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用于制備序列文庫的方法和組合物與流程

文檔序號(hào):12070531閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.制備用于測(cè)序的靶核酸群體的方法,所述方法包括:

(a)提供具有包含捕捉部分的表面的基底;

(b)使所述表面與包含多個(gè)模板核酸和轉(zhuǎn)座體的反應(yīng)體積接觸,其中每個(gè)轉(zhuǎn)座體包含轉(zhuǎn)座子序列和轉(zhuǎn)座酶,其中通過使靶核酸與多個(gè)轉(zhuǎn)座體接觸來制備所述模板核酸;并且

(c)將所述模板核酸與所述捕捉部分締合。

2.權(quán)利要求1的方法,其還包括(d)測(cè)序締合的模板核酸。

3.權(quán)利要求2的方法,其還包括在(c)之后和(d)之前擴(kuò)增締合的模板核酸。

4.權(quán)利要求3的方法,其中所述擴(kuò)增包括橋式擴(kuò)增。

5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法,其中(a)還包括提供包含所述靶核酸和所述轉(zhuǎn)座體的樣品。

6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法,其中所述樣品包含聚合酶和/或連接酶。

7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中通過在所述表面的存在下使所述靶核酸與所述多個(gè)轉(zhuǎn)座體接觸來制備所述模板核酸。

8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法,其中在使所述表面與包含多個(gè)模板核酸和轉(zhuǎn)座酶的反應(yīng)體積接觸之前,通過使所述靶核酸與所述多個(gè)轉(zhuǎn)座體接觸來制備所述模板核酸。

9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法,其中在使所述表面與所述反應(yīng)體積接觸后,將聚合酶和/或連接酶添加到所述反應(yīng)體積中。

10.權(quán)利要求9的方法,其中步驟(c)包括用所述聚合酶或用聚合酶和連接酶延伸所述模板核酸。

11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法,其中所述捕捉部分是捕捉探針。

12.權(quán)利要求11的方法,其中所述捕捉探針包括核酸。

13.權(quán)利要求12的方法,其中步驟(c)包括使所述模板核酸與所述捕捉探針雜交。

14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(c)包括制備單鏈模板核酸。

15.權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(c)包括使所述捕捉探針和所述模板核酸與重組酶接觸。

16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法,其中所述模板核酸和所述捕捉部分各自包含親和部分。

17.權(quán)利要求16的方法,其中所述親和部分選自生物素,抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。

18.權(quán)利要求16-17中任一項(xiàng)的方法,其中步驟(c)包括將所述模板核酸的親和部分與所述捕捉探針的親和部分結(jié)合。

19.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的方法,其中所述轉(zhuǎn)座子序列包含選自條形碼,UMI,測(cè)序引物和片段化位點(diǎn)的序列。

20.權(quán)利要求19的方法,其還包括切割所述片段化位點(diǎn)。

21.權(quán)利要求20的方法,其中在步驟(c)之后切割所述片段化位點(diǎn)。

22.權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的方法,其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)座體包含兩個(gè)轉(zhuǎn)座子序列。

23.權(quán)利要求22的方法,其中所述轉(zhuǎn)座子序列是不同的。

24.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法,其中在步驟(b)之后除去所述轉(zhuǎn)座酶。

25.權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)的方法,其中在(c)之后除去所述轉(zhuǎn)座酶。

26.權(quán)利要求1-25中任一項(xiàng)的方法,其中通過使所述轉(zhuǎn)座酶與蛋白酶或SDS接觸來除去所述轉(zhuǎn)座酶。

27.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法,其中所述轉(zhuǎn)座酶選自Tn5,Tn5的變體,超活性Tn5,Tn10和Mu。

28.權(quán)利要求1-27中任一項(xiàng)的方法,其中至少一個(gè)轉(zhuǎn)座體不同于至少一個(gè)其它轉(zhuǎn)座體。

29.權(quán)利要求1-28中任一項(xiàng)的方法,其中使用所述模板核酸在表面上的接近性確定從所述模板核酸獲得的序列在所述靶核酸序列的線性表示中的接近性。

