本公開內(nèi)容涉及對白細(xì)胞介素-6(以下稱為IL-6)具有結(jié)合親和力的一類工程化多肽。本公開內(nèi)容還涉及此類IL-6結(jié)合多肽作為治療劑、預(yù)后劑和/或診斷劑的用途。背景炎癥是由細(xì)胞因子驅(qū)動的先天免疫系統(tǒng)的響應(yīng)，以破壞例如病原體和損傷的細(xì)胞。在一些疾病狀況諸如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)和克羅恩病中，炎癥系統(tǒng)的調(diào)節(jié)被損害，導(dǎo)致組織損傷。其中研究最多的炎癥誘導(dǎo)物是細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)。IL-6也被稱為B細(xì)胞刺激因子2(BSF2)、肝細(xì)胞刺激因子(HSF)、雜交瘤生長因子(HGF)和干擾素-β2(IFNB2)。人IL-6由具有21kDa的分子量的184個氨基酸的多肽單鏈組成，但是，可變化的糖基化模式導(dǎo)致在21-26kDa之間變化的大小。IL-6由很多種細(xì)胞類型分泌，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞。下游信號傳導(dǎo)引起從急性炎癥向獲得性免疫或慢性炎性疾病的轉(zhuǎn)換。IL-6信號傳導(dǎo)及其調(diào)節(jié)是復(fù)雜的并涉及很多因子和機(jī)制。IL-6信號傳導(dǎo)可經(jīng)由經(jīng)典IL-6信號傳導(dǎo)途徑發(fā)生，所述典型的IL-6信號傳導(dǎo)途徑也被稱為順式信號傳導(dǎo)途徑(cis-signalingpathway)，或經(jīng)由反式信號傳導(dǎo)途徑(trans-signalingpathway)發(fā)生。在經(jīng)典IL-6信號傳導(dǎo)途徑中，循環(huán)IL-6與膜結(jié)合的IL-6受體α(IL-6Rα)結(jié)合，然后招募膜錨定的gp130輔助受體，導(dǎo)致三元復(fù)合體的形成。該復(fù)合體隨后與第二毗鄰三元復(fù)合體形成二聚體，導(dǎo)致經(jīng)由gp130部分的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Boulanger等,2003,Science300(5628):2101-2104)。在循環(huán)中，IL-6還可與IL-6Ra的可溶胞外域結(jié)合存在。此類復(fù)合體負(fù)責(zé)反式信號傳導(dǎo)機(jī)制，所述反式信號傳導(dǎo)機(jī)制涉及表達(dá)輔助受體gp130但缺乏IL-6Ra的任何細(xì)胞的IL-6依賴性激活(Chalaris等,2011,EurJCellBiol90(6-7):484-494；Assier等,2010,JointBoneSpine77(6):532-6)。已暗示反式信號傳導(dǎo)途徑或促炎途徑是與疾病狀況最相關(guān)的途徑，并因此是最優(yōu)選阻斷的途徑。相反，經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為負(fù)責(zé)重要的抗炎過程和再生過程(Scheller等,2011,BiochimBiophysActa1813(5):878-888)?？笽L-6Rα抗體托珠單抗已被批準(zhǔn)用于IL-6相關(guān)紊亂的臨床應(yīng)用。其他的藥物候選物也被開發(fā)以解決不同的IL-6觸發(fā)途徑。這些候選物包括抗體CNTO136(sirukumab)(Xu等,2011,BrJClinPharmacol72(2):270-281；Zhuang等,2013,IntJClinPharmacolTher51(3):187-199)和MEDI5117(Finch等,2011,JMolBiol411(4):791-807),這些抗體與IL-6細(xì)胞因子本身結(jié)合。另外，旨在選擇性地阻斷反式信號傳導(dǎo)途徑的gp130-Fc融合物CR5/18正在被開發(fā)(Kopf等,2010,NatRevDrugDiscov9(9):703-718；Chalaris等,2012,DigDis30(5):492-499)。炎性疾病的不可預(yù)期且慢性的性質(zhì)以及高度未被滿足的醫(yī)療需求使得有必要開發(fā)新的治療模式。由于組織滲透率與分子的大小負(fù)相關(guān)，相對大的抗體分子固有地具有差的組織分布和滲透能力。因此，單克隆抗體的使用對于療法并不總是最佳的，并且對于提供對IL-6具有高親和力的劑存在持續(xù)的需求。還很感興趣的是提供此類分子在IL-6相關(guān)紊亂的治療、診斷和預(yù)后中的應(yīng)用。發(fā)明概述本公開內(nèi)容的目的是提供新型IL-6結(jié)合劑，所述新型IL-6結(jié)合劑可例如被用于治療應(yīng)用、預(yù)后應(yīng)用和診斷應(yīng)用。本公開內(nèi)容的目的是提供允許靶向多種形式的炎性疾病和自身免疫疾病同時減輕當(dāng)前療法的以上提到的和其他缺點的有效療法的分子。本公開內(nèi)容的另外的目的是提供適于預(yù)后應(yīng)用和診斷應(yīng)用的分子。對于領(lǐng)域技術(shù)人員由本公開內(nèi)容是明顯的這些目的和其他目的由如在所附權(quán)利要求書中要求保護(hù)的和如本文一般性公開的本發(fā)明的不同方面來滿足。因此，在本公開內(nèi)容的第一方面，提供了IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽包含IL-6結(jié)合基序BM，該基序由選自以下的氨基酸序列組成：i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29其中，彼此獨立地，X3選自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；X4選自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7選自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；X11選自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；X16選自N和T；X17選自A、I、T和V；X18選自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；X20選自I、L、M、R、T和V；X21選自A、S、T和V；X25選自I、M、Q、S、T、V和W；X26選自K和S；X28選自F、L、M和Y；且X29選自D和R；以及ii)與在i)中定義的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。一類序列相關(guān)的IL-6結(jié)合多肽的以上定義基于親本支架的許多隨機(jī)多肽變體的統(tǒng)計學(xué)分析，所述多肽變體在若干不同的選擇實驗中針對其與IL-6的相互作用來選擇。所鑒定的IL-6結(jié)合基序，或“BM”相應(yīng)于親本支架的靶結(jié)合區(qū)域，所述區(qū)域構(gòu)成在三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的2個α螺旋。在親本支架中，兩個BM螺旋的改變的氨基酸殘基構(gòu)成用于與抗體的恒定Fc部分相互作用的結(jié)合表面。在本公開內(nèi)容中，結(jié)合表面殘基的隨機(jī)變化和隨后的變體選擇已將Fc相互作用能力替換為與IL-6相互作用的能力。如技術(shù)人員將認(rèn)識到的，任何多肽的功能諸如本公開內(nèi)容的多肽的IL-6結(jié)合能力取決于多肽的三級結(jié)構(gòu)。因此，對多肽中的氨基酸序列作出微小改變而不影響其功能是可能的。因此，本公開內(nèi)容包括IL-6結(jié)合多肽的修飾的變體，所述變體是IL-6結(jié)合特征被保留的變體。以這種方式，本公開內(nèi)容還包括IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽包含與如i)中定義的多肽具有93％或更大的同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，多肽可包含與如i)中定義的多肽至少96％同一的序列。例如，屬于氨基酸殘基的特定功能分組(例如疏水性、親水性、極性等)的氨基酸殘基可被交換為來自相同功能組的另一個氨基酸殘基是可能的。在一些實施方案中，此類變化可在如本文公開的IL-6結(jié)合多肽的序列的任何位置中做出。在其他實施方案中，此類變化可僅在非可變位置中，也稱為支架氨基酸殘基作出。在此類情況中，在可變位置，即序列i)中用“X”表示的位置中的改變不被允許。如在整個說明書中使用的術(shù)語“％同一性”可例如如下計算。利用CLUSTALW算法(Thompson等，NucleicAcidsResearch,22:4673-4680(1994))將查詢序列與靶序列對齊。在相應(yīng)于最短的對齊序列的窗口上進(jìn)行比較。在某些例子中，最短的對齊序列可以是靶序列。在其他例子中，查詢序列可構(gòu)成最短的對齊序列。將每個位置處的氨基酸殘基進(jìn)行比較，并且將在靶序列中具有相同的對應(yīng)物的查詢序列中的位置的百分比被報告為同一性％。如本文使用的“Xn”和“Xm”被用于表示如以上定義的序列i)中位置n和m中的氨基酸，其中n和m是表示從所述序列的N-末端計數(shù)所述序列內(nèi)的氨基酸的位置的整數(shù)。例如，X3和X7分別表示從序列i)的N-末端起位置3和7中的氨基酸。在根據(jù)第一方面的實施方案中，提供了其中序列i)中的Xn獨立地選自根據(jù)表1的一組可能的殘基的多肽。技術(shù)人員將領(lǐng)會到Xn可選自所列出的可能的殘基組中的任何一個并且該選擇獨立于Xm中的氨基酸的選擇，其中n≠m。因此，表1中所列的位置Xn中的可能殘基中的任一個可獨立地與表1中所列的任何其他位置中的可能殘基組合。技術(shù)人員將領(lǐng)會到表1應(yīng)被如下解讀：在根據(jù)第一方面的一個實施方案中，提供了其中序列i)中的氨基酸殘基“Xn”選自“可能的殘基”的多肽。因此，表1公開了本公開內(nèi)容的第一方面的若干個特定且個體化的實施方案。例如，在根據(jù)第一方面的一個實施方案中，提供了其中序列i)中的X3選自A、H、K、Q、R和Y的多肽，并且在根據(jù)第一方面的另一個實施方案中，提供了其中序列i)中的X3選自A、K、Q、R和Y的多肽。為了避免疑問，所列的實施方案在其他實施方案中可自由地組合。例如，一個如此組合的實施方案是其中X3選自A、K、R和Y，而X4選自H和K，且X11選自A、I、L和T的多肽。表1.本公開內(nèi)容的第一方面的實施方案在根據(jù)第一方面的一個特定的實施方案中，提供了多肽，其中在序列i)中，X3選自A、H、K、Q、R和Y；X4選自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7選自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；X11選自A、I、K、L、N、S、T和V；X16為T；X17選自A、I、T和V；X18選自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；X20選自I、L、M、R和V；X21選自A、S和V；X25選自I、Q、S、T、V和W；X26為K；X28選自F、L、M和Y；并且X29為D。在定義IL-6結(jié)合多肽的亞類的更特定的實施方案中，序列i)滿足以下11個條件I-XI中的至少6個：I.X3選自K和R；II.X11選自A和L；III.X16為T；IV.X17選自I和V；V.X18選自D和E；VI.X20為M；VII.X21為A；VIII.X25選自S和T；IX.X26為K；X.X28為F；以及XI.X29為D。在根據(jù)第一方面的IL-6結(jié)合多肽的一些實例中，序列i)滿足11個條件I-XI中的至少7個。更特別地，序列i)可滿足11個條件I-XI中的至少8個，諸如11個條件I-XI中的至少9個，諸如11個條件I-XI中的至少10個，諸如11個條件I-XI的全部。在根據(jù)第一方面的IL-6結(jié)合多肽的一些實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽，其中X17X20X21選自VMA和IMA。在一些實施方案中，X20X21X28為MAF。在一些實施方案中，X17X20X28選自VMF和IMF。在一些實施方案中，X17X21X28選自VAF和IAF。如在以下實驗部分中詳細(xì)描述的，IL-6結(jié)合多肽變體的選擇已導(dǎo)致鑒定出大量個體IL-6結(jié)合基序(BM)序列。這些序列構(gòu)成根據(jù)該方面的序列i)的單獨實施方案。個體IL-6結(jié)合基序的序列相應(yīng)于圖1中展示的SEQIDNO:1-1551中的氨基酸位置8-36。