何體內(nèi)作用(野生型小鼠腦中缺少aβ40減少)。與ginman(吉恩曼)等人和woltering,t.j.(沃爾特林，t.j)等人的教導(dǎo)相反，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列脒化合物，這些脒化合物是腦穿透物的。因此，本發(fā)明涉及具有bace1抑制活性的新穎化合物、涉及其制備、涉及其醫(yī)學(xué)用途并且涉及包括它們的藥物。發(fā)明概述本發(fā)明的目的在于提供抑制bace1的化合物。因此，本發(fā)明涉及具有化學(xué)式i的化合物。其中ar選自下組，該組由以下各項組成：苯基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、噁唑基、異噁唑基，并且其中該ar任選地被一個或多個選自鹵素、cn、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、c1-c6氟烷基或c1-c6烷氧基的取代基取代；并且r1是氫、鹵素、c1-c3氟烷基或c1-c3烷基；或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于在治療中使用的具有化學(xué)式i的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含一種具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和一種藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施例中，本發(fā)明提供了具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的藥物中的用途。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種用于在一種治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的方法中使用的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的方法，包括向?qū)ζ溆行枰幕颊呓o予治療有效量的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。下文即提供本發(fā)明的另外的實施例：在一個實施例中，該化合物具有化學(xué)式ia或其藥學(xué)上可接受的鹽。在一個實施例中，r1是f或h，特別地是f。在一個實施例中，ar任選地被一個或多個f、cl、br、cn、c1-c3烷基、c1-c3氟烷基或c1-c3烷氧基取代。在一個實施例中，ar是任選取代的苯基。在一個實施例中，ar是任選取代的吡啶基。在一個實施例中，ar是任選取代的嘧啶基。在一個實施例中，ar是任選取代的吡嗪基。在一個實施例中，ar是任選取代的咪唑基。在一個實施例中，ar是任選取代的吡唑基。在一個實施例中，ar是任選取代的噻唑基。在一個實施例中，ar是任選取代的噁唑基。在一個實施例中，ar是任選取代的異噁唑基。在一個實施例中，該化合物選自下組，該組由以下各項組成：(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基-3-甲基吡嗪-2-甲酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-甲酰胺或其藥學(xué)上可接受的鹽。一個單獨實施例涉及一種藥物組合物，該藥物組合物包括來自上列表的一種化合物以及一種藥學(xué)上可接受的載體。另一個實施例涉及治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的方法，該方法包括給予治療有效量的來自上列表的一種化合物。又一個實施例涉及來自上列表的一種化合物在生產(chǎn)用于治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙的藥物中的用途。一個實施例是用于在療法中使用的、來自上列表的一種化合物。又一個實施例涉及用于在治療神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙中使用的、來自上列表的一種化合物。發(fā)明的詳細(xì)說明本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，具有化學(xué)式i的化合物是bace1的抑制劑，并且正因為如此，有用于治療相關(guān)障礙。下文更加詳細(xì)地解釋本發(fā)明的某些方面，但是本說明不旨在是可以實施本發(fā)明的所有不同方式的詳細(xì)目錄，或可以加入本發(fā)明中的所有特征的詳細(xì)編錄。因此，以下說明旨在闡明本發(fā)明的一些實施例，并不旨在完全詳細(xì)說明其所有排列、組合以及變化。如在此所使用，術(shù)語“c1-c6烷基”是指具有從一個至六個(包含端值)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c6烷基的實例包括但不限于，甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丙基、正戊基以及正己基。類似地，術(shù)語“c1-c3烷基”是指具有從一個至三個(包含端值)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。此類取代基的實例包括但不限于，甲基、乙基和正丙基。同樣地，術(shù)語“c1-c6烷氧基”是指具有從一個至六個(包含端值)碳原子并且開放原子價在氧上的直鏈或支鏈飽和烷氧基。c1-c6烷氧基的實例包括但不限于，甲氧基、乙氧基、正丁氧基、叔丁氧基以及正己氧基。“c1-c6烷氧基”任選地被一個或多個氟原子取代。如在此所使用，術(shù)語“c1-c6氟烷基”是指具有從一個至六個(包含端值)碳原子的被一個或多個氟原子取代的直鏈或支鏈飽和烴。c1-c6氟烷基的實例包括但不限于，三氟甲基、五氟乙基、1-氟乙基、單氟甲基、二氟甲基、1,2-二氟乙基以及3,4-二氟己基。類似地，術(shù)語“c1-c3氟烷基”是指具有從一個至三個(包含端值)碳原子，每個碳原子被一個或多個氟原子取代的直鏈或支鏈飽和烴。術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴以及碘。術(shù)語“c2-c6烯基”是指具有從兩個至六個碳原子和一個雙鍵的支鏈或非支鏈烯基，包括但不限于乙烯基、丙烯基和丁烯基。術(shù)語“c2-c6炔基”應(yīng)意指具有從兩個至六個碳原子和一個三鍵的支鏈或非支鏈炔基，包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。如在此所使用，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的化合物時，短語“有效量”是指表示足以引起預(yù)期的生物效應(yīng)的量。當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明的化合物時，短語“治療有效量”是指表示足以改善、減輕、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)、減慢或延緩障礙或疾病狀態(tài)的進(jìn)展、或者該障礙或疾病的癥狀的進(jìn)展的化合物的量。在實施例中，本發(fā)明的方法提供了化合物組合的給藥。在此類情況下，“有效量”是足以引起預(yù)期的生物效應(yīng)的該組合中本發(fā)明的一種化合物的量。如在此所使用，術(shù)語“治療(treatment)”或“治療(treating)”意指改善或逆轉(zhuǎn)疾病或障礙的進(jìn)展或嚴(yán)重性、或者改善或逆轉(zhuǎn)這種疾病或障礙的一種或多種癥狀或副作用。如在此所使用，“治療(treatment)”或“治療(treating)”還意指抑制或阻斷，如延遲、阻止、限制、阻礙或妨礙疾病或障礙的系統(tǒng)、病癥或狀態(tài)的進(jìn)展。出于本發(fā)明的目的，“治療(treatment)”或“治療(treating)”另外指的是一種用于獲得有益的或希望的臨床結(jié)果的方法，其中“有益的或希望的臨床結(jié)果”包括但不限于癥狀的緩解、障礙或疾病程度的減小、穩(wěn)定化的(即沒有惡化的)疾病或障礙狀態(tài)、疾病或障礙狀態(tài)的延緩或減慢、疾病或障礙狀態(tài)的改善或減輕、以及疾病或障礙的緩解，不論是否是部分地或全部地。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)，具有化學(xué)式i的化合物是bace1的抑制劑，并且正因為如此，有用于治療障礙，這些障礙的病理學(xué)特征包括β-淀粉樣沉積物和神經(jīng)原纖維纏結(jié)，例如神經(jīng)變性或認(rèn)知障礙。如上所討論，預(yù)期本發(fā)明的化合物有用于治療阿爾茨海默病，這是由于它們對β-淀粉樣沉積物和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的作用。這包括家族性阿爾茨海默病，其中患者的特定基因上攜帶突變，這些基因與aβ肽的產(chǎn)生密切相關(guān)。