30.權(quán)利要求29的方法,其中確定所述表面上彼此更接近的模板核酸包含與較不接近的模板核酸相比在所述靶核酸序列的表示中更接近的序列。

31.權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)的方法,其中所述靶核酸序列的表示包括單倍型信息。

32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的方法,其中所述靶核酸選自DNA和RNA。

33.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)的方法,其中所述靶核酸選自基因組DNA和cDNA。

34.權(quán)利要求33的方法,其中所述靶核酸是基因組DNA。

35.權(quán)利要求1-34中任一項(xiàng)的方法,其中所述基底選自由至少一種珠,載玻片,流動(dòng)池,通道,浸漬片和孔組成的組。

36.權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的方法,其中所述表面包含每mm2至少約10,000個(gè)締合的模板核酸。

37.權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的方法,其中所述表面包含每mm2至少約100,000個(gè)締合的模板核酸。

38.權(quán)利要求1-35中任一項(xiàng)的方法,其中所述表面包含每mm2至少約1,000,000個(gè)締合的模板核酸。

39.用于對(duì)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)所述的靶核酸測(cè)序的反應(yīng)容器,其包含:

包含具有捕捉部分的表面的基底;和

與所述表面流體連通的反應(yīng)體積,所述反應(yīng)體積包含:

轉(zhuǎn)座酶,

通過使靶核酸與多個(gè)轉(zhuǎn)座體接觸而制備的多個(gè)模板核酸,每個(gè)轉(zhuǎn)座體包含轉(zhuǎn)座子序列和所述轉(zhuǎn)座酶,以及

聚合酶或連接酶。

40.權(quán)利要求39的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,其中所述捕捉探針附著在所述表面上的形成重復(fù)模式的位點(diǎn)處。

41.權(quán)利要求40的反應(yīng)容器,其中所述捕捉探針被限制在所述表面上的所述位點(diǎn),且在所述位點(diǎn)之間的間隙區(qū)域處不存在。

42.權(quán)利要求39-41中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述反應(yīng)體積同時(shí)包含用于反應(yīng)步驟的反應(yīng)物,所述步驟包括:

將所述轉(zhuǎn)座子序列轉(zhuǎn)座到所述靶核酸中;

用所述聚合酶,或聚合酶和連接酶延伸所述模板核酸;和

將所述模板核酸與所述捕捉部分締合。

43.權(quán)利要求39-42中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述反應(yīng)體積配置用于包括在蛋白酶或SDS的存在下去除所述轉(zhuǎn)座酶的反應(yīng)步驟。

44.權(quán)利要求39-43中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述反應(yīng)體積配置用于在重組酶存在下將所述模板核酸與所述捕捉探針締合。

45.權(quán)利要求39-44中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述反應(yīng)體積配置用于擴(kuò)增與所述捕捉探針締合的所述模板核酸。

46.權(quán)利要求45的反應(yīng)容器,其中所述擴(kuò)增是橋式擴(kuò)增。

47.權(quán)利要求39-46中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述反應(yīng)體積包含試劑,其用于將所述轉(zhuǎn)座子序列序貫轉(zhuǎn)座到所述靶核酸中;然后用所述聚合酶或用所述聚合酶和連接酶延伸所述模板核酸;然后將所述模板核酸與所述捕捉探針締合。

48.權(quán)利要求39-47中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述反應(yīng)體積包括在蛋白酶或SDS的存在下除去所述轉(zhuǎn)座酶的試劑。

49.權(quán)利要求39-48中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述反應(yīng)體積包含用于在重組酶存在下將所述模板核酸與所述捕捉探針締合的試劑。

50.權(quán)利要求39-49中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述反應(yīng)體積包括用于擴(kuò)增與所述捕捉探針締合的模板核酸的試劑。