因此，在根據(jù)該方面的IL-6結(jié)合多肽的一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1551組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1502組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在另一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在仍然另一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-5組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。在一個實施方案中，序列i)相應(yīng)于SEQIDNO:1512中從位置8至位置36的序列。在特定的個體實施方案中，序列i)單獨地相應(yīng)于SEQIDNO:1-14中的任一個從位置8至位置36的序列。在本公開內(nèi)容的一些實施方案中，如以上定義的BM“形成”三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的“一部分”。這被理解為意指將BM的序列“插入”進(jìn)原始三螺旋束結(jié)構(gòu)域的序列中或“移植”到原始三螺旋束結(jié)構(gòu)域的序列上，以使得BM替代原始結(jié)構(gòu)域中的相似結(jié)構(gòu)基序。例如，不希望受理論的束縛，BM被認(rèn)為構(gòu)成三螺旋束的三個螺旋中的兩個，并因此可替代任何三螺旋束內(nèi)的這種雙螺旋基序。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到的，三螺旋束結(jié)構(gòu)域的兩個螺旋被兩個BM螺旋的替代的進(jìn)行必須不影響多肽的基本結(jié)構(gòu)。即，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的多肽的Cα骨架的整體折疊與它形成其的一部分的三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的整體折疊基本上相同，例如以相同的順序具有二級結(jié)構(gòu)的相同元件等。因此，如果根據(jù)該方面的該實施方案的多肽具有與原始結(jié)構(gòu)域相同的折疊，則根據(jù)本公開內(nèi)容的BM“形成”三螺旋束結(jié)構(gòu)域的“一部分”，意味著共有基本的結(jié)構(gòu)特性，例如，導(dǎo)致相似的CD光譜的那些特性。技術(shù)人員知道相關(guān)的其他參數(shù)。在特定實施方案中，IL-6結(jié)合基序(BM)因此形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分。例如，BM可基本上構(gòu)成所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有互相連接的環(huán)的兩個α螺旋。在特定的實施方案中，所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自細(xì)菌受體蛋白的結(jié)構(gòu)域。此類結(jié)構(gòu)域的非限制性實例是來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白A的五個不同的三螺旋結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域B，及其衍生物。在一些實施方案中，三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域是蛋白Z的變體，所述蛋白Z源自葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域B。在其中如本文公開的IL-6結(jié)合多肽形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分的實施方案中，IL-6結(jié)合多肽可包含結(jié)合模塊(BMod)，所以結(jié)合模塊的氨基酸序列選自以下：iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；其中[BM]為如本文定義的IL-6結(jié)合基序，條件是X29為D；Xa選自A和S；Xb選自N和E；Xc選自A、S和C；Xd選自E、N和S；Xe選自D、E和S；Xf選自A和S；以及iv)與由iii)定義的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中可以是有益的是，所述多肽在產(chǎn)生和貯存期間以及在體內(nèi)表現(xiàn)出高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，諸如對異構(gòu)化、對化學(xué)修飾、對物理條件的改變以及對蛋白水解的耐受。因此，在其中如本文公開的IL-6結(jié)合多肽形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分的實施方案中，IL-6結(jié)合多肽可包含結(jié)合模塊(BMod)，所述結(jié)合模塊的氨基酸序列選自以下：v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ，其中[BM]為如本文定義的IL-6結(jié)合基序，條件是X29為R；Xa選自A和S；Xb選自N和E；Xc選自A、S和C；Xd選自E、N和S；Xe選自D、E和S；Xf選自A和S；以及vi)與由v)定義的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。如以上所討論的，與以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影響多肽的三級結(jié)構(gòu)及功能的微小變化的多肽也在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。因此，在一些實施方案中，序列iv)和vi)分別與由iii)和v)定義的序列具有至少93％，諸如至少95％，諸如至少97％的同一性。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xa為A。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xa為S。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xb為N。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xb為E。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xc為A。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xc為S。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xc為C。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xd為E。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xd為N。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xd為S。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xe為D。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xe為E。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xe為S。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的XdXe選自EE、ES、SE、SD和SS。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的XdXe為ES。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的XdXe為SE。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的XdXe為SD。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xf為A。在一個實施方案中，序列iii)或v)中的Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為A且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為C且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為S且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為C且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為A；XdXe為ND且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為C；XdXe為ND且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為S；XdXe為ND且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為C；XdXe為ND且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為A；XdXe為SE且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為C；XdXe為SE且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為S；XdXe為SE且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為C；XdXe為SE且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為A；XdXe為SD且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為C；XdXe為SD且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為S；XdXe為SD且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為C；XdXe為SD且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為A；XdXe為ES且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為A；Xb為N；Xc為C；XdXe為ES且Xf為A。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為S；XdXe為ES且Xf為S。在一個實施方案中，在序列iii)或v)中，Xa為S；Xb為E；Xc為C；XdXe為ES且Xf為S。在仍然另外的實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由圖1中展示的SEQIDNO:1-1551組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在另一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1502組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在另一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在仍然另一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-5組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。在一個實施方案中，序列iii)相應(yīng)于序列SEQIDNO:1512中從位置7至位置55的序列。在特定的個體實施方案中，序列iii)單獨地相應(yīng)于SEQIDNO:1-14的任一個中從位置7至位置55的序列。并且，在另外的實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽包含選自以下的氨基酸序列：vii)YA-[BMod]-AP；其中[BMod]是如以上定義的IL-6結(jié)合模塊；和viii)與由vii)定義的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列?？蛇x地，提供了IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽包含選自以下的氨基酸序列：ix)FN-[BMod]-AP；其中[BMod]為如以上定義的IL-6結(jié)合模塊；和x)與由ix)定義的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。