然而，重要的是注意到，aβ肽的凝集體不限于家族性阿爾茨海默病，而是類似地，更普遍的散發(fā)性阿爾茨海默病的一個重要的病理生理特征[molcellneurosci，66，3-11，2015]。還認(rèn)為本發(fā)明的化合物有用于治療早期阿爾茨海默病，即生物學(xué)和結(jié)構(gòu)改變已經(jīng)開始，但是該疾病的臨床表現(xiàn)還未變得明顯或未很好地發(fā)展的疾病階段。事實上，早期阿爾茨海默病可在該疾病的任何臨床表現(xiàn)變得明顯之前多年之前開始。早期阿爾茨海默病包括前驅(qū)阿爾茨海默病、臨床前阿爾茨海默病和輕度認(rèn)知缺損。盡管輕度認(rèn)知缺損可能與阿爾茨海默病無關(guān)，但它通常是阿爾茨海默病的過渡階段或是因阿爾茨海默病而產(chǎn)生的。臨床前和前驅(qū)阿爾茨海默病是無癥狀期，并且典型地它們通過阿爾茨海默病相關(guān)的生物標(biāo)志的存在而診斷出來。在此背景下，認(rèn)為本發(fā)明的化合物有用于減緩早期阿爾茨海默病的進(jìn)展(例如，輕度認(rèn)知缺損到阿爾茨海默病)。還認(rèn)為本發(fā)明的化合物有用于治療記憶喪失、注意力不足以及與阿爾茨海默病相關(guān)的癡呆。除了阿爾茨海默病的連續(xù)體之外，其他疾病的特征在于β-淀粉樣沉積物和神經(jīng)原纖維纏結(jié)。這包括例如21三體綜合癥，又稱為唐氏綜合癥。罹患唐氏綜合癥的患者具有一條額外的21號染色體，該染色體包含用于淀粉樣前體蛋白(app)的基因。這條額外的21號染色體導(dǎo)致app的過度表達(dá)，由此導(dǎo)致增高的aβ肽水平，最終引起發(fā)生阿爾茨海默病的風(fēng)險顯著增加(見于唐氏綜合癥患者中)[alzheimer’s&dementia(阿爾茨海默病&癡呆)，11，700-709，201]。大腦淀粉樣血管病的特征也在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管中β-淀粉樣沉積物和神經(jīng)原纖維纏結(jié)[pharmacolreports(藥理學(xué)報告)，67，195-203，2015]，并且正因為如此，預(yù)期也可用本發(fā)明的化合物進(jìn)行治療。在一個實施例中，本發(fā)明提供了一種治療疾病的方法，所述疾病選自阿爾茨海默病(家族性或散發(fā)性)、臨床前阿爾茨海默病、前驅(qū)阿爾茨海默病、輕度認(rèn)知缺損、唐氏綜合癥和大腦淀粉樣血管病，該方法包括向?qū)ζ溆行枰幕颊呓o予治療有效量的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制患者的bace1的方法，該方法包括向?qū)ζ溆行枰幕颊呓o予治療有效量的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。本發(fā)明還提供了抑制淀粉樣前體蛋白的β-分泌酶介導(dǎo)的裂解的方法，該方法包括向?qū)@樣的治療有需要的患者給予治療有效量的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另外的實施例中，本發(fā)明提供了具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在生產(chǎn)用于治療疾病的藥物中的用途，所述疾病選自阿爾茨海默病(家族性或散發(fā)性)、臨床前阿爾茨海默病、前驅(qū)阿爾茨海默病、輕度認(rèn)知缺損、唐氏綜合癥或大腦淀粉樣血管病。本發(fā)明還提供了具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在生產(chǎn)用于抑制bace1的藥物中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在生產(chǎn)用于抑制aβ肽的產(chǎn)生或積累的藥物中的用途。在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于在一種治療疾病的方法中使用的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，所述疾病選自阿爾茨海默病(家族性或散發(fā)性)、臨床前阿爾茨海默病、前驅(qū)阿爾茨海默病、輕度認(rèn)知缺損、唐氏綜合癥或大腦淀粉樣血管病。在一個實施例中，本發(fā)明涉及用于在一種抑制bace1的方法中或在一種抑制aβ肽的產(chǎn)生或積累的方法中使用的具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另外的實施例中，本發(fā)明提供了適于以上治療和用途中的任一種的藥物制劑。在一個實施例中，該哺乳動物是人。在一個實施例中，該患者是人類患者。本發(fā)明還包括本發(fā)明化合物的鹽，典型地是藥學(xué)上可接受的鹽。此類鹽包括藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。酸加成鹽包括無機(jī)酸和有機(jī)酸的鹽。適合的無機(jī)酸的代表性實例包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、磷酸、硫酸、氨基磺酸、硝酸以及類似物。適合的有機(jī)酸的代表性實例包括甲酸、乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、丙酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、反丁烯二酸、乙醇酸、衣康酸、乳酸、甲烷磺酸(methanesulfonic)、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、苯乙醇酸、草酸、苦味酸、丙酮酸、水楊酸、丁二酸、甲烷磺酸(methanesulfonic)、乙烷磺酸、酒石酸、抗壞血酸、帕莫(pamoic)酸、雙亞甲基水楊酸、乙烷二磺酸、葡萄糖酸、檸康酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、edta、乙醇酸、對氨基苯甲酸、谷氨酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、茶堿乙酸以及8-鹵代茶堿(例如8-溴茶堿以及類似物)。藥學(xué)上可接受的無機(jī)或有機(jī)酸加成鹽的另外的實例包括在s.m.berge(s.m.貝爾熱)等人，j.pharm.sci.(藥物科學(xué)雜志)，1977，66，2中列出的藥學(xué)上可接受的鹽。此外，本發(fā)明的化合物能以未溶劑化形式存在以及以與藥學(xué)上可接受的溶劑如水、乙醇等的溶劑化形式存在。本發(fā)明的化合物可以具有一個或多個不對稱中心并且意圖在于，作為分離的、純的或部分純化的光學(xué)異構(gòu)體的任何光學(xué)異構(gòu)體(即對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體)及其任何混合物(包括外消旋混合物)(即立體異構(gòu)體的混合物)都被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在此背景下，應(yīng)該理解的是，當(dāng)指明對映異構(gòu)體形式時，則該化合物處于對映異構(gòu)體過量，例如基本處于純的形式。因此，本發(fā)明的實施例涉及具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少96％、優(yōu)選至少98％的對映異構(gòu)體過量的本發(fā)明的化合物。可以通過已知方法將外消旋形式拆分為旋光對映體，例如通過用光學(xué)活性酸分離其非對映異構(gòu)鹽并且通過用堿處理來離析光學(xué)活性胺化合物?？梢岳缤ㄟ^分步結(jié)晶來實現(xiàn)此類非對映異構(gòu)體鹽的分離。適于此目的的光學(xué)活性酸可以包括但不限于d-或l-酒石酸、苯乙醇酸或樟腦磺酸。另一種用于將外消旋體拆分為旋光對映體的方法是基于在光學(xué)活性基質(zhì)上的色譜法。本發(fā)明的化合物還可以通過由手性衍生化試劑(例如，手性烷基化或?；噭?形成并色譜分離非對映異構(gòu)體衍生物，隨后裂解手性助劑來拆分。以上方法中的任一種都可以應(yīng)用于拆分本發(fā)明的化合物的旋光對映體自身或應(yīng)用于拆分合成的中間體的旋光對映體，然后可以通過在此描述的方法將其轉(zhuǎn)化為作為本發(fā)明的化合物的光學(xué)活性拆分的終產(chǎn)物。可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的用于拆分光學(xué)異構(gòu)體的另外的方法。此類方法包括由j.jaques(j.杰奎斯)，a.collet(a.科勒特)和s.wilen(s.維倫)在“enantiomers，racemates，andresolutions(對映異構(gòu)體，外消旋體與拆分)”，johnwileyandsons(約翰威利父子)，紐約1981中討論的那些。光學(xué)活性化合物還可以由光學(xué)活性起始材料制備。