51.權(quán)利要求39-50中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述模板核酸與所述捕捉探針締合。

52.權(quán)利要求39-51中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述捕捉探針包括核酸。

53.權(quán)利要求39-52中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述模板核酸與所述捕捉探針雜交。

54.權(quán)利要求39-53中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述模板核酸中的至少一種和所述捕捉探針中的至少一種各自包含親和部分。

55.權(quán)利要求54的反應(yīng)容器,其中所述親和部分選自生物素,抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。

56.權(quán)利要求39-55中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述捕捉探針包括重組酶。

57.權(quán)利要求54-55中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述模板核酸中的至少一種的親和部分附著到所述捕捉探針中的至少一種的親和部分。

58.權(quán)利要求39-57中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述轉(zhuǎn)座酶選自Tn5,Tn5變體,超活性Tn5,Tn10和Mu。

59.權(quán)利要求39-58中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述轉(zhuǎn)座子序列包含選自條形碼,UMI,測(cè)序引物和片段化位點(diǎn)的序列。

60.權(quán)利要求39-59中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)容器,其中所述轉(zhuǎn)座體包含兩個(gè)轉(zhuǎn)座子。

61.權(quán)利要求60的反應(yīng)容器,其中所述轉(zhuǎn)座子序列彼此不同。

62.權(quán)利要求39-61中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述靶核酸選自DNA和RNA。

63.權(quán)利要求39-62中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述靶核酸選自基因組DNA和cDNA。

64.權(quán)利要求63的方法,其中所述靶核酸是基因組DNA。

65.權(quán)利要求39-64中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述基底選自由至少一種珠,載玻片,流動(dòng)池,通道,浸漬片和孔組成的組。

66.權(quán)利要求39-65中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中所述模板核酸與所述捕捉探針締合。

67.權(quán)利要求39-66中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)容器,其中所述表面包含每mm2至少約10,000個(gè)模板核酸。

68.權(quán)利要求39-66所述的反應(yīng)容器,其中所述表面包含每mm2至少約100,000個(gè)模板核酸。

69.權(quán)利要求39-66所述的反應(yīng)容器,其中所述表面包含每mm2至少約1,000,000個(gè)模板核酸。

70.權(quán)利要求39-69中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中在所述靶核酸序列的線性表示中從兩個(gè)模板核酸獲得的序列接近性信息指示所述模板核酸在所述表面上的接近性。

71.權(quán)利要求39-69中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中在所述表面上彼此更接近的模板核酸包含與在較不接近的模板核酸相比在所述靶核酸序列的表示中更接近的序列。

72.權(quán)利要求70-71中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器,其中所述靶核酸序列的表示包括單倍型表示。

73.流動(dòng)池,其包括權(quán)利要求39-72中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器。

74.用于對(duì)靶核酸測(cè)序的系統(tǒng),其包括:

權(quán)利要求39-72中任一項(xiàng)的反應(yīng)容器;

用于調(diào)節(jié)所述反應(yīng)容器的溫度的熱循環(huán)儀;和

用于收集來自所述反應(yīng)容器的信號(hào)的檢測(cè)器。

75.權(quán)利要求74的系統(tǒng),其包含處理器,所述處理器包含調(diào)節(jié)所述反應(yīng)容器的溫度以實(shí)施步驟的指令,所述步驟包括:

將所述轉(zhuǎn)座子序列轉(zhuǎn)座到所述靶核酸中,

用所述聚合酶或連接酶延伸所述模板核酸,并且

將所述模板核酸與所述捕捉部分締合。

76.權(quán)利要求75的系統(tǒng),其中所述捕捉部分是多個(gè)捕捉探針,并且其中調(diào)節(jié)所述反應(yīng)容器的溫度以實(shí)施步驟的指令包括擴(kuò)增與所述捕捉探針締合的所述模板核酸。

77.權(quán)利要求76的系統(tǒng),其中所述擴(kuò)增是橋式擴(kuò)增。

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