如以上所討論的，與以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影響多肽的三級結(jié)構(gòu)及功能的微小變化的多肽也落在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。因此，在一些實施方案中，序列viii)和x)可分別例如與由vii)和ix)定義的序列至少92％，諸如至少94％，諸如至少96％，諸如至少98％同一。在一些實施方案中，IL-6結(jié)合基序可形成包含選自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；其中[BM]為如以上定義的IL-6結(jié)合基序。在一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽包含選自以下的氨基酸序列：xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]為如以上定義的IL-6結(jié)合基序；以及xii)與xi)中定義的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽包含選自以下的氨基酸序列：xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]為如以上定義的IL-6結(jié)合基序；以及xiv)與xiii)中定義的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。再次，與以上的氨基酸序列相比包含不很大程度上影響多肽的三級結(jié)構(gòu)及功能的微小變化的多肽也落在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。因此，在一些實施方案中，序列xii)和xiv)可分別例如與由xi)和xiii)定義的序列至少91％，諸如至少93％，諸如至少94％，諸如至少96％，諸如至少98％同一。此類多肽中的序列xi)可選自由SEQIDNO:1-1551組成的組。在另一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-1502組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-152組成的組。在另一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-150組成的組。在仍然另一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-14組成的組。在一個實施方案中，序列xi)選自由SEQIDNO:1-5組成的組。在一個實施方案中，序列xi)是SEQIDNO:1512。在特定的個體實施方案中，序列xi)單獨地為SEQIDNO:1-14中的任一個。如本文定義的多肽與IL-6的結(jié)合可在體內(nèi)或在體外干擾經(jīng)由IL-6的經(jīng)典順式信號傳導(dǎo)和/或反式信號傳導(dǎo)。因此，在一個實施方案中，提供了如本文定義的IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽能夠阻斷經(jīng)由順式信號傳導(dǎo)途徑的IL-6依賴性信號傳導(dǎo)。在另一個實施方案中，如本文定義的IL-6結(jié)合多肽能夠阻斷經(jīng)由反式信號傳導(dǎo)途徑的IL-6依賴性信號傳導(dǎo)。在另一個實施方案中，如本文定義的IL-6結(jié)合多肽能夠阻斷經(jīng)由順式信號傳導(dǎo)途徑和反式信號傳導(dǎo)途徑兩者的IL-6依賴性信號傳導(dǎo)。半最大抑制濃度(IC50)是物質(zhì)在抑制特定的生物或生化功能方面的效力的測量。該定量測量指示需要多少特定的物質(zhì)以半數(shù)抑制給定的生物過程，并且是本領(lǐng)域經(jīng)常使用的。在一個特定的實施方案中，提供了如本文定義的能夠阻斷IL-6信號傳導(dǎo)的IL-6結(jié)合多肽，以使得阻斷的半最大抑制濃度(IC50)為至多1x10-6M，諸如至多1x10-7M，諸如至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。該阻斷可以是順式信號傳導(dǎo)途徑或反式信號傳導(dǎo)途徑的阻斷。在一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽能夠阻斷L-6/IL-6Rα與gp130的相互作用。如在本說明書中使用的術(shù)語“IL-6結(jié)合”和“對IL-6的結(jié)合親和力”是指可例如通過ELISA或使用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)測試的多肽的特性。例如，如在以下實施例中描述的，IL-6結(jié)合親和力可在以下實驗中被測試：其中多肽的樣品被捕獲在包被抗體的ELISA板上，并加入生物素化的IL-6，隨后是鏈霉親和素綴合的HRP。添加TMB底物，并使用多孔板讀取器，諸如Victor3(PerkinElmer)來測量在450nm處的吸光度。然后，技術(shù)人員可解釋通過此類實驗獲得的結(jié)果，以至少建立多肽對IL-6的結(jié)合親和力的定性測量。如果期望定量測量來例如確定相互作用的EC50值(半最大有效濃度)，也可使用ELISA。多肽對稀釋系列的生物素化的IL-6的響應(yīng)利用如以上描述的ELISA來測量。然后，技術(shù)人員可解釋通過此類實驗獲得的結(jié)果，且EC50值可利用例如GraphPadPrism5和非線性回歸從結(jié)果計算。IL-6結(jié)合親和力還可在以下實驗中測試，在所述實驗中，IL-6或其片段被固定在表面等離子體共振(SPR)儀器的傳感器芯片上，且包含待測試的多肽的樣品在芯片上通過。可選地，待被檢測的多肽被固定在儀器的傳感芯片上，并且使包含IL-6或其片段的樣品在芯片上通過。然后，技術(shù)人員可解釋通過此類實驗獲得的結(jié)果，以至少建立多肽對IL-6的結(jié)合親和力的定性測量。如果期望定量測量來例如確定相互作用的KD值，也可使用表面等離子體共振方法。例如，結(jié)合值可以在Biacore(GEHealthcare)或ProteOnXPR36(Bio-Rad)儀器中來定義。IL-6被適當(dāng)?shù)毓潭ㄔ趦x器的傳感器芯片上，并且將要被確定親和力的多肽的樣品通過連續(xù)稀釋被制備并以隨機(jī)順序被注射。然后，KD值可利用例如由儀器制造商提供的BIAevaluation4.1軟件的1:1Langmui結(jié)合模型，或其他合適的軟件從結(jié)果計算。因此，在一個實施方案中，提供了如本文定義的IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽能夠與IL-6結(jié)合，以使得相互作用的EC50值為至多1x10-7M，諸如至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。在一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽能夠與IL-6結(jié)合，以使得相互作用的KD值為至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。技術(shù)人員將理解，可對根據(jù)本文公開的任何方面的IL-6結(jié)合多肽進(jìn)行多種修飾和/或添加，以對特定應(yīng)用定制多肽而不偏離本公開內(nèi)容的范圍。例如，在一個實施方案中，提供了如本文描述的IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽已在C末端和/或N末端延長和/或包含另外的氨基酸。此類多肽應(yīng)被理解為在多肽鏈的第一個位置和/或最后一個位置(theveryfirstand/ortheverylastposition)處具有一個或更多個另外的氨基酸殘基的多肽。因此，IL-6結(jié)合多肽可包含任何適合數(shù)量的另外的氨基酸殘基，例如至少一個另外的氨基酸殘基。每個另外的氨基酸殘基可單獨或共同地被添加，以例如改進(jìn)多肽的產(chǎn)生、純化、體內(nèi)或體外的穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測。此類另外的氨基酸殘基可包含出于化學(xué)偶聯(lián)的目的添加的一個或更多個氨基酸殘基。這樣的一個實例是添加半胱氨酸殘基。另外的氨基酸殘基還可提供用于多肽的純化或檢測的“標(biāo)簽”，諸如His6標(biāo)簽、(HisGlu)3標(biāo)簽(“HEHEHE”標(biāo)簽)或“myc”(c-myc)標(biāo)簽或“FLAG”標(biāo)簽，用于與對標(biāo)簽特異性的抗體相互作用或在His6標(biāo)簽的情況中用于固定化金屬親和層析(IMAC)。如以上討論的另外的氨基酸可通過化學(xué)綴合(使用已知的有機(jī)化學(xué)方法)或通過任何其他的方法被偶聯(lián)至IL-6結(jié)合多肽，諸如將IL-6結(jié)合多肽表達(dá)為融合蛋白或以任何其他方式直接或經(jīng)由接頭例如氨基酸接頭連接。如以上討論的另外的氨基酸可例如包含一個或更多個多肽結(jié)構(gòu)域。另外的多肽結(jié)構(gòu)域可向IL-6結(jié)合多肽提供另一種功能，諸如例如仍另一種結(jié)合功能、酶促功能、毒性功能、熒光信號傳導(dǎo)功能、或其組合。此外，另外的多肽結(jié)構(gòu)域可提供具有相同IL-6結(jié)合功能的另一種IL-6結(jié)合部分。因此，在另外的實施方案中，提供了多聚體形式的IL-6結(jié)合多肽。所述多聚體被理解為包含至少兩個如本文公開的IL-6結(jié)合多肽作為單體單元，所述單體單元的氨基酸序列可相同或不同。多聚體形式的多肽可包括合適數(shù)目的結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域具有IL-6結(jié)合基序，并且每個結(jié)構(gòu)域形成多聚體內(nèi)的單體。這些結(jié)構(gòu)域可具有相同的氨基酸序列，但可選地，它們可具有不同的氨基酸序列。換言之，本發(fā)明的IL-6結(jié)合多肽可形成同多聚體或異多聚體，例如同二聚體或異二聚體。在一個實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽，其中所述單體單元共價偶聯(lián)在一起。在另一個實施方案中，所述IL-6結(jié)合多肽單體單元被表達(dá)為融合蛋白。在一個實施方案中，提供了呈二聚體形式的IL-6結(jié)合多肽。另外，其中本文描述的IL-6結(jié)合多肽或其多聚體構(gòu)成第一結(jié)構(gòu)域或第一部分，且第二和另外的部分具有除結(jié)合IL-6以外的其他功能的“異種”融合多肽或蛋白或綴合物也被構(gòu)思，并落入本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。此類蛋白中的融合多肽或綴合物的第二和另外的一個或更多個部分也適當(dāng)?shù)鼐哂衅谕纳飳W(xué)活性。因此，在本公開內(nèi)容的第二方面，提供了融合蛋白或綴合物，其包含由根據(jù)第一方面的IL-6結(jié)合多肽組成的第一部分，和由具有期望的生物學(xué)活性的多肽組成的第二部分。在另一個實施方案中，所述融合蛋白或綴合物可另外包含另外的部分，所述另外的部分包含期望的生物學(xué)活性，所述期望的生物學(xué)活性可與所述第二部分的生物學(xué)活性相同或不同。期望的生物學(xué)活性的非限制性實例包括治療活性、結(jié)合活性、以及酶促活性。在一個實施方案中，具有期望的生物學(xué)活性的第二部分是治療活性多肽。治療活性多肽的非限制性實例是生物分子，例如選自由人內(nèi)源酶、激素、生長因子、趨化因子、細(xì)胞因子和淋巴因子組成的組的分子。結(jié)合活性的非限制性實例是增強(qiáng)融合蛋白或綴合物的體內(nèi)半衰期的結(jié)合活性以及發(fā)揮作用以阻斷生物學(xué)活性的結(jié)合活性。在一個特定的實施方案中，結(jié)合活性是增加融合蛋白或綴合物的體內(nèi)半衰期的白蛋白結(jié)合活性。在一個實施方案中，所述白蛋白結(jié)合活性由鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其衍生物提供。在本公開內(nèi)容的該方面的一個實施方案中，提供了包含另外的免疫應(yīng)答修飾劑的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物。另外的免疫應(yīng)答修飾劑的非限制性實例包括免疫抑制劑或免疫調(diào)控劑或其他抗炎劑。