本發(fā)明涉及包含殼聚糖的新型組合物及其制備工藝，該組合物在熱滅菌后形成ph接近中性ph的透明、粘稠和穩(wěn)定的溶液。

背景技術(shù)：

殼多糖被稱為幾丁質(zhì)衍生物，其通過也稱為聚(n-乙?；?d-葡糖胺)的幾丁質(zhì)(其是天然存在的生物聚合物)的部分至大量堿性n-脫乙?；@得。

殼聚糖含有游離的氨(-nh2)基和乙?；?，并且可以表征為n-乙?；?d-葡糖胺單元和d-葡糖胺單元的比例，并且該比例表示為完全乙?；木酆衔飵锥≠|(zhì)的脫乙酰度(dd)。

影響重要性質(zhì)(諸如溶解度和粘度)的殼聚糖的參數(shù)是脫乙酰度(dd)(其可被理解為表示脫乙?；瘑误w的百分比)和平均分子量(mw)。

已知殼聚糖具有生物可降解性、生物相容性、生物粘附性、抑菌性，并且能夠促進傷口愈合、藥物吸收和組織重建。

由于其上述固有性質(zhì)，殼聚糖已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多化妝品和藥物應用，例如眼科應用、再生醫(yī)學或傷口愈合。

因此，考慮到殼聚糖的有利性質(zhì)及其眾多應用，已經(jīng)多次嘗試生產(chǎn)包含殼聚糖的無菌和穩(wěn)定的組合物。

wo97/007139公開了一種對含有水不溶性殼聚糖的多糖組合物進行滅菌而基本上不降解多糖的工藝。在這個工藝中，首先將水不溶性殼聚糖分散在水中，然后在高壓蒸汽下滅菌，以形成ph值等于或高于約7的殼聚糖懸浮液。所述懸浮液的懸浮殼聚糖顆粒最終溶于無菌酸中以降低最終ph并形成滅菌的殼聚糖溶液。

jarryetal.2002，chem.pharm.bull.，50(10)：1335-1340公開了一種組合物，其含有溶解在hcl和甘油中的殼多糖游離堿，高壓滅菌后的最終ph為約5.25。向該溶液中加入甘油磷酸鹽將ph增加至約7.14，并產(chǎn)生混濁溶液(存在沉淀物)。

盡管開發(fā)了包含殼聚糖的無菌組合物，但是不斷需要進一步改進已知的殼聚糖組合物的性質(zhì)，特別是提供ph接近中性ph的含有殼聚糖的水性制劑，其在熱滅菌之后是穩(wěn)定、透明和粘稠的，并且適用于藥物用途。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種制備包含殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物的工藝以及可通過所述工藝獲得的組合物，其在熱滅菌后在接近中性ph的ph下形成透明和粘稠的溶液。特別地，本發(fā)明涉及意想不到的發(fā)現(xiàn)：根據(jù)本發(fā)明的工藝在熱滅菌之前溶解水不溶性殼聚糖(胺殼聚糖)避免了聚集體的形成并且允許制備適用于眼用的透明溶液。根據(jù)本發(fā)明的特定方面，避免在熱滅菌之前在含有水不溶性的殼聚糖(胺殼聚糖)的溶液中形成聚集體是有利的，因為已經(jīng)形成的聚集體的熱滅菌使得那些聚集體的去除難以實現(xiàn)、耗時且成本高。本發(fā)明的第一方面涉及一種制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌水性組合物的工藝，其中所述組合物是透明和粘稠的溶液，ph在6至7.5之間，特別是6和7之間，其中所述工藝包括以下步驟：

(i)在包含羧基的弱酸的水溶液中溶解平均分子量為從10kda至250kda且脫乙酰度高于60％的殼聚糖；

(ii)加入甘油；

(iii)通過加入弱堿的水溶液將ph調(diào)節(jié)至在6至7.5之間的ph值；和

(iv)蒸汽滅菌；

從而形成包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物，其在6和7.5之間的ph下是透明和粘稠的溶液。

本發(fā)明的第二方面涉及一種包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物，其通過本文所述的制備工藝獲得，特別涉及包含所述熱滅菌的水性組合物和至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

本發(fā)明的第三方面提供了一種包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物，其中所述組合物的ph為6至7.5之間，并且形成透明和粘稠的溶液。

在第四方面，本文所述的組合物用作藥物，特別是作為眼用組合物。

本發(fā)明的第五方面涉及本文所述的組合物，其用于治療干眼綜合征、綜合征、眼睛表面或眼睛的相關(guān)前結(jié)構(gòu)的細菌感染。

本發(fā)明的第六方面提供了本文所述的用于治療關(guān)節(jié)炎疾病的組合物。

本發(fā)明的第七方面涉及本文所述的組合物在制造藥物中的用途，該藥物用于治療干眼綜合征、綜合征、眼睛表面或眼睛的相關(guān)前結(jié)構(gòu)的細菌感染。

本發(fā)明的第八方面提供了本文所述的組合物在制備用于治療關(guān)節(jié)炎疾病的藥物中的用途。

本發(fā)明的第九方面還涉及一種用于預防和/或治療干眼綜合征、綜合征、由對殼聚糖敏感的細菌引起的眼睛表面或相關(guān)的前結(jié)構(gòu)的細菌感染、和/或關(guān)節(jié)炎疾病的方法，其包括在有需要的受試者中給藥治療有效量的如本文所述的組合物。

從下面的詳細描述中，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。

附圖說明

圖1：在熱滅菌之前(1)和熱滅菌之后(2)根據(jù)實例2的包含0.5％殼聚糖和甘油的組合物的流變曲線。

圖2：在熱滅菌之前(1)和熱滅菌之后(2)根據(jù)實例6的包含1％殼聚糖和甘油的組合物的流變曲線。

圖3：如實例8所述的基于粒徑(a)和濁度測量(b)的本發(fā)明的組合物的粘膜粘附性質(zhì)，比較了在粘蛋白存在下的根據(jù)實例2的包含0.5％殼聚糖和甘油的本發(fā)明的制劑(3)與在粘蛋白(2)和粘蛋白溶液(1)存在下的透明質(zhì)酸溶液。