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含治療有效量的一種具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，和一種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供了藥物組合物，該藥物組合物包括治療有效量的披露于實驗部分中的具體化合物之一以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的化合物能以單劑量或多劑量形式單獨給予或與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合給予。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以用藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑以及任何其他已知的佐劑和賦形劑根據(jù)常規(guī)技術(shù)配制，這些常規(guī)技術(shù)是例如在以下中披露的技術(shù)：remington:thescienceandpracticeofpharmacy(雷明頓：藥學(xué)科學(xué)與實踐)，第22版，gennaro(熱納羅)編，mackpublishingco.(馬克出版公司)，伊斯頓，賓夕法尼亞，2013。用于經(jīng)口給予的藥物組合物包括固體劑型，例如膠囊、片劑、糖衣丸、丸劑、錠劑、粉劑以及顆粒劑。適當(dāng)時，根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的方法，這些組合物可以制備為具有包衣，例如腸溶衣，或者它們可以被配制以提供活性成分的控制釋放，例如持續(xù)或長久釋放。用于經(jīng)口給予的液體劑型包括溶液、乳液、懸浮液、糖漿以及酏劑。用于非經(jīng)腸給予的藥物組合物包括無菌水性及非水性可注射溶液、分散液、懸浮液或乳液以及欲在使用之前在無菌可注射溶液或分散液中復(fù)水的無菌粉劑。其他適合的給予形式包括但不限于，栓劑、噴霧劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑、吸入劑、皮膚貼片以及植入物。典型的經(jīng)口劑量范圍從每日約0.001mg/kg體重至約100mg/kg體重。本發(fā)明的化合物通常以游離堿或以其藥學(xué)上可接受的鹽形式利用。一種具有化學(xué)式i的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽例如以常規(guī)方式通過用一摩爾當(dāng)量的藥學(xué)上可接受的酸處理具有化學(xué)式i的游離堿的溶液或懸浮液來制備。適合的有機(jī)酸及無機(jī)酸的代表性實例描述于上文。適合的藥物載體包括惰性固體稀釋劑或填料、無菌水溶液以及不同有機(jī)溶劑。固體載體的實例包括乳糖、白土、蔗糖、環(huán)糊精、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸以及纖維素的低級烷基醚。液體載體的實例包括但不限于，糖漿、花生油、橄欖油、磷脂、脂肪酸、脂肪酸胺、聚氧化乙烯以及水。類似地，該載體或稀釋劑可以包括單獨或與蠟混合的本領(lǐng)域中已知的任何持續(xù)釋放物質(zhì)，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。通過組合具有化學(xué)式i的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽與藥學(xué)上可接受的載體而形成的藥物組合物以多種適于所披露的給予途徑的劑型容易地給予。這些制劑可以方便地通過藥學(xué)領(lǐng)域已知的方法以單位劑型呈現(xiàn)。若將固體載體用于經(jīng)口給予，則該制劑可以被壓片、以粉劑或丸粒形式置于硬明膠膠囊中或它可呈糖錠或錠劑形式。固體載體的量將廣泛變化，但將在每劑量單位從約25mg至約1g的范圍。若使用液體載體，則該制劑可以呈糖漿、乳液、軟明膠膠囊或無菌可注射液體(例如水性或非水性液體懸浮液或溶液)形式。實驗部分可以通過以下反應(yīng)方案1-4和實例中所概述的方法制備本發(fā)明的具有通式i的化合物(其中r1以及ar如上所定義)。在所描述的方法中，能夠使用其本身為本領(lǐng)域熟練的化學(xué)家已知或?qū)Ρ绢I(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言可以是顯而易見的變體或修飾。此外，根據(jù)以下反應(yīng)方案和實例，用于制備本發(fā)明的化合物的其他方法對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言將是容易顯而易見的。例如，方案2描述了在合成本發(fā)明的化合物的過程中使用選擇性保護(hù)基。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠選擇用于具體反應(yīng)的適當(dāng)保護(hù)基。此外，在下文描述的合成方法中，對于例如氨基、酰氨基、酮基及羥基的取代基而言，摻入保護(hù)和脫保護(hù)策略可能是必要的，以合成具有化學(xué)式i的化合物。此類基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)的方法在本領(lǐng)域是熟知的，并且可以發(fā)現(xiàn)于t.green(t.格林)等人，protectivegroupsinorganicsynthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基)，1991，第2版，johnwiley&sons(約翰·威利父子)，紐約中。對于能以兩種或更多種互變異構(gòu)體的混合物或兩種或更多種互變異構(gòu)體的平衡狀態(tài)存在的化合物而言，在方案中僅體現(xiàn)了一種互變異構(gòu)體，盡管它可能不是最穩(wěn)定的互變異構(gòu)體。對于能以對映異構(gòu)體，立體異構(gòu)體或幾何異構(gòu)體形式存在的化合物而言，指明了其幾何構(gòu)型；否則的話，該結(jié)構(gòu)表示立體異構(gòu)體的混合物。使用以下方法獲得分析性lc-ms數(shù)據(jù)。方法a：在沃特斯(waters)aquityuplc-ms上運(yùn)行l(wèi)c-ms，其由以下各項組成：包括柱管理器的沃特斯aquity、二元溶劑管理器、樣品組織器、pda檢測器(在254nm下操作)、els檢測器以及配備有以正離子模式操作的appi源的sq-ms。lc-條件：該柱是acquityuplcbehc181.7μm；2.1x150mm，在60℃下操作，二元梯度為0.6ml/分鐘，該二元梯度由水+0.05％三氟乙酸(a)和乙腈+5％水+0.03％三氟乙酸(b)組成。梯度：0.00min：10％b；3.00min：99.9％b；3.01min：10％b；3.60min：10％b?？傔\(yùn)行時間：3.60min。方法b：在沃特斯(waters)acquityuplc-ms上運(yùn)行l(wèi)c-ms，其由以下各項組成：包括柱管理器的沃特斯aquity、二元溶劑管理器、樣品組織器、pda檢測器(在254nm下操作)、els檢測器以及配備有以正離子模式操作的appi源的tq-ms。lc-條件：該柱是acquityuplcbehc181.7μm；2.1x50mm，在60℃下操作，二元梯度為1.2ml/分鐘，該二元梯度由水+0.05％三氟乙酸(a)和乙腈+5％水+0.05％三氟乙酸(b)組成。梯度：0.00min：10％b；1.00min：100％b；1.01min：10％b；1.15min：10％b?？傔\(yùn)行時間：1.15min。在brukeravanceav-iii-600儀器上在600mhz下或在brukeravanceav-iii-400儀器或varian400儀器上在400mhz下記錄1hnmr波譜。以相對ppm值表示化學(xué)位移值。以下縮寫用于nmr信號的多重性：s＝單峰，d＝雙重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝雙二重峰，ddd＝雙雙二重峰，dt＝雙三重峰，br＝寬峰并且m＝多重峰。作為舉例并且其中苯環(huán)的鄰位中r1是氟，可以如方案1所示制備具有通式iv的化合物。方案1其中r1如在化學(xué)式i下所定義，并且r是烷基(例如甲基或乙基)。具有通式iv的化合物(方案1)可以通過使具有通式ii的化合物與鹵素-金屬交換試劑(例如，丁基鋰)反應(yīng)隨后添加至具有通式iii的酯中來制備。作為舉例并且其中苯環(huán)的鄰位中r1是氟，可以如方案2所示制備具有通式xvi的化合物。方案2其中r2和r3是烷基(例如甲基或乙基)。具有通式vii的化合物(方案2)可以通過使具有通式iv的化合物與亞磺酰胺(例如vi)在路易斯酸(lewisacid)/干燥劑(例如四乙氧基鈦)的存在下反應(yīng)來制備。在zn粉的存在下或在二乙基鋅和三(三苯基膦)銠(i)氯化物的存在下，用具有通式viii的化合物(例如溴二氟乙酸乙酯)處理具有通式vii的化合物給出具有通式ix的化合物。具有通式x的化合物由具有通式ix的化合物通過用還原劑(例如氫化二異丁基鋁)處理而獲得。在一些情況下，化合物x可與水合物形式處于平衡。