例如，如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物可與以下組合使用：病情改變抗風(fēng)濕藥物(disease-modifyingantirheumaticdrug，DMARD)，諸如金鹽、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤和來氟米特；鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，諸如環(huán)孢菌素A或FK506；淋巴細(xì)胞再循環(huán)調(diào)控劑；mTOR抑制劑，諸如雷帕霉素；具有免疫抑制特性的子囊霉素；糖皮質(zhì)激素；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；免疫抑制單克隆抗體；粘附分子抑制劑，諸如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或ICAM-3拮抗劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；抗-TNF劑，諸如依那西普或TNF的單克隆抗體，例如英夫利昔、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗(golimumab)和賽妥珠單抗(certolizumabpegol)；促炎細(xì)胞因子的阻斷劑；IL-1阻斷劑諸如阿那白滯素或IL-1陷阱(trap)；IL-17阻斷劑；趨化因子阻斷劑；非甾體抗炎藥物(NSAID)諸如阿司匹林；以及抗感染劑和其他免疫應(yīng)答調(diào)控劑。因此，在一個實施方案中，所述免疫應(yīng)答改變劑選自由以下組成的組：病情改變抗風(fēng)濕藥物(DMARD)、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、淋巴細(xì)胞再循環(huán)調(diào)控劑、mTOR抑制劑、具有免疫抑制特性的子囊霉素、糖皮質(zhì)激素、皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、免疫抑制單克隆抗體、粘附分子抑制劑、抗-TNF劑、促炎細(xì)胞因子的阻斷劑、IL-1阻斷劑、IL-17阻斷劑、趨化因子阻斷劑、非甾體抗炎藥物(NSAID)及其組合。如技術(shù)人員理解的，根據(jù)第一方面的IL-6結(jié)合多肽可用于融合蛋白或用作任何其他部分的綴合物伴侶。因此，治療活性多肽和免疫應(yīng)答改變劑的以上列舉絕不應(yīng)被解釋為限制性的。技術(shù)人員知道融合蛋白的構(gòu)建往往涉及在待被融合的功能部分之間應(yīng)用接頭，并且存在具有不同特性的不同種類的接頭，諸如柔性的氨基酸接頭、剛性的氨基酸接頭和可裂解的氨基酸接頭。接頭已被用來例如增加穩(wěn)定性或改善融合蛋白的折疊，以增加融合蛋白的表達(dá)、改善融合蛋白的生物學(xué)活性、使融合蛋白能夠靶向或改變?nèi)诤系鞍椎乃幋鷦恿W(xué)。因此，在一個實施方案中，如本文公開的融合蛋白還包含至少一個接頭，諸如選自以下的至少一個接頭：柔性的氨基酸接頭、剛性的氨基酸接頭和可裂解的氨基酸接頭。柔性的接頭在連接的結(jié)構(gòu)域需要一定程度的移動或相互作用時常被用于本領(lǐng)域，并且在一些實施方案中可以是特別有用的。此類接頭通常包括小的、非極性氨基酸(例如G)或極性氨基酸(例如S或T)。一些柔性的接頭主要由G和S殘基的延伸組成，例如(GGGGS)p。調(diào)節(jié)“p”的拷貝數(shù)允許接頭的優(yōu)化，以實現(xiàn)功能部分之間的適當(dāng)分離或以保持必要的內(nèi)部部分相互作用。除了G和S接頭之外，其他的柔性接頭是本領(lǐng)域已知的，諸如包含另外的氨基酸殘基的G和S接頭,所述另外的氨基酸殘基諸如T和A以保持柔性，以及極性氨基酸殘基以改善溶解性。被構(gòu)思用于本文的柔性接頭的實例還包括KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSEKST和GSAGSAAGSGEF。因此，在一個實施方案中，所述接頭是包含甘氨酸(G)、絲氨酸(S)和/或蘇氨酸(T)殘基的柔性接頭。在一個實施方案中，所述接頭具有選自(GnSm)p和(SmGn)p的通式，其中，獨立地，n＝1-7、m＝0-7、n+m≤8且p＝1-7。在一個實施方案中，n＝1-5。在一個實施方案中，m＝0-5。在一個實施方案中，p＝1-5。在一個更具體的實施方案中，n＝4、m＝1且p＝1-4。在甚至更具體的實施方案中，所述接頭為(GGGGS)3。在另一個具體的實施方案中，所述接頭為GGGGS。在另一個具體的實施方案中，所述接頭為VDGS。在另一個具體的實施方案中，所述接頭為ASGS。以上方面還包括其中根據(jù)第一方面的IL-6結(jié)合多肽，或如在根據(jù)第二方面的融合蛋白或綴合物中包含的IL-6結(jié)合多肽還包含標(biāo)記物的多肽，所述標(biāo)記物諸如選自由以下組成的組的標(biāo)記物：熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素和放射性顆粒。例如，此類標(biāo)記物可用于檢測多肽。例如，在其中標(biāo)記的IL-6結(jié)合多肽包含根據(jù)本公開內(nèi)容的第一方面的IL-6結(jié)合多肽和標(biāo)記物的實施方案中，標(biāo)記的多肽例如可以被用于間接標(biāo)記IL-6表達(dá)細(xì)胞，諸如炎癥相關(guān)的癌癥的細(xì)胞。在其他的實施方案中，標(biāo)記的IL-6結(jié)合多肽作為還包含具有期望的生物學(xué)活性的第二部分的融合蛋白或綴合物中的部分存在。標(biāo)記物在一些例子中可僅被偶聯(lián)至IL-6結(jié)合多肽，且在一些例子中被偶聯(lián)至IL-6結(jié)合多肽和綴合物或融合蛋白的第二部分或另外的部分兩者。此外，標(biāo)記物可僅被偶聯(lián)至第二部分或另外的部分并且不偶聯(lián)至IL-6結(jié)合部分也是可能的。因此，在又另一個實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽包含第二部分和任何選地另外的部分，其中所述標(biāo)記物僅被偶聯(lián)至所述第二部分或另外的部分。在其中IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物是放射性標(biāo)記的實施方案中，此類放射性標(biāo)記的多肽可包含放射性核素。大部分的放射性核素具有金屬的性質(zhì)并且金屬通常不能與存在于蛋白和肽中的元素形成穩(wěn)定的共價鍵。出于這個原因，用放射性金屬對蛋白和肽的標(biāo)記借助于與金屬離子形成稱為螯合物的非共價化合物的螯合劑，即多齒配體來進(jìn)行。在IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物的實施方案中，放射性核素的摻入通過提供螯合環(huán)境實現(xiàn)，通過螯合環(huán)境的提供放射性核素可被配位、螯合或絡(luò)合至多肽。螯合劑的一個實例是聚氨基聚羧酸鹽(polyaminopolycarboxylate)類型的螯合劑。這樣的聚氨基聚羧酸鹽螯合劑可被區(qū)分為兩類：大環(huán)螯合劑和無環(huán)螯合劑。在一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物包含由經(jīng)由半胱氨酸殘基的硫醇基或賴氨酸殘基的ε胺基綴合至IL-6結(jié)合多肽的聚氨基聚羧酸鹽螯合劑提供的螯合環(huán)境。用于銦、鎵、釔、鉍、放射性錒系元素(radioactinides)和放射性鑭系元素(radiolanthanides)的放射性同位素的最常用的大環(huán)螯合劑是DOTA(1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的不同衍生物。在一個實施方案中，IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物的螯合環(huán)境由DOTA或其衍生物提供。更具體地，在一個實施方案中，由本公開內(nèi)容所包括的螯合多肽通過使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-馬來酰亞胺乙基乙酰胺(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-tris-aceticacid-10-maleimidoethylacetamide)(馬來酰亞胺單酰胺-DOTA(maleimidomonoamide-DOTA))與所述多肽反應(yīng)來獲得。另外，1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)及其衍生物可用作螯合劑。因此，在一個實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物，其中聚氨基聚羧酸鹽螯合劑是1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸或其衍生物。最常用的無環(huán)聚氨基聚羧酸鹽螯合劑是DTPA(二亞乙基三胺-五乙酸)的不同衍生物。因此，具有由二亞乙基三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合環(huán)境的多肽也被本公開內(nèi)容所包括。在本公開內(nèi)容的另外的方面，提供了編碼如本文描述的IL-6結(jié)合多肽或融合蛋白的多核苷酸；包含所述多核苷酸的表達(dá)載體；和包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本公開內(nèi)容還包括產(chǎn)生如以上描述的多肽或融合蛋白的方法，所述方法包括在容許所述多肽由其表達(dá)載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，和分離所述多肽。本公開內(nèi)容的IL-6結(jié)合多肽可以可選地使用具有保護(hù)的反應(yīng)性側(cè)鏈的氨基酸和/或氨基酸衍生物通過非生物肽合成來制備，所述非生物肽合成包括-將氨基酸和/或氨基酸衍生物逐步偶聯(lián)以形成具有保護(hù)的反應(yīng)性側(cè)鏈的根據(jù)第一方面的多肽，-從多肽的反應(yīng)性側(cè)鏈除去保護(hù)基團(tuán)，和-在水溶液中折疊多肽。應(yīng)理解根據(jù)本公開內(nèi)容的IL-6結(jié)合多肽可獨立地被用作治療劑、診斷劑或預(yù)后劑；或被用作用于靶向例如對IL-6具有直接或間接的作用的其他治療劑或診斷劑的工具。直接的治療效果可例如通過抑制IL-6信號傳導(dǎo)實現(xiàn)。本公開內(nèi)容的分子的小尺寸和穩(wěn)健性賦予了超過基于常規(guī)單克隆抗體的療法的若干種優(yōu)勢。此類優(yōu)勢包括施用模式諸如可選的施用途徑、以比抗體高的劑量施用和不存在Fc介導(dǎo)的副作用。如本文公開的多肽的小尺寸與潛在的非常高的溶解性和穩(wěn)定性結(jié)合允許例如用于皮下注射的在小體積內(nèi)極大摩爾量的藥物。對于全身性施用，這暗示了門診患者利用方便的、小的預(yù)填充注射器或自動注射器以小體積和良好地耐受的劑量施用來“家庭使用”治療。另外，在藥物制品中高摩爾濃度的容量結(jié)合在多樣的制劑中保持功能穩(wěn)定性的能力開啟了局部(topical)(例如皮膚或肺)或口服施用途徑。其中可選的施用途徑可與IL-6介導(dǎo)的疾病特別地相關(guān)的適應(yīng)癥的非限制性實例包括哮喘和銀屑病。在另一方面，提供了組合物，所述組合物包含如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。在一個實施方案中，所述組合物還包含至少一種另外的活性劑，諸如至少兩種另外的活性劑，諸如至少三種另外的活性劑?？勺C明在此類組合中有用的另外的活性劑的非限制性實例是如本文描述的免疫應(yīng)答改變劑和抗癌劑?？拱﹦┑姆窍拗菩詫嵗ㄟx自由以下組成的組的劑：奧瑞他汀(auristatin)、蒽環(huán)霉素、刺孢霉素、考布他汀、阿霉素、倍癌霉素(duocarmycin)、CC-1065抗腫瘤抗生素、海鞘素(ecteinascidin)、格爾德霉素、美登醇(maytansinoid)、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、bouganin、白樹毒素、假單胞菌外毒素38(PE38)、白喉毒素(DT)、及其類似物，及其衍生物及其組合。技術(shù)人員將領(lǐng)會到細(xì)胞毒素劑的非限制性實例包括所述劑的所有可能的變型,例如劑奧瑞他汀包括例如奧瑞他汀E、奧瑞他汀F、奧瑞他汀PE及其衍生物。技術(shù)人員將領(lǐng)會到所述IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或包含如本文描述的抗IL-6結(jié)合蛋白、融合蛋白或綴合物的組合物可利用標(biāo)準(zhǔn)施用技術(shù)施用至受試者，所述標(biāo)準(zhǔn)施用技術(shù)包括口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、含服(buccal)、舌下或栓劑施用。因此，在一個實施方案中，提供了用于口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、含服、舌下或栓劑施用的如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或組合物。