圖4：在熱滅菌之前(1)和熱滅菌之后(2)根據(jù)實例7的包含2％殼聚糖和甘油的組合物的流變曲線。

圖5：在熱滅菌之前(1)和熱滅菌之后(2)根據(jù)實例10的包含2％殼聚糖和甘油的組合物的流變曲線。

具體實施方式

殼聚糖是由隨機分布的β-(1-4)連接的d-葡糖胺(脫乙?；瘑卧?和n-乙?；?d-葡糖胺(乙?；瘑卧?組成的線性多糖。它可以通過幾丁質(zhì)(也稱為聚(n-乙?；?d-葡糖胺))的部分至大量脫乙?；@得，幾丁質(zhì)是在貝類和真菌中發(fā)現(xiàn)的天然存在的生物聚合物，通常通過用堿性氫氧化鈉處理蝦和其它甲殼類殼或真菌細胞壁?；蛘?，殼聚糖可以從真菌(諸如毛霉屬、茜草屬和根霉屬)細胞壁中存在的天然存在的殼聚糖中提取出來。根據(jù)具體方面，本發(fā)明的殼聚糖是真菌來源的。

適用于殼聚糖樣品的術(shù)語“脫乙酰度”(“dd”)是指存在于殼聚糖樣品的大分子鏈中的d-葡糖胺單位相對于n-乙?；?d-葡糖胺單位和d-葡糖胺單位的總平均量的相對平均量。

幾種方法可用于測定殼聚糖的脫乙酰度(dd)。這些方法包括茚三酮測試(curotto和aros，1993，analyticalbiochemistry，211(2)：240-241)、紅外光譜(ir)(brugnerotto等人，2001，polymer，42(8)：3569-3580)、線性電位滴定(lpt)(balázs和sipos，2007，carbohydrateresearch，342(1)：124-130)、圓二色光譜(domard1987，internationaljournalofbiologicalmacromolecules，9(6)：333-336)、溴化氫滴定法(baxter等人，1992，internationaljournalofbiologicalmacromolecules，14(3)：166-169)、gpc(aiba，1986，internationaljournalofbiologicalmacromolecules，8(3)：173-176)、紫外(uv)光譜學(tan等，1998，talanta，45(4)：713-719)、核磁共振光譜(nmr)(zhang等人，2005，carbohydrateresearch，340(11)：1914-1917)、酶學測定(nanjo等人，1991，analyticalbiochemistry，193(2)：164-167)和元素分析(gupta和jabrail，2006，carbohydratepolymers，66(1)：43-54)。

術(shù)語“乙?；取?“da”)是指存在于殼聚糖樣品的大分子鏈中的n-乙?；?d-葡糖胺單位相對于n-乙?；?d-葡糖胺單位和d-葡糖胺單位的總平均量的相對平均量。

術(shù)語“弱”酸是本領域技術(shù)人員公知的，并且表示僅在溶液中部分離子化的酸。根據(jù)本發(fā)明的弱酸包括乳酸、葡萄糖酸和琥珀酸、山梨酸和檸檬酸。根據(jù)本發(fā)明的弱酸還包括乳汁酸(galacticacid)。

術(shù)語“弱”堿是本領域技術(shù)人員公知的，并且表示僅在溶液中部分離子化的堿。根據(jù)本發(fā)明的弱堿包括琥珀酸鈉、乳酸鈉、山梨酸鉀和葡糖酸鉀。

根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語“蒸汽滅菌”表示根據(jù)“歐洲藥典”指南的滅菌條件，諸如根據(jù)歐洲藥典的高壓滅菌。

“干眼綜合征”也可稱為“干眼癥”或“干燥性角膜結(jié)膜炎”(kcs)或“眼表疾病”。干眼綜合征可能導致眼表破裂，造成各種癥狀和體征，并影響生活質(zhì)量。干眼綜合征患者可能會發(fā)生干燥、砂礫/刮擦感、膜狀感、灼熱或瘙癢、眼睛發(fā)紅(結(jié)膜炎)、視力模糊、異物感和光敏感。干眼綜合征通常是由于淚液生成減少、淚液蒸發(fā)過度以及通常在淚液層中發(fā)現(xiàn)的粘液或脂質(zhì)的產(chǎn)生異?；蛩鼈兊慕M合引起的。

術(shù)語“瞼炎”是指可能是急性(潰瘍性或非潰瘍性)或慢性(瞼板腺功能障礙、脂溢性瞼炎)的眼瞼邊緣的炎癥。癥狀和體征包括發(fā)紅和水腫的眼瞼邊緣的瘙癢和灼傷。急性潰瘍性瞼炎通常由睫毛起源處的眼瞼邊緣的細菌感染(通常為葡萄球菌)引起；睫毛囊和瞼板腺也參與其中。急性潰瘍性瞼炎也可能是由于病毒(例如，單純皰疹、水痘帶狀皰疹)引起的。急性非潰瘍性瞼炎通常由涉及相同區(qū)域的過敏反應引起(例如特應性眼瞼炎和季節(jié)性過敏性瞼結(jié)膜炎，其引起強烈的瘙癢、摩擦和皮疹；或在皮膚結(jié)膜結(jié)膜炎的情況下的接觸敏感性)。慢性瞼炎是未知原因的非感染性炎癥。眼瞼中的瞼板腺通過在水性淚液層的頂部形成脂質(zhì)層來產(chǎn)生減少淚液蒸發(fā)的脂質(zhì)(油脂)。在瞼板腺功能障礙中，脂質(zhì)組成異常，并且腺體管和孔可能被硬蠟塞堵塞。繼發(fā)性細菌定殖往往發(fā)生在眼瞼邊緣上發(fā)育的鱗片上。瞼板腺可能會被阻塞。大多數(shù)患有瞼板腺功能障礙或脂溢性瞼炎的患者增加了淚液蒸發(fā)和繼發(fā)性角膜結(jié)膜炎。