在氯化鋰和堿(例如n,n-二異丙基乙胺)的存在下，用例如2-(二甲氧基磷?；?-乙酸甲酯的條件處理具有通式x的化合物給出具有通式xi的化合物。通過在催化劑(例如鈀碳)的存在下氫化具有通式xi的化合物獲得具有通式xii的化合物。通過在甲醇中用酸(例如鹽酸)處理具有通式xii的化合物，隨后在甲醇中用碳酸鉀處理或在溶劑(例如，甲苯)中加熱來獲得具有通式xiii的化合物?？梢允褂孟跛釋⒕哂型ㄊ絰iii的化合物硝化，以給出具有通式xiv的化合物。用試劑(例如勞氏試劑(lawesson’sreagent，2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二噻二磷雜環(huán)丁烷-2,4-二硫化物))處理具有通式xiv的化合物，以給出具有通式xv的化合物。將具有通式xv的化合物的硝基還原，以給出具有通式xvi的化合物。具有通式xiv的化合物還可以如方案3所示制備。起始于具有通式ivb的硝基取代的苯乙酮，具有通式xib的化合物可以如方案2所述制備。通過在催化劑(例如鈀碳)的存在下氫化具有通式xib的化合物獲得具有通式xiib的化合物。具有通式xiv的化合物可以如方案2所述制備，用于從具有通式xii的化合物制備具有通式xiii的化合物。保護(hù)具有通式xiv的化合物的苯胺部分，以給出具有通式xivb的化合物。用試劑(例如勞氏試劑，2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二噻二磷雜環(huán)丁烷-2,4-二硫化物))處理具有通式xivb的化合物，隨后脫保護(hù)苯胺部分以給出具有通式xvi的化合物。方案3其中r1如在化學(xué)式i下所定義，并且r3是烷基(例如甲基或乙基)。具有通式i的化合物可以如方案4所示制備。方案4其中r1及ar是如在化學(xué)式i下定義的?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域的熟練化學(xué)師已知的程序，使具有通式xvi的化合物與具有通式xvii的羧酰氯反應(yīng)或通過與具有通式xviii的羧酸反應(yīng)制備具有通式xix的化合物。用氨處理具有通式xix的化合物給出具有通式i的化合物。在一些情況下，添加氧化劑(例如叔丁基過氧化氫物)對于協(xié)助反應(yīng)而言可能是必要的。中間體的制備中間體：2,2-二氟-1-(2-氟苯基)乙烷-1-酮在n2下，經(jīng)15分鐘的時間，在-78℃下，向在thf(200ml)中的1-溴-2-氟苯(10.00g，57.14mmol)的溶液中滴加正丁基鋰(2.5m，24.00ml)。將混合物在-78℃下攪拌30min。在-78℃下滴加2,2-二氟乙酸乙酯(10.64g，85.71mmol)并在-78℃下攪拌2小時。tlc顯示沒有原料剩余。在-78℃下滴加飽和nh4cl水溶液(15ml)。將該反應(yīng)混合物加溫至25℃，用乙酸乙酯(100ml，三次)萃取。將合并的有機(jī)相用鹽水(30ml)洗滌，用無水na2so4干燥，過濾，并在真空中濃縮。將殘余物通過硅膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯＝95:5)，以提供2,2-二氟-1-(2-氟苯基)乙烷-1-酮(5.60g，47.8％收率，85％純度)。1hnmr(cdcl3,400mhz):δ7.99-7.95(m,1h),7.70-7.64(m,1h),7.33(t,j＝7.6hz2h),7.24(dd,j＝10.8,8.4hz,1h),6.59-6.32(m,1h)。中間體：(r)-n-(2,2-二氟-1-(2-氟苯基)亞乙基)-2-甲基丙烷-2-亞磺酰胺在26℃下向在thf(110ml)中的2,2-二氟-1-(2-氟苯基)乙烷-1-酮(5.60g，32.16mmol)和(r)-2-甲基丙烷-2-亞磺酰胺(5.07g，41.81mmol)的溶液中以一次加入的方式添加四乙氧基鈦(14.67g，64.32mmol)。將黃色溶液在80℃下攪拌2.5hr。tlc(石油醚：乙酸乙酯＝3:1)顯示沒有原料剩余。將該混合物冷卻至26℃。將水(10ml)加入到混合物中，并且將其過濾并用乙酸乙酯萃取(60ml，三次)。用鹽水洗滌有機(jī)層，經(jīng)na2so4干燥，過濾并且濃縮，然后通過硅膠柱色譜純化(石油醚：乙酸乙酯＝91:9)，以提供(r)-n-(2,2-二氟-1-(2-氟苯基)亞乙基)-2-甲基丙烷-2-亞磺酰胺(5.60g，61.6％收率，98.1％純度)。中間體：(s)-3-(((r)-叔丁基亞磺?；?氨基)-2,2,4,4-四氟-3-(2-氟苯基)丁酸乙酯在ar下，經(jīng)20分鐘的時間，在-78℃下向在thf(90ml)中的(r)-n-(2,2-二氟-1-(2-氟苯基)亞乙基)-2-甲基丙烷-2-亞磺酰胺(4.60g，16.6mmol)、2-溴-2,2-二氟-乙酸乙酯(6.73g，33.18mmol)以及rh(pph3)3cl(469mg，498μmol)的溶液中滴加二乙基鋅的溶液(1m在thf中，33ml)，其間保持溫度低于-65℃。經(jīng)10分鐘的時間將反應(yīng)混合物加溫至0℃并在0℃下攪拌2小時。tlc(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)顯示原料完全消耗掉。將深紅色溶液用水(40ml)淬滅，然后過濾。將濾液用乙酸乙酯(100ml，兩次)萃取。將合并的有機(jī)相用飽和鹽水(30ml)洗滌，用無水na2so4干燥，過濾，并在真空中濃縮。將粗產(chǎn)物通過硅膠柱色譜(石油醚/乙酸乙酯＝4:1)進(jìn)行純化，以給出(s)-3-(((r)-叔丁基亞磺酰基)氨基)-2,2,4,4-四氟-3-(2-氟苯基)丁酸乙酯(4.26g，62.1％收率)。1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ7.65-7.31(m,1h),7.49-7.44(m,1h),7.23-7.12(m,2h),6.93-6.66(m,1h),5.00(s,1h),4.39-4.29(m,2h),1.39(s,9h),1.32(t,j＝8.0hz,3h)。中間體：(r)-2-甲基-n-((s)-1,1,3,3-四氟-2-(2-氟苯基)-4-氧代丁-2-基)-丙烷-2-亞磺酰胺在n2下在-78℃下向在干thf(35ml)中的(s)-3-(((r)-叔丁基亞磺酰基)氨基)-2,2,4,4-四氟-3-(2-氟-苯基)-丁酸乙酯(3.20g，7.97mmol)的溶液中滴加在甲苯(1.0m，16ml，16mmol)中的dibal-h(氫化二異丁基鋁)的溶液。將混合物在-78℃攪拌2小時。在-78℃下將反應(yīng)小心用甲醇(3ml)淬滅。添加水(20ml)和乙酸乙酯(200ml)并將該混合物加溫至25℃。將混合物老化30分鐘。將所得混合物通過硅藻土襯墊進(jìn)行過濾。將有機(jī)層用鹽水洗滌并且經(jīng)na2so4干燥。將有機(jī)層濃縮，以給出粗產(chǎn)物(r)-2-甲基-n-((s)-1,1,3,3-四氟-2-(2-氟苯基)-4-氧代丁-2-基)丙烷-2-亞磺酰胺，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化而直接用于下一步。中間體：(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺?；?氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)己-2-烯酸乙酯在0℃下在n2下，向在乙腈(30ml)中的licl(405mg，9.56mmol)的攪拌懸浮液中添加2-二乙氧基磷?；宜嵋阴?2.14g，9.56mmol)和dipea(n,n-二異丙基乙胺)(2.06g，15.94mmol)。20min之后，在0℃下將在乙腈(10ml)中的(r)-2-甲基-n-((s)-1,1,3,3-四氟-2-(2-氟苯基)-4-氧代-丁-2-基)丙烷-2-亞磺酰胺(2.85g，7.97mmol)滴加至混合物中并將該混合物在25℃下攪拌17.5小時。將反應(yīng)混合物濃縮以除去乙腈，添加水(50ml)，并且用乙酸乙酯(200ml)進(jìn)行萃取。將有機(jī)層干燥并蒸發(fā)。將粗產(chǎn)物通過柱色譜(石油醚：乙酸乙酯＝5:1至4:1)進(jìn)行純化，以給出(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺酰基)氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)己-2-烯酸乙酯(1.77g，46.8％收率)。中間體：(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺酰基)氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)己酸乙酯向在乙酸乙酯(100ml)中的(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺?；?氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)己-2-烯酸乙酯(1.77g，4.28mmol)的溶液中添加pd/c(400mg，10％)。