IL-6還可充當(dāng)用于診斷和預(yù)后某些癌癥的有價值的標(biāo)志物，諸如炎癥相關(guān)的癌癥，例如肺癌。乳腺癌和結(jié)腸癌。例如，IL-6已被與罹患結(jié)腸直腸癌的患者中的預(yù)后和差的存活聯(lián)系起來(Ky等,JpnJClinOncol.2010Jun；40(6):580-7)。因此，在本公開內(nèi)容的另一個方面，提供了如在本文中描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，用作藥物、預(yù)后劑或診斷劑。在一個實施方案中，所述IL-6結(jié)合多肽被提供用作藥物。在一個實施方案中，提供了如在本文中描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或組合物，用作藥物以體內(nèi)調(diào)控IL-6功能。如本文使用的，術(shù)語“調(diào)控”指改變活性，諸如使IL-6功能亞等位基因部分地抑制或完全地抑制IL-6功能。其中IL-6結(jié)合多肽可用于治療、預(yù)后和/或診斷的IL-6相關(guān)紊亂的非限制性實例包括炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病和抑郁癥，諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，脈管炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，慢性炎癥性腸疾病諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；格雷夫斯病,貝賽特氏病，葡萄膜炎，巨細(xì)胞動脈炎，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，全身性紅斑狼瘡(SLE)，多肌炎，風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgiarheumatic)，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，胰腺炎，腹膜炎，腎炎，川崎病(Kawasaki’sdisease)，干燥綜合征，成人斯蒂爾病(adultStill’sdisease)，結(jié)腸炎相關(guān)性癌癥，直腸癌，腎癌，前列腺癌，惡性淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，卡斯?fàn)柭?Castleman’sdisease)，乳腺癌，肺癌，阿耳茨海默氏病，HIV，糖尿病，膿毒癥，惡病質(zhì)，骨髓增生異常綜合征(MDS)，肝硬化，移植物抗宿主疾病，心肌梗死，子宮內(nèi)膜異位和骨質(zhì)疏松。IL-6相關(guān)癌癥的非限制性實例包括肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌(Schafer和Brugge,JClinInvest.(2007)117(12):3660-3663；Nagasaki等,BritishJournalofCancer(2014)110,469-478)。因此，在一個實施方案中，提供了IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，用于治療、預(yù)后或診斷IL-6相關(guān)紊亂，諸如選自由以下組成的組的紊亂：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病和抑郁癥。在一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自由炎性疾病和自身免疫疾病組成的組。在一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，脈管炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，慢性炎癥性腸疾病諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；格雷夫斯病，貝賽特氏病，葡萄膜炎，巨細(xì)胞動脈炎，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，全身性紅斑狼瘡(SLE)，多肌炎，風(fēng)濕性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，胰腺炎，腹膜炎，腎炎，川崎病，干燥綜合征和成人斯蒂爾病。在另一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂為癌癥，諸如選自由以下組成的組的癌癥：結(jié)腸炎相關(guān)癌癥、腎癌(renalcancer)、腎癌(kidneycancer)、前列腺癌、惡性淋巴細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡斯?fàn)柭?、乳腺癌和肺癌。在另一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、膿毒癥、惡病質(zhì)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宮內(nèi)膜異位和骨質(zhì)疏松。在相關(guān)的方面，提供了治療IL-6相關(guān)紊亂的方法，包括對有相應(yīng)需要的受試者施用有效量的如本文中描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物。在所述方法的更具體的實施方案中，如本文中描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物在體內(nèi)調(diào)控IL-6功能。在一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病和抑郁癥，諸如由炎性疾病和自身免疫疾病組成的組。在所述方面的一個特定的實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，脈管炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，慢性炎癥性腸疾病諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；格雷夫斯病，貝賽特氏病，葡萄膜炎，巨細(xì)胞動脈炎，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，全身性紅斑狼瘡(SLE)，多肌炎，風(fēng)濕性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，胰腺炎，腹膜炎，腎炎，川崎病，干燥綜合征和成人斯蒂爾病。在另一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂為癌癥，諸如選自由以下組成的組的癌癥：結(jié)腸炎相關(guān)癌癥、腎癌(renalcancer)、腎癌(kidneycancer)、前列腺癌、惡性淋巴細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡斯?fàn)柭?、乳腺癌和肺癌。在另一個實施方案中，所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、膿毒癥、惡病質(zhì)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宮內(nèi)膜異位和骨質(zhì)疏松。施用治療有效量的如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或組合物和至少一種第二藥物物質(zhì)可以是有益的，所述至少一種第二藥物物質(zhì)諸如如以上描述的免疫應(yīng)答調(diào)控劑或抗癌劑。如本文使用的，術(shù)語“共施用”包括相伴施用和順序施用。因此，在一個實施方案中，提供了如以上定義的方法，所述方法還包括共施用如以上描述的免疫應(yīng)答調(diào)控劑。在另一個實施方案中，提供了如以上定義的方法，所述方法還包括共施用如以上描述的抗癌劑。在本公開內(nèi)容的另一方面，提供了檢測IL-6的方法，包括：提供疑似含有IL-6的樣品，使所述樣品與如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物接觸，以及檢測IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物的結(jié)合以指示樣品中IL-6的存在。在一個實施方案中，所述方法還包括中間洗滌步驟用于在接觸樣品后移除未結(jié)合的多肽、融合蛋白、綴合物或組合物。在一個實施方案中，所述方法為用于確定受試者中IL-6的存在的診斷或預(yù)后方法，所述方法包括以下步驟：-使受試者或從受試者分離的樣品與如本文描述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物接觸，以及-獲得對應(yīng)于已在所述受試者中或與所述樣品結(jié)合的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物的量的值。在一個實施方案中，所述方法還包括中間洗滌步驟用于在接觸受試者或樣品之后且在獲得值之前移除未結(jié)合的多肽、融合蛋白、綴合物或組合物。在一個實施方案中，所述方法還包括將所述值與參照比較的步驟。所述參照可以是數(shù)值、閾值或視覺指示劑，例如基于顯色反應(yīng)。技術(shù)人員將領(lǐng)會到與參照比較的不同方式在本領(lǐng)域是已知的并且可以是適于使用的。在此方法的一個實施方案中，所述受試者為哺乳動物受試者，諸如人類受試者。在一個實施方案中，所述方法在體內(nèi)進(jìn)行。在另一個實施方案中，所述方法在體外進(jìn)行。盡管本發(fā)明已參考多種示例性方面和實施方案被描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可做出多種改變，且等同物可代替其要素而不偏離本發(fā)明的范圍。另外，許多修改可被做出以使特定情況或分子適應(yīng)本發(fā)明的教導(dǎo)而不偏離其實質(zhì)范圍。因此，意圖本發(fā)明不限于構(gòu)思的任何特定的實施方案，而是本發(fā)明將包括落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)的所有實施方案。附圖簡述圖1是本公開內(nèi)容的IL-6結(jié)合多肽的實例(SEQIDNO:1-1551)、對照多肽(SEQIDNO:1552-1553)、白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)變體PP013(SEQIDNO:1554)的氨基酸序列以及用于選擇、篩選和/或表征本發(fā)明的示例的人IL-6(SEQIDNO:1555)和鼠IL-6(SEQIDNO:1556)的氨基酸序列的列表。在本公開內(nèi)容的IL-6結(jié)合多肽中，推斷的IL-6結(jié)合基序(BM)在每個序列中從位置8延伸至位置36。預(yù)測構(gòu)成這些Z變體的每個內(nèi)的完整三螺旋束的49個氨基酸殘基長多肽的氨基酸序列從位置7延伸到位置55(在本文中被稱為BMod)。圖2顯示了如實施例2中描述的測定的，阻斷hIL-6和hIL-6Rα之間的相互作用的結(jié)果。與被包括用于比較的hIL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗(黑色)相反，測試的IL-6結(jié)合Z變體(灰色)不干擾hIL-6與其受體hIL-6Rα的結(jié)合。圖3顯示了如實施例2中描述的測定的，阻斷hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體與hgp130結(jié)合的結(jié)果。對于所有測試的初始IL-6結(jié)合Z變體(灰色)以及對于被包括用于比較的托珠單抗(黑色)，都觀察到濃度依賴性阻斷。計算的每種變體的IC50值被顯示于表3中。圖4顯示了如實施例2中描述的測定的，在基于表達(dá)gp130的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的系統(tǒng)中IL-6介導(dǎo)的反式信號傳導(dǎo)的濃度依賴性抑制。與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)C末端融合的IL-6結(jié)合Z變體抑制反式信號傳導(dǎo)，而與PP013融合的對照Z變體Z03638(SEQIDNO:1552)并不。托珠單抗被包括用于比較。圖5顯示了如實施例7中描述的測定的，阻斷hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體與hgp130的結(jié)合的結(jié)果。對于所有測試的成熟IL-6結(jié)合Z變體(灰色)以及對于均被包括用于比較的托珠單抗(黑色)和初始結(jié)合物Z06814(SEQIDNO:1512；虛線)，都觀察到濃度依賴性阻斷。