術(shù)語“關(guān)節(jié)炎疾病或病癥”表示一種復雜的肌肉骨骼疾病家族，其由超過100種不同的疾病或病癥組成，其破壞關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉、軟骨和其他結(jié)締組織，妨礙或停止身體運動。它更具體地指出對關(guān)節(jié)、肌肉或其他組織引起炎癥或損傷的那些病癥。該術(shù)語包括骨關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年關(guān)節(jié)炎。

術(shù)語“藥學上可接受的”是指由不是生物學或其他方面不期望的材料組成的載體。

術(shù)語“載體”是指存在于除活性劑以外的藥物制劑中的任何組分，因此包括稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、填充劑、著色劑、潤濕劑或乳化劑、ph緩沖劑、防腐劑等。

本文所用的術(shù)語“治療”涵蓋對哺乳動物，特別是人類的疾病的任何治療，并且包括：(a)防止該疾病在可能易患該疾病但尚未被診斷為有該疾病的受試者中發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或減輕疾病，即導致疾病和/或其癥狀或病癥的消退。

根據(jù)本發(fā)明的治療或方法的術(shù)語“功效”可以基于響應于根據(jù)本發(fā)明的用途或方法的疾病或病癥的變化來測量。例如，根據(jù)本發(fā)明的治療干眼綜合征的功效可以通過其對眼睛干燥、砂礫/刮擦感、膜狀感、灼熱或瘙癢、眼睛發(fā)紅、視力模糊、異物感和光敏感、淚膜破裂時間(tbut)、熒光素染色、淚液滲透壓的測量的影響來測量。

本文所用的術(shù)語“有效量”是指根據(jù)本發(fā)明的組合物或其藥物制劑的量，其在給藥所述組合物的受試者中引起可檢測的疾病癥狀的減輕，這些癥狀可以包括在干眼綜合征的情況下的例如眼睛的干燥、砂礫/刮擦感或膜狀感、灼熱或瘙癢、眼睛發(fā)紅、視力模糊、異物感和光敏感，或在關(guān)節(jié)炎疾病的情況下的關(guān)節(jié)或肌肉的炎癥或損傷的可檢測的減輕。

本文所用的術(shù)語“受試者”是指哺乳動物。例如，本發(fā)明考慮的哺乳動物包括人、靈長類動物、家畜，諸如牛、綿羊、豬、馬、實驗室嚙齒動物等。

根據(jù)本發(fā)明的制備工藝

本發(fā)明的第一方面提供了一種制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物的工藝，其中所述組合物是ph接近中性ph(例如6和7.5之間)的透明和粘稠的溶液，其中所述工藝包括以下步驟：

(i)在包含羧基的弱酸水溶液中溶解具有從10kda至250kda的范圍內(nèi)的平均分子量和高于60％的脫乙酰度的殼聚糖；

(ii)加入甘油；

(iii)通過加入弱堿的水溶液將ph調(diào)節(jié)至接近中性ph，例如在6至7.5之間的ph；和

(iv)蒸汽滅菌；

從而形成包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物，其在所述ph下是透明和粘稠的溶液。

在本發(fā)明的具體實施例中，提供了一種如上所述的用于制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物的工藝，其中在步驟(i)中，所述弱酸的羧基(-cooh)和所述殼聚糖的氨基(-nh2)之間的摩爾比在1:0.9至1:1.1之間，特別地為約1:1或1:1.05。

所述殼聚糖的氨基(-nh2)的濃度取決于殼聚糖的dd。例如，對于dd為65mol(％)的殼聚糖，可以與所述弱酸的羧基反應的氨基(-nh2)為65mol％。剩余的35mol(％)對應于殼聚糖的乙?；?-coch3)。

例如，在根據(jù)本發(fā)明的工藝的具體實施例中，在步驟(i)中，將具有173kda的mw和35％(mol)的乙?；鹊淖罱K濃度為0.5％(w/w)的殼聚糖溶解在乳酸(作為弱酸)的水溶液中，最終濃度為0.175％(w/w)。

不與任何具體理論相聯(lián)系，本發(fā)明的發(fā)明人觀察到所述弱酸的羧基(-cooh)與所述殼聚糖的氨基(-nh2)之間的摩爾比在此范圍內(nèi)改善了殼聚糖在弱酸水溶液中的溶解度，并且提高了本發(fā)明的組合物的穩(wěn)定性。

在根據(jù)本發(fā)明的制備包含殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物的工藝的一個具體實施例中，通過攪拌在室溫下進行溶解殼聚糖。

在根據(jù)本發(fā)明的制備包含殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物的工藝的具體實施例中，步驟(i)的所述弱酸選自乳酸、葡萄糖酸和琥珀酸、山梨酸、檸檬酸，和/或步驟(iii)的所述弱堿選自琥珀酸鈉、乳酸鈉、山梨酸鉀和葡糖酸鉀。

在另一個具體實施例中，提供了一種制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物的工藝，其中所述滅菌的組合物是ph在6和7.5之間的透明和粘稠的溶液，其中所述工藝包括以下步驟：

(i)在乳酸水溶液中溶解平均分子量為從約150至約180kda的范圍內(nèi)且脫乙酰度高于60％(mol)(諸如60％至75％(mol)之間)的殼聚糖，其中所述弱酸的羧基(-cooh)與所述殼聚糖的氨基(-nh2)之間的摩爾比為1:0.9至1:1.1之間，包括約1:1或1:1.05；

(ii)加入甘油；

(iii)通過加入琥珀酸鈉的水溶液將ph調(diào)節(jié)至6至7.5之間的值；和

(iv)在121℃高壓滅菌15分鐘；

從而形成包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物，其是透明和粘稠的溶液。

在本發(fā)明的另一個具體實施例中，提供了如上所述的用于制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物的工藝，其中：