在45-50psih2下，將黑色懸浮液在25℃下攪拌18小時。將其過濾并濃縮以給出(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺?；?氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)己酸乙酯(1.70g，95.5％收率)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化而直接用于下一步。中間體：(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟苯基)哌啶-2-酮向在二氯甲烷(15ml)中的(s)-5-(((r)-叔丁基亞磺?；?氨基)-4,4,6,6-四氟-5-(2-氟苯基)-己酸乙酯(1.70g，4.09mmol)的溶液中添加hcl/meoh(4m，17ml)。將無色溶液在25℃攪拌1小時。tlc分析顯示沒有原料剩余。將混合物濃縮并且將殘余物溶解于甲苯中。將所得混合物再次濃縮，以給出1.5g的無色油。將該油溶解于甲苯(30ml)中并在100℃下攪拌18小時。在將混合物冷卻至25℃之后，將其濃縮，以給出粗產(chǎn)物，將該粗產(chǎn)物通過硅膠快速色譜(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)進(jìn)行純化，以給出(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟苯基)哌啶-2-酮(880mg，3.15mmol，73％收率)。中間體：(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-酮將(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟苯基)哌啶-2-酮(880mg，3.15mmol)懸浮于三氟乙酸(2.55ml)中。將混合物冷卻至0℃并添加濃h2so4(2.46ml，24.3mmol)。接著，逐滴加入hno3(661.61ml，6.30mmol)。在25℃下攪拌2小時之后，將反應(yīng)混合物傾倒在100g冰上并使用5mnaoh(水溶液)堿化至ph>11。將懸浮液用乙酸乙酯(150ml)萃取。將各相分離并且將水層用乙酸乙酯萃取(2x70ml)。將合并的有機(jī)相用飽和nh4cl水溶液(30ml)和水(30ml)的溶液洗滌，用mgso4干燥，過濾，并在減壓下濃縮，以提供(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-酮(1.00g，粗品)。中間體：(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-硫酮向在甲苯(5ml)中的(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-酮(1.00g，3.08mmol)的溶液中添加勞氏試劑(2,4-雙(4-甲氧基苯基)-1,3,2,4-二噻-二磷雜環(huán)丁烷-2,4-二硫化物)(686mg，1.70mmol)。將混合物在100℃攪拌2小時。tlc分析顯示沒有原料剩余。將混合物濃縮，并將粗產(chǎn)物通過硅膠快速色譜(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)進(jìn)行純化，以給出(s)-6-(二氟-甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-硫酮(1.00g，2.94mmol，95.4％收率)。中間體：(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮向在乙醇(15ml)和水(4ml)中的(s)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟-6-(2-氟-5-硝基苯基)哌啶-2-硫酮(1.00g，2.94mmol)的懸浮液中添加鐵粉(821mg，145mmol)和nh4cl(786mg，14.7mmol，5.0當(dāng)量)。將黑色混合物在60℃攪拌18小時。在將反應(yīng)混合物冷卻至25℃之后，過濾粗產(chǎn)物并用乙醇(100ml)洗滌殘余物。將合并的濾液濃縮并將所得固體分散于乙酸乙酯(100ml)中。將混合物過濾并將濾液用水(30ml)、鹽水(20ml)洗滌并濃縮。將粗產(chǎn)物通過硅膠快速色譜(石油醚：乙酸乙酯＝3:1-2:1)進(jìn)行純化，以給出(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮(819mg，2.51mmol，85.3％收率)。1hnmr(dmso-d6,400mhz):δ10.97(s,1h),7.03-6.90(m,2h),6.64-6.55(m,2h),5.19(s,2h),3.19-3.15(m,1h),3.03-2.94(m,1h),2.35-2.24(m,2h)。中間體：甲基-d3-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-羧酸酯將鈉(0.094g，4.10mmol)分小部分地添加至甲醇-d4(2.94ml)，并將反應(yīng)混合物進(jìn)行攪拌直到所有鈉已經(jīng)反應(yīng)。將該溶液添加至在甲醇-d4(0.98ml)中的甲基-5-氯吡嗪-2-羧酸酯(0.6g，3.48mmol)的另一溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1.5小時。將反應(yīng)混合物在真空中濃縮。添加2ml的水。將混合物用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并在真空中濃縮，以給出甲基-d3-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-羧酸酯。中間體：5-(甲氧基-d3)吡啶甲酸甲酯在氬下，將5-羥基吡啶甲酸甲酯(2.88g，18.81mmol)溶解于二甲基甲酰胺(108ml)中。添加碳酸鉀(7.20g，52.1mmol)并將橙色懸浮液在室溫下攪拌45分鐘。添加碘代甲烷-d3(1.41ml，22.6mmol)。將該反應(yīng)混合物攪拌2小時。添加水。將混合物用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，并在真空中濃縮，并通過硅膠柱色譜(庚烷：乙酸乙酯)進(jìn)行純化，以給出5-(甲氧基-d3)吡啶甲酸甲酯。本發(fā)明化合物的制備實例1(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺(化合物1)將5-氯吡啶甲酸(19mg，0.12mmol)和hatu(1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯)(67.4mg，0.177mmol)溶解于dmf(1ml)中。將反應(yīng)混合物攪拌5分鐘。然后添加(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮(25mg，0.081mmol)和dipea(n,n-二異丙基乙胺)(52mg，0.07ml，0.4mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時。添加飽和nh4cl水溶液，并且將混合物用乙酸乙酯萃取。將合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。添加在甲醇(7m，2ml)中的氨并且在密封小瓶中，將反應(yīng)混合物在55℃下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物在減壓下進(jìn)行濃縮。通過快速色譜在硅膠上純化粗產(chǎn)物(庚烷：乙酸乙酯)。將產(chǎn)物溶解于乙酸乙酯中并且用飽和nahco3水溶液/水洗滌5次以除去硫脲副產(chǎn)物。將合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，經(jīng)mgso4干燥，過濾，并且在減壓下濃縮，以給出(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氯吡啶酰胺。1hnmr(dmso-d6,600mhz):δ10.78(s,1h),8.79(dt,j＝2.4,1.1hz,1h),8.20(dd,j＝8.4,2.4hz,1h),8.16(dd,j＝8.4,0.7hz,1h),7.96-7.90(m,1h),7.88(dd,j＝6.8,2.7hz,1h),7.20(dd,j＝11.6,8.8hz,1h),6.74(t,j＝55.2hz,1h),6.38(s,2h),2.51(dt,j＝3.7,1.8hz,2h),2.19-1.98(m,2h)。