所有成熟IL-6結(jié)合Z變體顯示出比在實施例2中測定的初始結(jié)合物更有效的阻斷(比較圖3)。圖6顯示了在實施例7中描述的TF-1細(xì)胞中和測定的結(jié)果。對于所有測試的IL-6結(jié)合Z變體(成熟Z變體以黑色顯示；初始結(jié)合物Z06814(SEQIDNO:1512)顯示為灰色填充的三角形)以及對于托珠單抗(灰色填充的正方形)，都觀察到IL-6引起的TF-1細(xì)胞增殖的濃度依賴依賴性抑制，但對于陰性對照抗體hIgG(灰色填充的圓圈)并不。圖7顯示了如在實施例8中描述的通過在抗關(guān)節(jié)炎小鼠模型中測定IL-6觸發(fā)的血清淀粉樣蛋白-A(SAA)蛋白釋放而評分的，與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)融合的Z變體Z06814(SEQIDNO:1512)的體內(nèi)效力。四組小鼠被給予0mg/kg體重(實心正方形)、0.025mg/kg體重(空心圓點)、2.5mg/kg體重(空心三角形)或25mg/kg體重(實心三角形)的IL-6結(jié)合Z06814-ABD融合蛋白。作為對照，小鼠被給予25mg/kg的與ABD融合的對照Z變體(Z04726；SEQIDNO:1553)(被稱為Z對照-ABD)(空心正方形)。用hIL-6注射小鼠并隨后測量SAA蛋白的水平。兩個另外的對照組小鼠分別接受PBS(實心圓圈)和25mg/kgZ06814-ABD(叉)，但無隨后的IL-6注射。實施例概述以下實施例公開了靶向白介素6(IL-6)的新型Z變體分子的開發(fā)。Z變體利用噬菌體展示技術(shù)獲得。對編碼本文描述的IL-6結(jié)合多肽的基因測序，并且相應(yīng)的氨基酸序列被列于圖1中并由標(biāo)識符SEQIDNO:1-1551表示。實施例1IL-6結(jié)合Z變體的選擇和ELISA篩選在該實施例中，將人IL-6(hIL-6)和鼠IL-6(mIL-6)用作利用Z變體的噬菌體文庫的噬菌體展示選擇中的靶蛋白。對選擇的克隆的DNA測序，并且克隆在大腸桿菌(E.coli)周質(zhì)級分中產(chǎn)生并在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)中針對IL-6測定。材料和方法靶蛋白人和鼠IL-6的生物素化:利用No-WeighEZ-LinkSulfo-NHS-LC-Biotin(ThermoScientific,目錄號21327)根據(jù)制造商的建議以12x摩爾過量將hIL-6和mIL-6(Peprotech,目錄號分別為200-06和216-16)生物素化。反應(yīng)在室溫(RT)進(jìn)行持續(xù)30分鐘。然后，利用Slide-a-lyzer透析盒(ThermoScientific,目錄號66333,3,500MWCO)根據(jù)制造商的指示進(jìn)行緩沖液交換為磷酸緩沖的鹽水(PBS，10mM磷酸鹽、137mMNaCl、2.68mMKCl，pH7.4)。IL-6結(jié)合Z變體的噬菌體展示選擇：基本上如等(2007)JBiotechnol,128:162-183中描述的在噬菌粒pAY02592中構(gòu)建的被展示在噬菌體上的蛋白Z的隨機(jī)變體的文庫被用于選擇IL-6結(jié)合Z變體。在該文庫中，將白蛋白結(jié)合域(縮寫為ABD，并且對應(yīng)于來自鏈球菌(Streptococcus)菌株G148的G蛋白的GA3)用作對于Z變體的融合伴侶。該文庫被表示為Zlib006Naive.II并具有1.5x1010個文庫成員(Z變體)的大小。將來自包含噬菌粒文庫Zlib006Naive.II的甘油儲備液的大腸桿菌RRIΔM15細(xì)胞(Rüther等，(1982)NucleicAcidsRes10:5765-5772)接種在補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素的20l限定的不含脯氨酸的培養(yǎng)基[7g/l磷酸氫二鉀、1g/l檸檬酸三鈉二水合物、0.02g/l尿嘧啶、6.7g/lYNB(DifcoTM不含氨基酸的酵母氮源基礎(chǔ)，BectonDickinson)、5.5g/l一水合葡萄糖、0.3g/lL-丙氨酸、0.24g/lL-精氨酸單鹽酸鹽、0.11g/lL-天冬酰胺一水合物、0.1g/lL-半胱氨酸、0.3g/lL-谷氨酸、0.1g/lL-谷氨酰胺、0.2g/l甘氨酸、0.05g/lL-組氨酸、0.1g/lL-異亮氨酸、0.1g/lL-亮氨酸、0.25g/lL-賴氨酸單鹽酸鹽、0.1g/lL-甲硫氨酸、0.2g/lL-苯丙氨酸、0.3g/lL-絲氨酸、0.2g/lL-蘇氨酸、0.1g/lL-色氨酸、0.05g/lL-酪氨酸、0.1g/lL-纈氨酸]中。使培養(yǎng)物在發(fā)酵罐(BelachBioteknik,BR20)中在37℃生長。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到0.75的在600nm(OD600)處的光密度時，將約2.6l的培養(yǎng)物使用10x摩爾過量的M13K07輔助噬菌體(NewEnglandBiolabs，目錄號N0315S)來感染。將細(xì)胞孵育持續(xù)30分鐘，屆時將發(fā)酵罐用補(bǔ)充有100μM異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)用于誘導(dǎo)表達(dá)和25μg/ml卡那霉素和12.5μg/ml羧芐青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉湯-酵母提取物；30g/lTSB、5g/l酵母提取物)填充至20l。使細(xì)胞在30℃生長持續(xù)22h并將培養(yǎng)物中的細(xì)胞通過以15,900g離心來沉淀。如在等，同上中描述的，將噬菌粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化鈉)中從上清液沉淀兩次，過濾并溶解在PBS和甘油中。使噬菌體儲備液在使用前貯存于-80℃。選擇程序和噬菌體儲備液制備基本上如WO2009/077175中針對另一種生物素化的靶的選擇所描述的來進(jìn)行。為了減少背景結(jié)合物(binders)的量，通過將噬菌體儲備液與SA-珠在RT孵育持續(xù)30分鐘進(jìn)行預(yù)選擇。用補(bǔ)充有5％BSA的PBS來預(yù)封閉在選擇中使用的所有管和珠。在補(bǔ)充有3％BSA和0.1％Tween20的PBS中在RT在2h的期間進(jìn)行選擇，然后使用1mg珠/1.6μg生物素化的hIL-6或mIL-6在M-280鏈霉親和素(SA-珠,Invitrogen,目錄號11206D)上捕獲靶-噬菌體復(fù)合體。將大腸桿菌菌株XL1-Blue(Agilenttechnologies,目錄號200268)用于噬菌體擴(kuò)增。在被劃分在四個不同的最終軌道中的四個循環(huán)中進(jìn)行針對生物素化的hIL-6和mIL-6的選擇：循環(huán)1中的軌道(1)被劃分在第二循環(huán)或第四循環(huán)中，導(dǎo)致在循環(huán)2中共3個軌道(1-1至1-3)，在循環(huán)3中3個軌道(1-1-1至1-3-1)，和在循環(huán)4中四個軌道(1-1-1-1至1-3-1-2)。在洗滌之后，使用500μl0.1M甘氨酸-HCl、pH2.2從選擇軌道洗脫結(jié)合的噬菌體，隨后立即用50μl1MTris-HCl、pH8.0和450μlPBS中和。在表2中顯示了選擇策略和使用的參數(shù)的概覽，描述了在選擇軌道中在降低的靶濃度和增加的洗滌次數(shù)方面的不同。表2：用于初始選擇的策略的概覽測序：使用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序和以下引物從單菌落擴(kuò)增PCR片段：AFFI-21(5’-tgcttccggctcgtatgttgtgtg；SEQIDNO:1557)和AFFI-22(5’-cggaaccagagccaccaccgg；SEQIDNO:1558)。使用生物素化的寡核苷酸AFFI-72(5’-生物素-cggaaccagagccaccaccgg；SEQIDNO:1559)和根據(jù)制造商的建議使用的Terminatorv3.1循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems)進(jìn)行擴(kuò)增的片段的測序。測序反應(yīng)物利用Magnatrix8000(MagneticBiosolution)儀器通過與磁性鏈霉親和素包被的珠(DetachStreptavidinBeads，Nordiag,目錄號2012-01)結(jié)合來純化，并在ABI3130xl遺傳分析儀(PEAppliedBiosystems)上分析。產(chǎn)生用于ELISA的Z變體：通過在深孔板(Nunc，目錄號278752)中將來自選擇的單菌落接種到補(bǔ)充有100μg/ml氨芐青霉素和0.1mMIPTG的1mlTSB-YE培養(yǎng)基中來產(chǎn)生測序的Z變體。將板在37℃孵育持續(xù)24小時。使細(xì)胞通過離心形成團(tuán)塊，在200μl的0.05％PBST(補(bǔ)充有0.05％Tween-20的PBS)中重懸，在-80℃冷凍并在水浴中解凍以釋放細(xì)胞的周質(zhì)級分。重復(fù)冷凍-解凍程序5次。將樣品用PBST0.05％稀釋至總共800μl并通過離心使細(xì)胞形成團(tuán)塊。周質(zhì)提取物的上清液包含作為與ABD的融合物的Z變體，表示為AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[ABD]-YVPG(等，同上)。Z#####是指單獨的58個氨基酸殘基Z變體。Z變體的ELISA分析：在ELISA測定中分析Z變體與IL-6的結(jié)合。在4℃用2μg/ml在包被緩沖液(50mM碳酸鈉，pH9.6；Sigma,目錄號C3041)中稀釋的抗ABD山羊抗體(內(nèi)部產(chǎn)生的)包被半?yún)^(qū)96孔ELISA板(Costar,目錄號3690)過夜。傾倒掉抗體溶液并在RT用100μl的PBSC(補(bǔ)充有0.5％酪蛋白的PBS；Sigma，目錄號C8654)封閉孔持續(xù)1.5小時。丟棄封閉溶液并將50μl周質(zhì)溶液添加到孔中并在RT在緩慢震蕩下孵育持續(xù)1.5h。傾倒掉上清液并用0.05％PBST洗滌孔4次。然后，將PBSC中的7.7nM濃度的50μl生物素化的hIL-6添加到每個孔中。將板在RT孵育持續(xù)1.5h，然后如以上描述的洗滌。將鏈霉親和素綴合的HRP(ThermoScientific，目錄號N100)在PBSC中1:30000稀釋并添加至孔，然后孵育45分鐘。如以上描述的洗滌后，將50μlImmunoPureTMB底物(ThermoScientific，目錄號34021)加入至孔中，并將板根據(jù)制造商的建議進(jìn)行處理。結(jié)合特定的不相關(guān)蛋白的Z變體通過針對該特定的不相關(guān)蛋白測定而被用作陽性對照，并且通過針對hIL-6測定而被用作陰性對照。作為空白對照，添加PBST0.05％，而非周質(zhì)樣品。使用多孔板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。結(jié)果IL-6結(jié)合Z變體的噬菌體展示選擇：在4個循環(huán)的針對生物素化的hIL-6和mIL-6的噬菌體展示選擇后，制備個體克隆。測序：對從第四輪選擇隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行測序。每個Z變體被賦予了唯一的標(biāo)識號#####且個體變體被稱為Z#####。58個殘基長Z變體的氨基酸序列在圖1中和序列表中被列為SEQIDNO:1503-1551。在每個序列中推斷的IL-6結(jié)合基序(BM)從位置8延伸到位置36。預(yù)測構(gòu)成這些Z變體的每個內(nèi)的完整三螺旋束的49個氨基酸殘基長多肽的氨基酸序列(BMod)從位置7延伸到位置55。Z變體的ELISA分析：在四個選擇循環(huán)之后獲得的克隆在96孔板中產(chǎn)生并在ELISA中針對hIL-6結(jié)合活性篩選。以相應(yīng)于至少3x陰性對照的信號給出響應(yīng)的所有克隆被認(rèn)為是陽性IL-6結(jié)合物。對不相關(guān)蛋白特異的對照分子給出針對特異性蛋白的陽性信號，然而針對hIL-6沒有獲得信號。實施例2IL-6結(jié)合Z變體的產(chǎn)生和體外表征在該實施例中，將Z變體的亞組亞克隆、產(chǎn)生并在競爭ELISA和細(xì)胞測定中進(jìn)行功能測定。分別應(yīng)用兩個不同的ELISA測定來研究IL-6結(jié)合Z變體是否能夠阻斷IL-6和IL-6Rα之間或IL-6和gp130受體之間的特異相互作用。利用分別模擬經(jīng)典順式信號傳導(dǎo)途徑和反式信號傳導(dǎo)途徑的兩個不同的細(xì)胞測定來測定Z變體多肽的效價。最后，對Z變體的亞組進(jìn)行圓二色性(CD)光譜學(xué)，以研究其二級結(jié)構(gòu)并確定其熔解溫度Tm。