-在步驟(i)中，所述殼聚糖的濃度為0.05-3％(w/w)，特別是0.3-0.75％(w/w)，更特別是約0.5％(w/w)，并且所述弱酸是乳酸，乳酸的濃度為0.12％至0.22％(w/w)之間，特別是0.16％至0.19％(w/w)之間，其中所述弱酸的羧基(-cooh)和所述殼聚糖的氨基(-nh2)之間的摩爾比為約1：1.05，

-在步驟(ii)中，所述甘油的濃度為0.4-1％(w/w)，特別是0.4-0.6％(w/w)或約0.4％(w/w)，諸如0.36％(w/w)、0.37％(w/w)、0.38％(w/w)、0.39％(w/w)、0.40％(w/w)、0.41％(w/w)、0.42％(w/w)、0.43％(w/w)、0.44％(w/w)或0.45％(w/w)，或約0.5％(w/w)，諸如0.46％(w/w)、0.47％(w/w)、0.48％(w/w)、0.49％(w/w)、0.50％(w/w)、0.51％(w/w)、0.52％(w/w)、0.53％(w/w)、054％(w/w)、0.55％(w/w)，在步驟(iii)中，所述弱堿是琥珀酸鈉，其濃度為1.0-1.7％(w/w)，特別地為約1.4％(w/w)。

在本發(fā)明的另一個實施例中提供了一種制備包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物的工藝，其中所述組合物是ph在6和7.5之間的透明和粘稠的溶液，其中所述工藝包括以下步驟：

(i)將平均分子量在150000-180000da之間和脫乙酰度為65％(mol)至70％(mol)之間的濃度為約0.5％(w/w)的殼聚糖溶解在乳酸水溶液中，濃度為0.12-0.22％(w/w)之間或約0.16％、約0.17％、約0.18％或約0.19％(w/w)；

(ii)加入最終濃度為0.4-1％(w/w)的甘油，特別是0.4-0.6％(w/w)或約0.4％(w/w)，諸如0.36％(w/w)、0.37％(w/w)、0.38％(w/w)、0.39％(w/w)、0.40％(w/w)、0.41％(w/w)、0.42％(w/w)、0.43％(w/w)、0.44％(w/w)或0.45％(w/w)，或約0.5％(w/w)，諸如0.46％(w/w)、0.47％(w/w)、0.48％(w/w)、0.49％(w/w)、0.50％(w/w)、0.51％(w/w)、0.52％(w/w)、0.53％(w/w)、0.54％(w/w)、0.55％(w/w)；

(iii)通過加入最終濃度為約1.40％(w/w)的琥珀酸鈉的水溶液將ph調(diào)節(jié)至約6.5；

(iv)在121℃高壓滅菌15分鐘；

從而形成熱滅菌組合物，其為透明和粘稠(例如粘度約18mpas.s)的溶液。

在根據(jù)本發(fā)明的工藝的另一個實施例中，步驟(i)的殼聚糖是殼聚糖的胺形式。

在根據(jù)本發(fā)明的工藝的另一個實施例中，步驟(i)的殼聚糖是殼聚糖堿。

在根據(jù)本發(fā)明的工藝的另一個實施例中，步驟(i)的殼聚糖是動物來源的。

在根據(jù)本發(fā)明的工藝的另一個實施例中，步驟(i)的殼聚糖是真菌來源的，特別是來自雙孢蘑菇。

在根據(jù)本發(fā)明的工藝的另一個實施例中，步驟(i)的殼聚糖是真菌來源的殼聚糖胺，特別是來自雙孢蘑菇的殼聚糖胺。

在另一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的工藝可進一步包括在添加甘油、調(diào)節(jié)ph和高壓滅菌的步驟之前，在弱酸(諸如乳酸)的水溶液中溶解支鏈淀粉(特別是具有從10至3000kda的mw的支鏈淀粉)的步驟，從而形成包含殼聚糖和支鏈淀粉的熱滅菌組合物，其為ph在6-7.5之間(特別是6-7之間)的透明和粘稠的溶液。

在又一另外的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的工藝還包括在加入甘油的步驟之前，在弱酸(諸如乳酸)的水溶液(在步驟(i)中將殼聚糖溶解于其中)中提供溶解的支鏈淀粉的初步步驟，特別是具有從約10至約3000kda的范圍內(nèi)的mw的支鏈淀粉。

在一個具體實施例中，通過本發(fā)明的工藝獲得的包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌組合物是穩(wěn)定的、透明的、無色的和粘稠的溶液。

本發(fā)明的組合物

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種熱滅菌的水性組合物，其包含可通過本文所述的制備工藝獲得的溶解的殼聚糖和甘油。

所述組合物是透明和粘稠的溶液，ph在6和7.5之間，特別地ph在6和7之間。

在有利的實施例中，所述組合物是穩(wěn)定的，這意味著殼聚糖聚合物基本上不被降解，并且溶液在熱滅菌和/或儲存后保持其粘度和外觀。

在一個具體實施例中，所述組合物包含具有從約150至約180kda的范圍內(nèi)的平均分子量(mw)和60％(mol)至75％(mol)之間的脫乙酰度(dd)的殼聚糖。

在另一個實施例中，所述組合物包含真菌來源的殼聚糖，諸如來自雙孢蘑菇。

在另一個實施例中，所述組合物包含以胺形式存在的殼聚糖。

在另一個實施例中，所述組合物包含殼聚糖堿。

在一個具體實施例中，可通過本文所述的制備工藝獲得的包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物表現(xiàn)出以下特征中的至少一個：

-所述組合物的粘度為10-500mpa.s。

-所述組合物的重量摩爾滲透壓濃度為150-350mosm/kg。

-所述組合物表現(xiàn)出非牛頓流變行為，

-所述組合物具有抗微生物活性和/或抗脂肪酶活性。

在另一方面，本發(fā)明提供了一種熱滅菌的水性組合物，其包含溶解的殼聚糖和甘油，其中所述組合物的ph為6至7.5，并且在所述ph下，特別是在熱滅菌后形成透明和粘稠的溶液。

在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物形成透明溶液，這意味著在所述組合物中基本上不存在懸浮的可見顆粒。