lc-ms(m/z)433(mh+)；tr＝0.53分鐘(方法a)實例2(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氟吡啶酰胺(化合物2)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-氟吡啶甲酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.72(s,1h),8.74(d,j＝2.8hz,1h),8.24(dd,j＝8.7,4.6hz,1h),7.99(td,j＝8.7,2.8hz,1h),7.95-7.91(m,1h),7.88(dd,j＝6.8,2.7hz,1h),7.20(dd,j＝11.6,8.8hz,1h),6.74(t,j＝55.2hz,1h),6.38(s,2h),2.56-2.50(m,2h),2.22-1.98(m,2h)。lc-ms(m/z)417.1(mh+)；tr＝0.49分鐘(方法a)實例3(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡嗪-2-甲酰胺(化合物3)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-甲氧基吡嗪-2-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.61(s,1h),8.89(d,j＝1.3hz,1h),8.42(d,j＝1.3hz,1h),7.90(m,2h),7.20(dd,j＝11.6,8.9hz,1h),6.86-6.62(m,1h),6.37(s,2h),4.02(s,3h),2.56-2.50(m,2h),2.19-1.96(m,2h)。lc-ms(m/z)430.1(mh+)；tr＝0.48分鐘(方法a)實例4(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-2-甲基噁唑-4-甲酰胺(化合物4)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和2-甲基噁唑-4-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.25(s,1h),8.64(s,1h),7.82(m,2h),7.16(dd,j＝11.6,8.7hz,1h),6.73(t,j＝55.2hz,1h),6.36(s,2h),3.01(s,1h),2.59-2.41(m,5h),2.19-1.96(m,2h)。lc-ms(m/z)403(mh+)；tr＝0.42分鐘(方法a)實例5(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基吡啶酰胺(化合物5)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-甲氧基吡啶甲酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.55(s,1h),8.40(d,j＝2.9hz,1h),8.13(d,j＝8.7hz,1h),7.94-7.90(m,1h),7.84(dd,j＝6.7,2.7hz,1h),7.62(dd,j＝8.7,2.9hz,1h),7.18(dd,j＝11.6,8.8hz,1h),6.85-6.61(m,1h),6.36(s,2h),3.93(s,3h),2.55-2.47(m,2h),2.17-2.00(m,2h)。lc-ms(m/z)429.1(mh+)；tr＝0.5分鐘(方法a)實例6(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(二氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(化合物6)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-二氟甲基)吡嗪-2-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ11.02(s,1h),9.40(d,j＝1.3hz,1h),9.10(s,1h),7.96-7.91(m,2h),7.38-7.17(m,2h),6.75(t,j＝55.1hz,1h),6.38(s,2h),2.56-2.50(m,2h),2.20-1.98(m,2h)。lc-ms(m/z)450.1(mh+)；tr＝0.48分鐘(方法a)實例7(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基吡啶酰胺(化合物7)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-氰基吡啶甲酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.94(s,1h),9.21(d,j＝1.3hz,1h),8.59(dd,j＝8.2,1.9hz,1h),8.29(d,j＝8.1hz,1h),7.96-7.88(m,2h),7.22(dd,j＝11.5,8.8hz,1h),6.74(t,j＝55.0hz,1h),6.37(s,2h),2.57-2.48(m,2h),2.07(m,2h)。lc-ms(m/z)424.5(mh+)；tr＝0.45分鐘(方法b)實例8(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-4-甲基噻唑-2-甲酰胺(化合物8)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和4-甲基噻唑-2-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.84(s,1h),7.90(dd,j＝6.7,2.5hz,1h),7.88-7.83(m,1h),7.70(s,1h),7.19(dd,j＝11.5,8.9hz,1h),6.74(t,j＝55.1hz,1h),6.38(s,2h),2.59-2.46(m,5h),2.18-1.95(m,2h)。lc-ms(m/z)419.4(mh+)；tr＝0.47分鐘(方法b)實例9(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基嘧啶-2-甲酰胺(化合物9)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-甲氧基嘧啶-2-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.73(s,1h),8.73(s,2h),7.95-7.91(m,1h),7.82(dd,j＝6.7,2.5hz,1h),7.22-7.18(m,1h),6.74(t,j＝55.2hz,1h),6.37(s,2h),4.03(s,3h),2.58-2.50(m,2h),2.18-1.99(m,2h)。lc-ms(m/z)430.5(mh+)；tr＝0.39分鐘(方法b)實例10(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-甲氧基-3-甲基吡嗪-2-甲酰胺(化合物10)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-甲氧基-3-甲基吡嗪-2-羧酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.52(s,1h),8.24(d,j＝0.6hz,1h),7.91(ddd,j＝8.8,4.1,2.8hz,1h),7.74(dd,j＝6.8,2.7hz,1h),7.18(dd,j＝11.7,8.8hz,1h),6.85-6.62(m,1h),6.38(s,2h),3.99(s,3h),2.76(d,j＝0.5hz,3h),2.55-2.49(m,2h),2.18-1.99(m,2h)。lc-ms(m/z)444.5(mh+)；tr＝0.52分鐘(方法b)實例11(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-氰基-3-甲基吡啶酰胺(化合物11)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-氰基-3-甲基吡啶甲酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.80(s,j＝27.6hz,1h),8.99(d,j＝1.2hz,1h),8.40(s,1h),7.99-7.87(m,1h),7.82-7.69(m,1h),7.36-7.13(m,1h),6.73(t,j＝55.0hz,1h),6.36(s,2h),2.56-2.47(m,2h),2.21-1.97(m,2h)。lc-ms(m/z)438.1(mh+)；tr＝0.49分鐘(方法b)實例12(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-溴吡啶酰胺(化合物12)如實例1中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-溴吡啶甲酸進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.78(s,1h),8.87(dd,j＝2.3,0.7hz,1h),8.33(dd,j＝8.4,2.3hz,1h),8.09(dd,j＝8.4,0.6hz,1h),7.94(ddd,j＝8.8,4.1,2.8hz,1h),7.89(dd,j＝6.8,2.7hz,1h),7.21(dd,j＝11.6,8.8hz,1h),6.88-6.62(m,1h),6.39(s,2h),2.60-2.49(m,2h),2.19-1.96(m,2h)。