材料和方法Z變體的亞克隆:從文庫載體pAY02592擴(kuò)增以下13個IL-6結(jié)合Z變體的DNA：Z06777(SEQIDNO:1503)、Z06779(SEQIDNO:1504)、Z06789(SEQIDNO:1505)、Z06791(SEQIDNO:1506)、Z06792(SEQIDNO:1507)、Z06799(SEQIDNO:1508)、Z06802(SEQIDNO:1509)、Z06805(SEQIDNO:1510)、Z06809(SEQIDNO:1511)、Z06814(SEQIDNO:1512)、Z06829(SEQIDNO:1513)、Z06834(SEQIDNO:1514)、Z06844(SEQIDNO:1515)。利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(基本上如WO2009/077175中針對結(jié)合另一種靶的Z變體描述的)來應(yīng)用用于構(gòu)建具有N-末端His6標(biāo)簽的單體Z變體分子的亞克隆策略。將Z基因片段亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pAY01448，導(dǎo)致編碼序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。將五個IL-6結(jié)合Z變體的亞組Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829以及結(jié)合不相關(guān)靶的兩個對照Z變體Z03638(SEQIDNO:1552)和Z04726(SEQIDNO:1553)以與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)融合來亞克隆。由表達(dá)載體編碼的構(gòu)建體為MGSSLQ-[Z#####]-VDGS-PP013。培養(yǎng)和純化:用包含每個各自的IL-6結(jié)合Z變體的基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(Novagen)，并在37℃在800ml或1000ml補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在OD600＝2時，添加IPTG至0.2mM的終濃度并使培養(yǎng)物在37℃再孵育5小時。通過離心收獲細(xì)胞。具有His6-標(biāo)簽的IL-6結(jié)合Z變體的純化:在天然或變性條件下進(jìn)行蛋白純化。在天然條件下的純化如下進(jìn)行：將約2-5的每種細(xì)胞團(tuán)塊重懸在10mlPBS中。在通過聲處理破碎細(xì)胞后，通過離心移除細(xì)胞碎片，并將每種上清液應(yīng)用到用20ml洗滌緩沖液(46.6mMNa2HPO4、3.4mMNaH2PO4和300mMNaCl，pH7.0)平衡的2mlTalon鈷柱(Clontech,目錄號635504)上。通過用洗滌緩沖液洗滌移除污染物，并且然后用洗脫緩沖液(50mMNaH2PO4、100mMNaCl、30mMHAc和70mMNaAc，pH5.0)洗脫IL-6結(jié)合Z變體。在變性條件下的純化如下進(jìn)行：將約2-5g的每種細(xì)胞團(tuán)塊重懸在10ml裂解緩沖液(7M鹽酸胍、47mMNa2HPO4、2.65mMNaH2PO4、10mMTris-HCl、104mMNaCl，pH8.0)中，然后在37℃、150rpm孵育持續(xù)2h。如針對天然純化的進(jìn)行洗滌和洗脫步驟，只是使用不同的緩沖液(洗滌緩沖液：6M鹽酸胍、47mMNa2HPO4、3.4mMNaH2PO4、300mMNaCl，pH8.0；洗脫緩沖液：6M尿素、0.1MNaCl、29.6mMHAc、70.4mMNaAc和50mMNaH2PO4，pH5.0)。純化的Z變體根據(jù)制造商的方案使用PD-10柱(GEHealthcare)緩沖液交換為PBS。通過測量在280nm處的吸光度，使用各自蛋白的消光系數(shù)來確定蛋白濃度。IL-6結(jié)合Z變體的純度通過用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE來分析。與ABD融合的IL-6結(jié)合Z變體的純化:將約2.5g的每種細(xì)胞團(tuán)塊重懸于20ml補(bǔ)充有(Merck)的TST-緩沖液(25mMTris-HCl、1mMEDTA、200mMNaCl、0.05％Tween20,pH8.0)中。通過聲處理破碎細(xì)胞并通過離心澄清后，將每種上清液應(yīng)用至具有1ml抗ABD瓊脂糖的重力流柱上(WO2014/064237)。在用TST-緩沖液和5mMNH4AcpH5.5緩沖液洗滌之后，用0.1MHAc洗脫ABD融合的Z變體。利用PD-10柱(GEHealthcare)進(jìn)行對PBS(2.68mMKCl、137mMNaCl、1.47mMKH2PO4、8.1mMNa2HPO4，pH7.4)的緩沖液交換。然后，在1mlDetoxi-GelEndotoxinRemovingColumns(Pierce,目錄號20344)上純化ABD融合的Z變體以確保低的內(nèi)毒素含量。通過測量在280nm處的吸光度，使用各自蛋白的消光系數(shù)來確定蛋白濃度。通過用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE分析純度，并利用LC/MS分析來確認(rèn)每種純化的Z-ABD變體的身份。結(jié)合位點的分析：采用第一測定來評價IL-6結(jié)合Z變體對hIL-6和人IL-6Rα(hIL-6Rα)之間的相互作用的干擾。在該實驗中，用抗-IL-6R捕獲抗體(R&DSystems)以2μg/ml的濃度包被半?yún)^(qū)96孔ELISA板。將板在4℃孵育過夜并且然后在自來水中洗滌兩次。然后，在PBSC中將板封閉持續(xù)1h，并以250ng/ml的濃度添加hIL-6Rα(R&DSystems)。將板在RT孵育持續(xù)1.5h并且然后用200μl0.05％Tween/PBS洗滌4次。在單獨的板中，用2.5nM的生物素化的hIL-6滴定13種帶His6標(biāo)簽的Z變體多肽的系列稀釋物(濃度范圍500-0.5nM)。以相同的方式制備IL-6Rα抗體托珠單抗(Roche)并將其包括用于比較。然后將每種預(yù)混合的Z變體和生物素化的hIL-6的復(fù)合體轉(zhuǎn)移至含有hIL-6Rα的孔。將板再孵育持續(xù)1.5h并且然后洗滌4次。添加鏈霉親和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀釋物并將板孵育持續(xù)1h。將板用0.05％Tween/PBS洗滌最后4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持續(xù)15分鐘，然后用2MH2SO4終止反應(yīng)。利用微板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。采用第二測定來評價IL-6結(jié)合Z變體對人gp130(hgp130)和hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體之間的相互作用的干擾。在該實驗中，用Fc融合的hgp130(hgp130-Fc)以4μg/ml的濃度包被半?yún)^(qū)96孔ELISA板。將板在4℃孵育過夜并且然后在自來水中洗滌兩次。然后，將板在PBSC中封閉持續(xù)1h。將板在RT孵育持續(xù)1.5h并且然后用200μl0.05％Tween/PBS洗滌4次。在單獨的板中，用固定的hIL-6/hIL-6Rα濃度(分別0.5nM和5nM)滴定13種帶His6標(biāo)簽的Z變體多肽的系列稀釋物(濃度范圍500-0.5nM)。以相同的方式制備IL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗(Roche)并將其包括用于比較。然后將預(yù)混合的每種Z變體多肽和hIL-6/hIL-6Rα的復(fù)合體轉(zhuǎn)移至含有hgp130的孔。將板孵育持續(xù)1.5h并且然后洗滌4次。添加生物素化的抗IL-6Rα抗體(R&DSystems)并將板再孵育1.5h,然后洗滌。添加鏈霉親和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀釋物并將板孵育持續(xù)1h。然后，將板洗滌4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持續(xù)15分鐘，然后用2MH2SO4終止反應(yīng)。利用微板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。體外中和測定：評價經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑的第一測定使用響應(yīng)于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1細(xì)胞系。在補(bǔ)充有10％FCS(Gibco)、Pen-Strep(Lonza)和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems)的具有L-glut(Lonza)的RPMI1640中培養(yǎng)TF-1細(xì)胞。在使用前，將細(xì)胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI1640中洗滌兩次。然后對細(xì)胞計數(shù)，并以4x104個細(xì)胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在單獨的板中，在0.099nMrhIL-6(R&DSystems,UK)的存在下孵育抑制化合物(IL-6結(jié)合Z變體，具有His6標(biāo)簽(濃度范圍1000-0.1nM)或與ABD變體PP013融合(SEQIDNO:1554；濃度范圍200-0.007nM))和IL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗(Roche；濃度范圍200-0.007nM)。另外，在有或無9μMrhHSA(Novozymes)下孵育ABD融合的變體。然后將預(yù)混合的Z變體多肽和hIL-6的復(fù)合體轉(zhuǎn)移至含有TF-1細(xì)胞的孔，所述含有TF-1細(xì)胞的孔在加濕的5％CO2氣氛中在37℃被孵育了持續(xù)72h。在孵育的最后4個小時期間，每孔添加10μl的CCK-8(Fluka,SigmaAldrich)以確定增殖細(xì)胞的數(shù)目。利用微板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。通過對四參數(shù)劑量響應(yīng)曲線的非線性回歸來評價關(guān)于細(xì)胞生長的數(shù)據(jù)，并利用GraphPadPrism程序確定半最大抑制濃度(IC50)。TF-1細(xì)胞的IL-6依賴性增殖被抑制分子的抑制為Abs450減去含有細(xì)胞但不含hIL-6的對照孔。為了解決反式信號傳導(dǎo)途徑，使用第二測定。在本文中，用hIL-6和可溶性hIL-6Rα刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，并且讀取為單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的產(chǎn)生。使HUVEC(Lonza)在EGM-2bulletkit培養(yǎng)基(Lonza)中生長，并在培養(yǎng)物中傳代不超過8次。在使用前，使細(xì)胞生長直至75％匯合。將細(xì)胞使用胰蛋白酶/EDTA(Lonza)分離，重懸并在新鮮的培養(yǎng)基中洗滌一次。然后，對細(xì)胞計數(shù)，并以2x104個細(xì)胞/孔的密度分配到96孔平底板中。在37℃在加濕的5％CO2氣氛中培養(yǎng)細(xì)胞過夜。在單獨的板中，在重組hIL-6(10ng/ml；0.5nM)和200ng/ml(5.6nM)的固定濃度的可溶性hIL-6Rα的存在下，在具有或不具有9μMrhHSA(Novozymes)下，孵育與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)融合的IL-6結(jié)合Z變體Z06789、Z06799、Z06809、Z06814和Z06829，結(jié)合不同的靶的PP013融合的陰性對照Z03638(SEQIDNO:1552)，以及托珠單抗(Roche)的系列稀釋物(200-0.003nM)。然后將具有測試分子和hIL-6/hIL-6Rα的預(yù)混合溶液轉(zhuǎn)移至含有HUVEC的孔，所述含有HUVEC的孔在37℃在加濕的5％CO2氣氛中被孵育了持續(xù)24h。在孵育時期后收集無細(xì)胞的上清液并利用MCP-1DuosetELISA開發(fā)系統(tǒng)(R&DSystems)通過夾心ELISA確定人MCP-1水平。MCP-1ELISA:用抗MCP-1捕獲抗體(R&DSystems)以1μg/ml的濃度包被半?yún)^(qū)96孔ELISA板。將板在4℃孵育過夜，在自來水中洗滌兩次并在PBSC中封閉持續(xù)1h。然后將板用4x200μl0.05％Tween/PBS洗滌4次，然后添加標(biāo)準(zhǔn)物和樣品。