在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物在熱滅菌后是穩(wěn)定的，這意味著殼聚糖聚合物在滅菌和/或儲存后基本上不被降解。

在一個特定方面，本發(fā)明提供一種包含溶解的殼聚糖和甘油的熱滅菌的水性組合物，其中所述殼聚糖的平均分子量范圍為約10kda至約250kda，脫乙酰度高于60％，并且其中，所述組合物的ph為6至7.5，特別是6至約7，并且在熱滅菌后在所述ph下形成穩(wěn)定、透明和粘稠的溶液。

在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物是包含熱滅菌的水性組合物以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物，熱滅菌的水性組合物包含如本文所述的溶解的殼聚糖和甘油。

在另一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物還包含支鏈淀粉。

在另一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物還包含分子量范圍為約10至約3000kda的支鏈淀粉。

在另一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物還包含分子量約10kda的支鏈淀粉。

在另一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物還包含濃度范圍為約0.5％至約3％的支鏈淀粉。

在一個特定方面，根據(jù)本發(fā)明的組合物用作藥物，更特別地用作眼用組合物。

在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物是用于局部使用的眼用組合物。

在另一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物是關(guān)節(jié)內(nèi)組合物。

在另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的熱滅菌的水性組合物用于制備藥物制劑(特別是眼用組合物或關(guān)節(jié)內(nèi)組合物)的用途。

因此，另一個具體方面涉及包含溶解的殼聚糖和甘油的水性眼用組合物，其中所述殼聚糖的平均分子量范圍為約10kda至約250kda，脫乙酰度高于60％，其中所述組合物的ph在6和7.5之間，并且即使在熱滅菌之后也在所述ph下形成透明和粘稠的溶液。

在一個具體實施例中，提供了一種包含溶解的殼聚糖和甘油的眼用熱滅菌的水性組合物，其中所述殼聚糖的平均分子量范圍為約150至180kda，脫乙酰度(dd)為60％(mol)和75％(mol)之間。

在所述組合物的特定實施例中，所述殼聚糖以胺形式存在和/或是真菌來源的，例如來自雙孢蘑菇。

在一個具體的實施例中，所述組合物的粘度為10-500mpa·s，重量摩爾滲透壓濃度為150-350mosm/kg(例如約250-300mosm/kg)，并且表現(xiàn)出非牛頓流變行為、抗微生物活性和/或抗脂肪酶活性。

根據(jù)本發(fā)明的特定方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明的工藝或制劑，其中弱酸是乳酸。

根據(jù)本發(fā)明的特定方面，提供了本發(fā)明的工藝或制劑，其中弱堿選自琥珀酸鈉和山梨酸鉀。

在所述組合物的另一個具體實施例中，基于總組合物，所述殼聚糖以約0.05％至約3％(w/w)的濃度存在，所述甘油以0.2％至2％(w/w)的濃度存在。根據(jù)具體實施例，本發(fā)明的組合物是眼用組合物，并且基于總組合物，甘油的濃度范圍為0.2％至1％(w/w)。

在所述組合物的另一個具體實施例中，所述弱酸的羧基(-cooh)與所述殼聚糖的氨基(-nh2)之間的摩爾比為1:0.9至1:1.1之間，特別是約1：1或1：1.05。

在另一個具體實施例中，所述組合物還包含濃度為約0.12％至約0.22％(w/w)之間的乳酸和濃度為1.0％至1.7％(w/w)之間的琥珀酸鈉。

在另一個具體實施例中，所述組合物還包含選自由支鏈淀粉和藻酸鹽組成的組的聚合物。

另一個具體方面涉及用于關(guān)節(jié)內(nèi)注射的水性組合物，其包含溶解的殼聚糖和甘油，其中所述殼聚糖的平均分子量范圍為約10kda至約250kda，脫乙酰度高于60％，并且其中，所述組合物的ph為6至7.5，特別地為6至約7，并且即使在熱滅菌后也在所述ph下形成透明和粘稠的溶液。

在本發(fā)明的不同方面的一個實施例中，用于本發(fā)明的殼聚糖具有約10kda至約250kda范圍內(nèi)的平均分子量(mw)，特別是約20kda至約220kda，更特別地，約50kda至約220kda，更特別為約100kda至約220kda，還更具體地約140kda至約200kda，還更具體地約150kda至約180kda，還更特別為約159kda至約175kda，或約155kda、156kda、157kda、158kda、159kda、160kda、161kda、162kda、163kda、164kda、165kda、166kda、167kda、168kda、169kda、170kda、171kda、172kda、173kda、174kda或175kda。

本發(fā)明中使用的殼聚糖的平均分子量可以通過尺寸排阻色譜法(nguyen等人，2009，carbohydratepolymer，75,528-533)來確定。

在另一個實施例中，本發(fā)明中使用的殼聚糖具有高于60％的脫乙酰度(dd)，特別是在60％(mol)和90％(mol)之間，更特別地在60％(mol)和80％(mol)之間，更特別是在60％(mol)至75％(mol)之間，還更特別地在65％(mol)至70％(mol)之間，或約65％(mol)或約70％(mol)，其對應于低于40％的乙?；?da)，特別是在10％(mol)和40％(mol)之間，更特別地在20％(mol)和40％(mol)之間，更特別地在25％(mol)和40％(mol)之間，更特別地在30％(mol)和35％(mol)之間，或約30％(mol)或35％(mol)。