lc-ms(m/z)479.1(mh+)；tr＝0.53分鐘(方法b)實例13(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡啶酰胺(化合物13)在氬氣氣氛下，將(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮(25mg，0.081mmol)溶解于二氯甲烷(1ml)中。緩慢添加三甲基鋁(52μl，0.105mmol，2摩爾，甲苯)，然后添加在0.5ml二氯甲烷中的甲基-(甲氧基-d3)吡啶甲酸酯(18mg，0.11mmol)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時。將反應(yīng)混合物傾倒入冷卻的4nhcl(水溶液)中。將混合物用乙酸乙酯萃取。將有機(jī)相用鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥并在真空中濃縮。添加在甲醇(4ml)中的7m氨并且在密封小瓶中，將反應(yīng)混合物在50℃下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物在真空中濃縮，并通過硅膠快速色譜(庚烷/乙酸乙酯)純化，隨后通過制備型hplc純化，以得到呈三氟乙酸鹽的標(biāo)題化合物。1hnmr(600mhz,dmso)δ11.13(s,1h),10.75(s,1h),9.98(s,1h),9.10(s,1h),8.40(dd,j＝2.9,0.5hz,1h),8.21(ddd,j＝8.9,4.1,2.6hz,1h),8.15(dd,j＝8.7,0.5hz,1h),8.09(dd,j＝6.8,2.6hz,1h),7.64(dd,j＝8.7,2.9hz,1h),7.40(dd,j＝11.9,9.0hz,1h),7.20(t,j＝53.0hz,1h),3.17-3.01(m,2h),2.48-2.38(m,2h)。lc-ms(m/z)432(mh+)；tr＝0.49分鐘(方法a)實例14(s)-n-(3-(6-氨基-2-(二氟甲基)-3,3-二氟-2,3,4,5-四氫吡啶-2-基)-4-氟苯基)-5-(甲氧基-d3)吡嗪-2-甲酰胺(化合物14)如實例13中所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-(甲氧基-d3)吡啶甲酸甲酯進(jìn)行制備。1hnmr(600mhz,dmso)δ10.61(s,1h),8.89(d,j＝1.2hz,1h),8.42(d,j＝1.2hz,1h),7.91-7.86(m,2h),7.19(dd,j＝11.5,8.9hz,1h),6.84-6.61(m,1h),6.36(s,2h),2.53-2.49(m,2h),2.16-1.96(m,2h)。lc-ms(m/z)433.1(mh+)；tr＝0.49分鐘(方法a)立體化學(xué)通過從庚烷和乙酸乙酯的混合物中重結(jié)晶(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺獲得晶體。通過所述晶體的x射線結(jié)晶學(xué)闡明(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)顯示(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺的絕對和相對構(gòu)型。如實例1所述自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮和5-溴吡啶甲酸制備(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺。圖1：(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺的x射線結(jié)構(gòu)可以由此合理化本發(fā)明的例示化合物的絕對構(gòu)型。自(s)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(二氟甲基)-5,5-二氟哌啶-2-硫酮(本發(fā)明所有示例性化合物的原料)制備(s)-5-溴-n-(3-(2-(二氟甲基)-3,3-二氟-6-硫代哌啶-2-基)-4-氟苯基)吡啶酰胺。藥理學(xué)測試bace1結(jié)合測定基于spa的測定，使用從自由式hek293細(xì)胞(freestylehek293cell)重組表達(dá)并且隨后純化的、生物素化形式的人類bace1進(jìn)行結(jié)合測定。在白色清底384板(corning(康寧公司)#3653)中于50mm乙酸鈉緩沖液(ph4.5)中運(yùn)行結(jié)合測定，該緩沖液包含50mmnacl和0.03％tween-20。將10nm(終濃度)放射性配體([3h]-n-((1s,2r)-1-芐基-3-環(huán)丙基氨基-2-羥基-丙基)-5-(甲烷磺?；?甲基-氨基)-n-((r)-1-苯基-乙基)-異酞酰胺)(購自ge醫(yī)療基團(tuán)(gehealthcare)的trq11569)與給定濃度的測試化合物、6nm(終濃度)人類bace1和25μg鏈霉親和素涂布的pvt核spa珠粒(rpnq0007，ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(gehealthcarelifesciences))混合，總體積為40μl。在測定中測試每種測試化合物的若干濃度，用于確定ic50。將板在室溫下孵育一小時并且在wallactrilux計數(shù)器中計數(shù)。分別使用緩沖液和1μm(終濃度)的高親和力bace1參比抑制劑(s)-6-[3-氯-5-(5-丙-1-炔基-吡啶-3-基)-噻吩-2-基]-2-亞氨基-3,6-二甲基-四氫-嘧啶-4-酮確定總的和非特異性的結(jié)合。對于每種測試化合物，ic50值(介導(dǎo)放射性配體的特異性結(jié)合的50％抑制的濃度)確定自濃度-反應(yīng)曲線并用于從等式ki＝ic50/(1+l/kd)計算ki，其中l(wèi)和kd分別是用于測定的放射性配體的終濃度和放射性配體的解離常數(shù)。放射性配體的kd確定自飽和結(jié)合實驗。表1：所選化合物的結(jié)合親和力化合物編號bace1ki(nm)11822338.542056.762077.487196.91016117.8126.113141418bace1有效性測定基于fret的測定，使用可商購bace1試劑盒(lifetechnologies(美國生命技術(shù)公司)，p2985)進(jìn)行有效性測定。將2μl的10μm(終濃度)測試化合物和來自試劑盒的15μlbace1酶(終濃度3nm)在室溫下預(yù)孵育15分鐘，之后添加來自該試劑盒的15μl底物(250nm終濃度)，并且在室溫下再孵育90分鐘。隨后在pherastar(ex540/em590)中對測定板進(jìn)行讀數(shù)。將存在測試化合物情況下觀察到的酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為分別存在緩沖液和10μm(終濃度)的高親和力bace1參比抑制劑(s)-6-[3-氯-5-(5-丙-1-炔基-吡啶-3-基)-噻吩-2-基]-2-亞氨基-3,6-二甲基-四-氫嘧啶-4-酮情況下觀察到的酶活性。在10μm(終濃度)下評估測試化合物的有效性并且使用等式％抑制＝100％-以百分比計的標(biāo)準(zhǔn)化酶活性，將有效性定義為酶活性的百分比抑制。表2：所選化合物的bace1活性bace1抑制后，評價大鼠腦和血漿中的aβ水平。動物。根據(jù)丹麥議會，所有大鼠護(hù)理和實驗程序都被靈北(lundbeck)獸醫(yī)人員批準(zhǔn)。將大鼠以12/12-h光暗循環(huán)養(yǎng)護(hù)在障礙設(shè)施中并且任意給予食物和水。首試大鼠的處理。大約250g重的年輕成年雄性斯普拉-道來(spraguedawley)大鼠購自charlesriver(查爾斯河公司)并且僅通過口服強(qiáng)飼(p.o)接受0-30mg/kg的運(yùn)載體(10％hpβcd+1mmeso4，ph2.5)或測試化合物(溶解于運(yùn)載體中)。以5ml/kg的體積給予化合物。對于每種處理條件，建立5-10只動物的同類組。由獸醫(yī)人員密切監(jiān)測經(jīng)歷處理的動物的任何中毒癥狀。監(jiān)測參數(shù)包括體重、體態(tài)、皮毛(coat)外觀的變化、無端行為的出現(xiàn)以及對外界刺激的反應(yīng)遲鈍或夸大。組織收集。在初次給藥后t＝180分鐘時，將動物打昏并用鍘除刀斷頭。在將動物斷頭后，將主干血加樣于edta包衣的試管中。將血液在4℃下以2200g離心15分鐘并收集血漿并且將其冷凍在-80℃下。將血液等分用于aβelisa和dmpk分析。處死后立即提取腦并將其分為兩等份。將右半腦在干冰上快速冷凍并儲存在-80℃下。將左半部分解剖；其中額前腦(frontforebrain)用于進(jìn)行aβelisa并且剩余部分用于進(jìn)行dmpk分析。