在另一個實施例中，殼聚糖是動物來源的，包括甲殼類動物，諸如螃蟹、蝦，魷魚骨板和墨魚以及昆蟲。

在另一個實施例中，殼聚糖是真菌來源的。各種真菌(包括子囊菌、接合菌、擔子菌和果肉菌)的菌絲體是幾丁質(zhì)和殼聚糖的替代來源(pochanavanich和suntornsuk，2002，lett.，appl.microbiol.，35：17-21)。例如，本發(fā)明的組合物中所含的殼聚糖可以從包括雙孢蘑菇、姬松茸、絲膜環(huán)菌、黑曲霉、黑木耳、龍膽菌、香菇、魯氏毛霉、平菇、側(cè)耳菇、杏鮑菇、云芝(特別是從也稱為白蘑菇的雙孢蘑菇(a.bisporus))的蘑菇中通過本領域眾所周知的方法提取，諸如由以下三個步驟組成的典型提取方法：(1)堿性處理以去除蛋白質(zhì)和堿溶性多糖；(2)酸回流以分離幾丁質(zhì)和殼聚糖；和(3)在堿性條件下沉淀殼聚糖。通過堿處理去除蛋白質(zhì)通常用1nnaoh在95℃下進行1至6小時或在121℃下進行0.25小時至1小時。通過酸處理分離殼聚糖通常通過2～10％乙酸或鹽酸在95℃下進行3～14小時。用于產(chǎn)生殼聚糖的替代方法包括nwe等人，2010，biopolymers，magdyelnashareditor，第7章：135-162中描述的酶法。

根據(jù)本發(fā)明的有利地包含真菌來源的殼聚糖的組合物表現(xiàn)出有利的性質(zhì)，諸如不存在動物蛋白質(zhì)，與動物來源的殼聚糖相比，分子量和脫乙酰度的變化性較低。

本發(fā)明的所述組合物進一步有利地表現(xiàn)出抗微生物活性，特別是抗靜電或殺菌活性。

本發(fā)明的所述組合物有利地表現(xiàn)出抗脂肪酶活性。

在另一個具體實施例中，殼聚糖(含有游離氨基(-nh2)的殼聚糖)的胺形式用于本發(fā)明中。

在另一個具體實施例中，殼聚糖堿用于本發(fā)明中。

在一個具體實施例中，本發(fā)明的組合物的ph在6至7.5之間，特別地在6至約7之間，更特別地在6.5至約7之間，例如約6.5。

在另一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物包含基于總組合物的濃度為約0.05％至約3％(w/w)的殼聚糖，特別地從約0.2％至約1％(w/w)，更特別地從約0.5％至約0.75％(w/w)，或約0.5％(w/w)。

為了本發(fā)明的目的，根據(jù)所使用的殼聚糖的平均分子量和脫乙酰度以及根據(jù)組合物的所需粘度調(diào)節(jié)殼聚糖的濃度。

通常，本發(fā)明的組合物具有10mpa.s至500mpa.s之間的粘度，例如10mpa.s至100mpa.s之間或約20mpa.s，諸如16mpa.s、17mpa.s、18mpa.s、19mpa.s、20mpa.s、21mpa.s、22mpa.s、23mpa.s、24mpa.s。

通常，本發(fā)明的組合物顯示出假塑性和粘彈性。

這些性質(zhì)使得根據(jù)本發(fā)明的組合物特別適用于眼科應用中的人工淚液和用于再生醫(yī)學的關(guān)節(jié)內(nèi)注射的應用。

通常，本發(fā)明的組合物表現(xiàn)出非牛頓流變行為。這種流變行為使得本發(fā)明的組合物特別適用于眼科應用，例如用作治療干眼綜合征的人工淚液。

在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的組合物中的甘油的濃度為0.2-2％(w/w)，特別地為0.4-1％(w/w)，更特別地為0.4-0.6％(w/w)，或約0.4％(w/w)，諸如0.36％(w/w)、0.37％(w/w)、0.38％(w/w)、0.39％(w/w)、0.40％(w/w)、0.41％(w/w)、0.42％(w/w)、0.43％(w/w)、0.44％(w/w)或0.45％(w/w)，或約0.5％(w/w)，諸如0.46％(w/w)、0.47％(w/w)、0.48％(w/w)、0.49％(w/w)、0.50％(w/w)、0.51％(w/w)、0.52％(w/w)、0.53％(w/w)、054％(w/w)、0.55％(w/w)

在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，甘油降低了組合物的粘性，并且可以在蒸汽滅菌期間用作殼聚糖的保護劑。甘油也可以作為滲透劑，并且在根據(jù)本發(fā)明的組合物的滲透保護中起作用。

通常，根據(jù)本發(fā)明的組合物的重量摩爾滲透壓濃度為150-350mosm/kg，更特別地在240-340mosm/kg之間，例如約280或300mosmol/kg。

在另一個實施例中，本發(fā)明的組合物在接近7的中性ph的ph下是穩(wěn)定和透明的，例如在高于6、高于6.2、約6.5、高于6.5、約7或在6.5至約7之間的ph下。

根據(jù)本發(fā)明的組合物的優(yōu)點之一是在接近7.4的生理ph或接近中性ph的ph下高壓滅菌后形成穩(wěn)定且透明的溶液，而不需要加入堿，堿通常導致在現(xiàn)有技術(shù)的組合物和工藝的情況下的殼聚糖的沉淀。

在一個具體實施例中，本發(fā)明的組合物在熱滅菌(包括通過高壓滅菌，例如在121℃下滅菌15分鐘)之后在所述ph下形成穩(wěn)定、透明和粘稠的溶液。更具體地，本發(fā)明的組合物在熱滅菌后在所述ph下形成穩(wěn)定、透明、無色和粘稠的溶液。

治療應用

本發(fā)明的另一方面涉及如本文所述的用于治療干眼綜合征(特別是瞼炎的干眼癥、由環(huán)境條件或隱形眼鏡引起的眼睛刺激、干燥性角膜結(jié)膜炎、綜合征、由對殼聚糖敏感的細菌引起的眼睛表面或相關(guān)的前結(jié)構(gòu)的細菌感染)的組合物(特別是眼用組合物)。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種如本文所述用于治療關(guān)節(jié)炎疾病(包括骨關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎)的組合物。