也將這些樣品在干冰上快速冷凍并儲存在-80℃下，直到分析使用。組織加工。在將皮層樣品用速度設(shè)定為5的小容量分散儀(t10基礎(chǔ)(basic))均質(zhì)化5-7sec之前，將其在濕冰上稍微解凍。將組織在其重量的10倍體積的緩沖液中加工，例如將100mg的組織在1000μl的均質(zhì)化緩沖液中均質(zhì)化。均質(zhì)化緩沖液：50mlmilliq水+50nmnacl+0.2％二乙胺(dea)+1片完全蛋白酶(completeprotease)抑制劑混合物+1nm4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟鹽酸化物不可逆絲氨酸蛋白酶抑制劑(aebsf)。均質(zhì)化后，將樣品的450μl等分部分收集在1.5ml埃彭道夫管(eppendorftube)中并放置在濕冰上，將0.5％np-40(50ul)添加至所有樣品中并且然后將其在冰上孵育30min。這之后使用具有20khz勻聲的超聲勻漿器(sonoplushd2070，班德林電子(bandelinelectronic))(10脈沖設(shè)定在12％-13％功率)超聲處理所有樣品以提取所有aβ種類。然后，將樣品在4℃下以20000g離心(oledich157mprf微量離心機(jī))20分鐘。離心后，將285μl的上清液用移液管吸取進(jìn)600μl微管中并用15μl的1mtris-hcl緩沖液中和。elisa方案。使用wako294-62501人類/大鼠aβ淀粉樣蛋白(40)試劑盒進(jìn)行所有elisa分析。將如以上所描述產(chǎn)生的30μl血漿樣品或30μl的皮層上清液置于在濕冰上的600μl微管中。向其中添加30μl的8m脲(艾普力(applichem)a1049，9025)，以產(chǎn)生2倍稀釋。將血漿和皮層上清液兩者都在冰上孵育30min。標(biāo)準(zhǔn)品列制備自提供于試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)肽儲備物以及包含1.6m脲(200μl8m脲+800μl的標(biāo)準(zhǔn)稀釋物)和0.8m脲(400μl8m脲+3600μl標(biāo)準(zhǔn)稀釋物)的標(biāo)準(zhǔn)稀釋物。制備從100pmol/ml至0pmol/l的aβ40的連續(xù)2倍稀釋用于進(jìn)行測定。在用脲孵育之后，通過添加5倍的來自試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)稀釋物進(jìn)一步稀釋所有樣品。這通過將240μl標(biāo)準(zhǔn)稀釋物添加至60μl樣品/脲混合物中然后將其充分混合來進(jìn)行。將100μl的每種稀釋樣品一式兩份地用移液管吸取進(jìn)elisa板的指定孔中。然后將板覆蓋并在4℃下孵育過夜。第二天，在使用之前將elisa試劑盒回到室溫。將孵育板用稀釋于milliq水中的20x洗滌溶液洗滌5次。將100μlhrp-偶聯(lián)物施加至每個孔中，并且將板覆蓋且在4℃下孵育1hr。再次重復(fù)洗滌5次。將100μl3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)溶液施加至每個孔中并且將板覆蓋并在室溫下于黑暗中孵育30分鐘。接下來，將100μl終止溶液施加至每個孔中，并且在將終止溶液添加至孔中的30min內(nèi)，將板在分光光度計(實驗室系統(tǒng)酶標(biāo)儀(labsystemsmultiscanascent))中于450nm波長下進(jìn)行讀數(shù)。基于生成自包含已知濃度的合成aβ40的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定樣品中的aβ濃度。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將意識到，二乙胺(dea)和脲萃取將分別釋放可溶性aβ和不可溶性aβ。由于elisa試劑盒是經(jīng)過驗證的且廣泛使用，所以可接受的是只要對于每種測試化合物而言處理條件和測定條件相同，則測定應(yīng)該針對測試的化合物產(chǎn)生一致的穩(wěn)健數(shù)據(jù)并產(chǎn)生最小差異。數(shù)據(jù)分析為了確定樣品中的aβ40濃度，將裝載在板上的樣品的內(nèi)插值乘以20，以將當(dāng)dea、脲和中和溶液的體積累加時產(chǎn)生的稀釋考慮在內(nèi)。將值計算為與運(yùn)載體處理的動物相比的aβ40的百分比變化。腦和血漿樣品的生物分析使用ultraperformance色譜，隨后通過串聯(lián)-ms(ms/ms)檢測確定血漿和腦組織勻漿中的tc。裝置：tecangenesisrsp200；biomeknxp，beckmancoulter(貝克曼庫爾特公司)；sigma4k15離心機(jī)；acquityuplc，waters(沃特斯公司)；sciexapi4000tq，appliedbiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；ms軟件：分析者版本1.4.1化學(xué)品乙腈，hplc級，fluka，no.34967n；甲醇，hplc級，sigma-aldrich(西格瑪-奧德里奇公司)，批次9003s；甲酸，hplc級，riedel-de批次51660；凈化水，milliporesynergyuv樣品制備通過將腦1:4(v/v)與水:2-丙醇:dmso(50:30:20v/v/v)攪勻，隨后通過離心和收集上清液制備腦組織勻漿。使用hamilton機(jī)器制備校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)品和qc樣品。使用biomek機(jī)器將在乙腈(1ng/mlistd)中的150μlistd添加至25μl的校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)品、qc樣品和檢測樣品(血漿和腦組織勻漿)中。離心(6200g，4℃，20min)之后，將來自每個樣品的100μl上清液轉(zhuǎn)移至一個新板并使用biomek機(jī)器將其與100μl水和0.1％甲酸混合。在快速離心(6200g，4℃，5min)之后，將這些樣品置于自動取樣器中。uplc-ms/ms分析用在正離子電噴射離子化模式中的appliedbiosystemssciexapi4000儀器完成ms/ms檢測。以親代>子代質(zhì)荷比(m/z)檢測tc和istd。使用氮作為霧化器氣體和碰撞氣體。與血漿和腦分析物濃度線性相關(guān)的峰面積在1.00-1000ng/ml血漿以及5.00-5000ng/g腦的范圍內(nèi)(針對稀釋校正的)。如果血漿/腦樣品藥物濃度高于1000ng/ml或5000ng/g，該樣品在分析之前在空白血漿/空白腦組織勻漿中適當(dāng)稀釋。色譜系統(tǒng)分析柱：沃特斯acquityuplchssc18sb(ph2-8)1.8μm，2.1x30mm。流動相a：0.1％水性甲酸或0.1％水性氫氧化銨流動相b：含0.1％水性甲酸或0.1％水性氫氧化銨的乙腈。弱洗劑：甲醇強(qiáng)洗劑：乙腈/異丙醇/甲酸(50/50/2v/v/v)流量：0.6ml/min運(yùn)行時間：3min。至廢料：0-0.5min溫度：40℃梯度：將化合物3和5以10mg/kg的劑量口服強(qiáng)飼給予并且在給藥后3小時收集腦和血漿樣品并且如以上所描述測量以下暴露。表3：化合物3的結(jié)果表4：化合物5的結(jié)果如表3和4所示，本發(fā)明的化合物能夠穿透血腦屏障并且顯示在cns中的有效性。mdck-mdr1測定在mdck-mdr1細(xì)胞中評估測試化合物的透性，將這些細(xì)胞在96transwell板中培養(yǎng)至融合(4-6天)。用轉(zhuǎn)運(yùn)緩沖液(hbss+1％bsa)將測試化合物稀釋至0.5μm的濃度并應(yīng)用于細(xì)胞單分子層的頂側(cè)或基底外側(cè)。在37℃和5％co2下，在95％的相對濕度，經(jīng)60分鐘的孵育時間，對從a到b方向或b到a方向的測試化合物的滲透一式三份進(jìn)行確定?；趖ranswell板的受體和供體孔中分析物/is的峰面積比，通過lc-ms/ms分析來量化測試化合物。使用以下等式計算表觀透性系數(shù)papp(cm/s)：papp＝(dcr/dt)xvr/(axc0)其中dcr/dt是受體室中化合物的累積濃度作為時間的函數(shù)(μm/s)；vr是受體室中的溶液體積(頂側(cè)上0.05ml；基底外側(cè)上0.25ml)；a是運(yùn)輸?shù)谋砻婷娣e，即單分子層的面積為0.0804cm2；c0是供體室中的初始濃度(μm)。當(dāng)流出比(pappba/pappab)≥2時，將化合物歸類為pgp底物。表5：所選化合物的bace1活性如表5中所示，本發(fā)明大部分示例性化合物具有低于2的mdck-mdr1流出比并且因此可能穿透血腦屏障(ekerns(e克恩斯)，ldi(l迪)，drug-likeproperties:concepts,structuredesignandmethods(類藥屬性：概念，結(jié)構(gòu)化設(shè)計和方法)(2008)elsevier(愛思唯爾))。當(dāng)前第1頁12