本發(fā)明的另一方面提供了本文所述的組合物的用途，其用于制造用于治療干眼綜合征(特別是瞼炎的干眼癥、由環(huán)境條件或隱形眼鏡引起的眼睛刺激、干燥性角膜結(jié)膜炎、綜合征、由對殼聚糖敏感的細菌引起的眼睛表面或相關(guān)的前結(jié)構(gòu)的細菌感染)的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，提供了本文所述的組合物的用途，其用于制備用于治療關(guān)節(jié)炎疾病(包括骨關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、幼年型關(guān)節(jié)炎)的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于預防和/或治療干眼綜合征(特別是瞼炎的干眼綜合癥、由環(huán)境條件或隱形眼鏡引起的眼睛刺激、干燥性角膜結(jié)膜炎、綜合征、由對殼聚糖敏感的細菌引起的眼睛表面或相關(guān)的前結(jié)構(gòu)的細菌感染)的方法，包括在有需要的受試者中給藥治療有效量的如本文所述的組合物。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于預防和/或治療關(guān)節(jié)炎疾病(包括骨關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎)的方法，包括在有需要的受試者中給藥治療有效量的如本文所述的組合物。

給藥模式

本發(fā)明的組合物可以以任何方式給藥，包括但不限于口服、腸胃外、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、局部、眼內(nèi)或其組合。

對于眼科應用，根據(jù)本發(fā)明的組合物的適當給藥模式是例如作為人工淚液的局部給藥，或玻璃體內(nèi)和結(jié)膜下給藥。

對于治療應用，在關(guān)節(jié)炎疾病的治療中，關(guān)節(jié)內(nèi)注射構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的組合物的適當給藥方式。

根據(jù)具體實施例，實例的組合物可以以單劑量單位或適當?shù)亩鄤┝繜o防腐劑容器包裝。例如，對于眼科應用，實例的組合物可以以方便的滴劑形式在眼睛中滴注來局部給藥。

組合

根據(jù)本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以單獨給藥或與用于預防和/或治療待治療的疾病的助劑組合給藥。

例如，為了治療具有瞼炎的干眼綜合征，根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖和甘油的組合物還可以與抗生素、抗炎劑、抗青光眼產(chǎn)品(前列腺素、β-腎上腺素能阻滯劑)、抗過敏產(chǎn)品一起給藥。

例如，根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖和甘油的組合物還可以與凝膠形成劑(諸如藻酸鹽或支鏈淀粉)一起給藥。

本發(fā)明包括給藥根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖和甘油的組合物，其中所述試劑在與用于預防和/或治療疾病的其它治療方案或助劑之前、同時或依次以治療有效量給藥于個體。與所述助劑同時給藥的根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖和甘油的組合物可以以相同或不同的組合物以及相同或不同的給藥途徑給藥。

本文引用的參考文獻通過引用整體并入本文。本發(fā)明的范圍不受本文所述的具體實施例的限制，這些具體實施例旨在作為本發(fā)明的各個方面的單一說明，并且功能上等同的方法和組分在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，除了本文所示和所述的那些之外，本發(fā)明的各種修改對于本領域技術(shù)人員將從前述描述和附圖中變得顯而易見。這樣的修改旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

已經(jīng)描述了本發(fā)明，通過說明而非限制的方式給出了以下實例。

實例

實例1：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.5％)和甘油的組合物的生產(chǎn)

將平均分子量為173kda、乙酰化度為35％(mol)的真菌來源的0.500g殼聚糖在室溫下在磁力攪拌下溶解于含有0.194g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解殼聚糖后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5，并將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有0.5％的殼聚糖、0.175(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為18mpa·s，ph為6.5，和重量摩爾滲透壓濃度為304mosmol/kg。

實例2：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.5％)和甘油的組合物的生產(chǎn)

將分子量為172kda、乙酰化度為32mol(％)的真菌來源的0.500g殼聚糖在室溫下在磁力攪拌下溶解于含有0.2045g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解殼聚糖后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5，并將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。在熱滅菌之前和之后研究溶液的流變曲線。所得水溶液含有0.5％的殼聚糖、0.184％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，熱滅菌之前的粘度為20mpas.s，ph值為6.5，

重量摩爾滲透壓濃度為318mosmol/kg。在高壓滅菌之后，所得溶液是透明、粘稠的，粘度為18mpa.s，ph為6.4，并且重量摩爾滲透壓濃度為322mosmol/kg。如圖1所示，在熱滅菌之前和之后的根據(jù)本發(fā)明的包含0.5％殼聚糖的組合物的流變曲線表明，甘油保護制劑免于熱滅菌期間的動態(tài)粘度的大量降低。

實例3：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.4％)、甘油和支鏈淀粉的組合物的生產(chǎn)

在室溫下在磁力攪拌下將1.00g支鏈淀粉(10kda)溶解在含有0.194g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解支鏈淀粉之后，溶解平均分子量為159kda、乙?；葹?1mol(％)的真菌來源的0.400g殼聚糖。在殼聚糖完全溶解后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5和將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有0.4％殼聚糖、1.0％支鏈淀粉、0.175％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為44mpas.s，ph為6.5，重量摩爾滲透壓濃度為320mosmol/kg。

實例4：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.3％)、甘油和支鏈淀粉的組合物的生產(chǎn)

在室溫下在磁力攪拌下將1.00g支鏈淀粉溶解于含有0.194g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解支鏈淀粉之后，溶解分子量為159kda、乙?；葹?1mol(％)的真菌來源的0.300g殼聚糖。在殼聚糖完全溶解后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5和將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有0.3％殼聚糖、1.0％支鏈淀粉、0.175％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為27mpas.s，ph為6.6，重量摩爾滲透壓濃度為318mosmol/kg。

實例5：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.4％)、甘油和支鏈淀粉的組合物的生產(chǎn)

在室溫下在磁力攪拌下將0.50g支鏈淀粉(10kda)溶解在含有0.194g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解支鏈淀粉之后，溶解平均分子量為159kda、乙?；葹?1mol(％)的真菌來源的0.400g殼聚糖。在殼聚糖完全溶解后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5和將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有0.4％殼聚糖、0.5％支鏈淀粉、0.175％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為33mpas.s、ph為6.5，重量摩爾滲透壓濃度為325mosmol/kg。

實例6：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(1％)和甘油的組合物的生產(chǎn)

將平均分子量為159kda、乙?；葹?1mol(％)的真菌來源的1.0g殼聚糖在室溫下在磁力攪拌下溶解于含有0.414g乳酸(90％)的55g水溶液中(溶解時間5h-9h)。在完全溶解殼聚糖后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5，并將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有1.0％殼聚糖、0.372％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為73mpas.s，ph為6.4，重量摩爾滲透壓濃度為307mosmol/kg。如圖2所示，在熱滅菌之前和之后的根據(jù)本發(fā)明的包含1％殼聚糖的組合物的流變曲線表明，甘油保護殼聚糖免受熱滅菌期間的制劑的粘度的大量降低。

實例7：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(2％)和甘油的組合物的生產(chǎn)

將平均分子量為159kda、乙酰化度為31mol(％)的真菌來源的2.0g殼聚糖在室溫下在磁力攪拌下溶解于含有0.828g乳酸(90％)的55g水溶液中(溶解時間5h-9h)。在完全溶解殼聚糖后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5，并將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。所得水溶液含有2.0％殼聚糖、0.744％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，粘度為802mpas.s，ph為6.1，重量摩爾滲透壓濃度為310mosmol/kg。如圖4所示，在熱滅菌之前和之后的包含2％殼聚糖的根據(jù)本發(fā)明的組合物的流變曲線表明，甘油保護殼聚糖免受熱滅菌期間的制劑的粘度的大量降低。

實例8：粘膜粘附性

使用兩種方法在體外評估粘膜粘附性，即粒度測試和濁度測試，并與標準的0.18％透明質(zhì)酸滴眼液進行比較。粒度測試指出了真菌來源的殼聚糖與粘蛋白之間的尺寸為1μm的聚集體的形成，表明粘膜粘附，而在粘蛋白和透明質(zhì)酸之間沒有形成聚集體。使用濁度測試獲得了相同的結(jié)果，當將殼聚糖制劑與粘蛋白混合時，顯示濁度溶液顯著增加，而當透明質(zhì)酸與粘蛋白混合時，沒有觀察到濁度信號增加的跡象(圖3)。

實例9：抗脂肪酶活性

使用biovision的lipaseactivityassaykitii進行抗脂肪酶活性。在探針(dtnb)的存在下，將脂肪酶底物加入到含有殼聚糖(0.5％)和甘油(0.625％)的組合物中，根據(jù)脂肪酶的活性將顏色從無色變?yōu)辄S色。在包含真菌來源的殼聚糖和甘油的組合物的存在下，探針保持無色或稍微黃色，表明根據(jù)本發(fā)明的組合物具有抗脂肪酶活性。本發(fā)明的組合物的抗脂肪酶活性可能是本發(fā)明的用途的另一個優(yōu)點。

實例10：根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(0.5％)和甘油的組合物的生產(chǎn)

將平均分子量在100-250kda和乙酰化度為28mol(％)的動物來源的0.500g殼聚糖(heppemedicalchitosan，deutschland)在室溫下在磁力攪拌下溶解在含有0.219g乳酸(90％)的55g水溶液中。在完全溶解殼聚糖后，將0.625g85％甘油和42.3g含有1.4g琥珀酸鈉的水溶液加入到殼聚糖溶液中以將ph增加至約6.5，并將重量摩爾滲透壓濃度增加至約300mosmol/kg。加入水至最終容量為100g。然后將溶液在121℃高壓滅菌15分鐘。在熱滅菌之前和之后研究溶液的流變曲線。所得水溶液含有0.5％殼聚糖、0.197％(w/w)乳酸、1.40％(w/w)琥珀酸鈉、0.531％(w/w)甘油，在熱滅菌之前的粘度為18mpas.s，ph值為6.5，重量摩爾滲透壓濃度為318mosmol/kg。在高壓滅菌后，得到的溶液是透明、粘稠的，粘度為17mpa·s，ph為6.5，重量摩爾滲透壓濃度為315mosmol/kg。如圖5所示，在熱滅菌之前和之后的根據(jù)本發(fā)明的包含0.5％殼聚糖的組合物的流變曲線表明，甘油保護制劑免于熱滅菌期間的動態(tài)粘度的大量降低。

實例11：與其它工藝相比，根據(jù)本發(fā)明的工藝的包含殼聚糖(0.5％)的組合物的生產(chǎn)

使用不同的工藝制備含有0.5％的真菌來源的殼聚糖的制劑，即：比較工藝a)混合所有賦形劑(乳酸、琥珀酸鈉、甘油)，所得溶液通過熱滅菌進行滅菌，然后加入殼聚糖；本發(fā)明的工藝b)將殼聚糖溶解在乳酸中；然后加入琥珀酸鈉和甘油，并且最終溶液通過熱滅菌進行滅菌；比較工藝c)將殼聚糖加入到琥珀酸鈉和甘油溶液中，通過熱滅菌對所得懸浮液滅菌，然后加入乳酸來溶解殼聚糖。測量ph值、重量摩爾滲透壓濃度，結(jié)果示于表1。

表1

上述結(jié)果表明，只有本發(fā)明的工藝b使得最終制劑沒有可見顆粒，因此適用于制備眼用組合物。

實例12：與比較制劑相比，根據(jù)本發(fā)明的包含殼聚糖(1％)的組合物

如表2所示，具有兩種不同百分比的殼聚糖的幾種制劑溶解在不同的酸中。加入足夠量的酸以完全溶解真菌來源的殼聚糖。此后，加入各種堿使ph增加至6.5。評估每種溶液的濁度以及重量摩爾滲透壓濃度。結(jié)果示于表2。

表2

這些數(shù)據(jù)支持這樣的事實：在本發(fā)明的工藝中使用弱酸和弱堿是必要的，因為強酸或強堿不合適，因為溶液太渾濁(comp1-4)。此外，重量摩爾滲透壓濃度結(jié)果表明，乳酸(弱酸)和琥珀酸鹽或山梨酸鹽(弱堿)特別適用于眼用溶液的制備，因為它們允許達到300mosmol/kg的目標重量摩爾滲透壓濃度，適用于眼科應用。