將板在RT孵育持續(xù)2h，洗滌，然后添加0.1μg/ml生物素化的抗MCP-1抗體(R&DSystems)。然后，將板再孵育持續(xù)1.5h然后洗滌4次。然后，添加鏈霉親和素-HRP(ThermoScientific)的1:8000稀釋物并將板孵育持續(xù)1h。將板洗滌最后4次，并添加TMB底物(ThermoScientific)持續(xù)20分鐘，然后用2MH2SO4終止反應(yīng)。利用微板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。CD分析：將純化的帶His6標(biāo)簽的Z變體的亞組在PBS中稀釋至0.5mg/ml。對于每個稀釋的Z變體，在20℃獲取在250-195nm處的CD光譜。另外，進(jìn)行可變溫度測量(VTM)以確定熔解溫度(Tm)。在VTM中，在221nm處測量吸光度，同時將溫度以5℃/min的溫度斜率從20℃提高至90℃。在JascoJ-810分光偏振計(JascoScandinaviaAB)上使用具有1mm的光路長度的比色皿進(jìn)行CD測量。結(jié)果培養(yǎng)和純化:在大腸桿菌中產(chǎn)生13種被構(gòu)建帶有N-末端His6標(biāo)簽的IL-6結(jié)合Z變體(SEQIDNO:1503-1515)。對于不同的IL-6結(jié)合Z變體，通過用分光光度計在280nm處測量吸光度而確定的來自約2-5g細(xì)菌團(tuán)塊的IMAC-純化的蛋白的量的范圍從約10mg至20mg。從與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)融合的5種Z變體的約2.5g細(xì)胞團(tuán)塊獲取2mg至12mg。每種最終蛋白制備物的SDS-PAGE分析顯示，這些制備物主要包含IL-6結(jié)合Z變體。每種IL-6結(jié)合Z變體的正確身份和分子量通過HPLC-MS分析來證實。結(jié)合位點的分析：在兩個單獨的競爭ELISA實驗中研究13種測試的帶His6標(biāo)簽的IL-6結(jié)合Z變體阻斷(i)hIL-6和hIL-6Rα之間或(ii)hgp130和預(yù)先形成的hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體之間的相互作用的能力。當(dāng)針對阻斷hIL-6/hIL-6Rα相互作用測試時，13種Z變體均未顯示出任何顯著的影響。但是，所有的Z變體顯示出預(yù)先形成的hIL-6/hIL-6Rα和hgp130之間的相互作用，即反式信號傳導(dǎo)類似相互作用的清楚的濃度依賴性阻斷(圖3)。對于每種Z變體計算的IC50值被顯示于表3中。被包括用于比較的抗體托珠單抗在兩個實驗中均顯示出阻斷效應(yīng)。表3：初始Z變體阻斷hIL-6/hIL-6Rα與hgp130的相互作用的IC50值體外中和測定：利用兩種不同的細(xì)胞測定來分別研究IL-6結(jié)合Z變體阻斷經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑和反式信號傳導(dǎo)途徑中的IL-6依賴性信號傳導(dǎo)的能力。評價經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑的第一測定采用響應(yīng)于人IL-6、TNF和GM-CSF而增殖的TF-1細(xì)胞系。IL-6到與被稱為gp130的信號傳導(dǎo)受體亞單位連接的細(xì)胞表面IL-6受體的直接信號傳導(dǎo)被稱為順式信號傳導(dǎo)。該測定顯示所有13種變體都能夠阻斷TF-1細(xì)胞的IL-6依賴性生長。對于帶His6標(biāo)簽的Z變體和與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)重組地融合的Z變體，以及對于被包括用于比較的IL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗計算的IC50值被顯示于表4中。表4：初始Z變體阻斷TF-1細(xì)胞的IL-6依賴性生長的IC50值為了研究在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中反式信號傳導(dǎo)途徑是否也能被阻斷，使用表達(dá)gp130的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行第二測定。將HUVEC與預(yù)先形成的hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體一起孵育導(dǎo)致單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的IL-6反式信號傳導(dǎo)依賴性分泌，允許IL-6結(jié)合Z變體的任何反式信號傳導(dǎo)阻斷能力的分析。在該測定中，在HSA的存在下分析與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)重組地融合的5種Z變體。hIL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗被包括用于比較。所有5種研究的Z變體都顯示出抑制反式信號傳導(dǎo)(圖4)。一種變體Z06814-ABD顯示出比托珠單抗更強(qiáng)有力，并且與托珠單抗的5nM相比，表現(xiàn)出約1nM的IC50值。CD分析：對于7種Z變體的CD光譜顯示，每種變體在20℃具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過可變溫度測量確定的熔解溫度(Tm)被顯示于表5中。表5：選擇的Z變體的熔解溫度實施例3IL-6結(jié)合Z變體的第一成熟文庫的設(shè)計和構(gòu)建在該實施例中，構(gòu)建了成熟文庫。使用該文庫選擇新的IL-6結(jié)合Z變體。來自成熟文庫的選擇通常被預(yù)期產(chǎn)生具有增強(qiáng)的親和力的結(jié)合物(Orlova等，(2006)CancerRes66(8):4339-48)。在本研究中，使用裂池合成(split-poolsynthesis)來生成隨機(jī)化的單鏈接頭，使得能夠?qū)⒍x的密碼子在合成中摻入期望的位置中。材料和方法文庫設(shè)計：文庫基于在實施例1和2中描述的選擇的IL-6結(jié)合Z變體的序列。在新的文庫中，根據(jù)基于SEQIDNO:1503-1551定義的Z變體序列的策略，使Z分子支架中的12個可變位置向某些氨基酸殘基偏倚并使一個位置保持恒定。利用裂池合成生成147bp的DNA接頭，所述接頭編碼Z變體氨基端序列的部分地隨機(jī)的螺旋1和2。因此，側(cè)翼為限制性位點XhoI和SacI的5’-AAATAAATCTCGAGGTAGATGCCAAATACGCCAAAGAANNNNNNNNNGCGTGGNNNGAGATCNNNNNNCTGCCTAACCTCACCNNNNNNCAANNNNNNGCCTTCATCNNNAAATTANNNGATGACCCAAGCCAGAGCTCATTATTTA-3’(SEQIDNO:1560；隨機(jī)密碼子表示為NNN)從DNA2.0(MenloPark,CA,USA)訂購。氨基酸殘基在包括Z分子支架中的12個可變Z位置(9、10、11、14、17、18、24、25、27、28、32和35)的新文庫中的理論分布在表6中給出。得到的理論文庫大小為3.6x109個變體。表6：文庫設(shè)計，第一成熟文庫構(gòu)建：使用AmpliTaqGold聚合酶(AppliedBiosystems，目錄號4311816)根據(jù)供應(yīng)商的建議在12個循環(huán)的PCR期間擴(kuò)增文庫，并用QIAquickPCR純化試劑盒(QIAGEN，目錄號28106)根據(jù)供應(yīng)商的建議純化混合的產(chǎn)物。隨機(jī)化文庫片段的純化的混合物(pool)用限制性內(nèi)切酶XhoI和SacI-HF(NewEnglandBiolabs，目錄號R0146L，和目錄號R3156M)來消化，并使用PCR純化試劑盒(Qiagen,目錄號28106)來濃縮。隨后，根據(jù)供應(yīng)商的建議使產(chǎn)物在制備性2.5％瓊脂糖凝膠(NuisieveGTC瓊脂糖，Cambrex，Invitrogen)上泳動并使用QIAGEN凝膠提取試劑盒(QIAGEN，目錄號28706)純化。噬菌粒載體pAY02592(基本上如等，同上中描述的pAffi1)用相同酶限制性內(nèi)切，并使用苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀來純化。將限制性片段和載體以5:1的摩爾比率用T4DNA連接酶(Fermentas,目錄號EL0011)在RT連接持續(xù)2h，然后在4℃孵育過夜。通過苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀回收連接的DNA，然后在10mMTris-HCl，pH8.5中溶解。因此，所得的在載體pAY02592中的文庫編碼Z變體，每個Z變體與源自鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合域(ABD)融合。連接反應(yīng)(約160ngDNA/轉(zhuǎn)化)被電穿孔進(jìn)入電感受態(tài)大腸桿菌ER2738細(xì)胞(50μl，Lucigen，Middleton，WI，USA)。緊接在電穿孔之后，加入約1ml的恢復(fù)培養(yǎng)基(供給ER2738細(xì)胞)。在37℃孵育轉(zhuǎn)化的細(xì)胞持續(xù)60分鐘。取出樣品用于滴定并用于確定轉(zhuǎn)化株的數(shù)目。然后，將細(xì)胞匯集并在37℃在1l的補(bǔ)充有2％葡萄糖、10μg/ml四環(huán)素和100μg/ml氨芐青霉素的TSB-YE培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。以4,000g持續(xù)7分鐘使細(xì)胞成為團(tuán)塊并重懸于PBS/甘油溶液(約40％甘油)中，等分并儲存在-80℃。對來自Z變體的文庫的克隆進(jìn)行測序，以驗證內(nèi)含物并且以評價所構(gòu)建文庫與該文庫設(shè)計相比的結(jié)果。如實施例1中描述的進(jìn)行測序，并驗證氨基酸分布。噬菌體儲備液的制備：在20l發(fā)酵罐(BelachBioteknik)中制備包含噬菌粒文庫的噬菌體儲備液。將來自包含該噬菌粒文庫的甘油儲備液的細(xì)胞接種于10l的補(bǔ)充有1g/l葡萄糖、100mg/l氨芐青霉素和10mg/l四環(huán)素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉湯-酵母提取物；30g/lTSB、5g/l酵母提取物)中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到0.64的在600nm處的光密度(OD600)時，使用5x摩爾過量的M13K07輔助噬菌體感染約1.1l的培養(yǎng)物。將細(xì)胞孵育30分鐘，屆時用復(fù)合發(fā)酵培養(yǎng)基[2.5g/l(NH4)2SO4；5.0g/l酵母提取物；30g/l胰蛋白胨、2g/lK2HPO4，3g/lKH2PO4，1.25g/l；Na3C6H5O7·2H2O；BreoxFMT30消泡劑0.1ml/l]填充發(fā)酵罐直至10l。添加以下組分：10ml羧芐青霉素25mg/ml；5ml卡那霉素50mg/ml；1ml1M異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)；17.5ml/l的300g/lMgSO4和5ml的微量元素溶液[35g/lFeCl3·6H2O；10.56g/lZnSO4·7H2O；2.64g/lCuSO4·5H2O；13.2g/lMnSO4·H2O；13.84g/lCaCl2·2H2O，溶解于1.2MHCl]。開始葡萄糖限制的補(bǔ)料分批培養(yǎng)，其中將600g/l葡萄糖溶液補(bǔ)料到反應(yīng)器(開始時3.5g/h，20h后37.5g/h并且直到培養(yǎng)結(jié)束)。通過自動添加25％NH4OH使pH被控制在pH7。補(bǔ)充空氣(5l/min)并將攪拌器設(shè)置為500rpm。補(bǔ)料分批培養(yǎng)24h后，OD600為22。通過以15,900g離心使培養(yǎng)物中的細(xì)胞成團(tuán)。如實施例1中描述的，使噬菌體顆粒在PEG/NaCl中從上清液沉淀2次，過濾并溶解于PBS和甘油中。將噬菌體儲備液貯存于-80℃，直到在選擇中使用。結(jié)果文庫構(gòu)建：基于具有被證實的結(jié)合特性的一組IL-6結(jié)合Z變體(實施例1和2)來設(shè)計新文庫。設(shè)計的文庫的理論大小為3.6x109種Z變體。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ER2738細(xì)胞后通過滴定確定的文庫的實際大小為3.5x109種轉(zhuǎn)化株。文庫質(zhì)量通過測序192種轉(zhuǎn)化株和通過將它們的實際序列與理論設(shè)計比較來測試。與設(shè)計的文庫比較，實際文庫的內(nèi)容物顯示是令人滿意的。因此成功構(gòu)建了IL-6的潛在結(jié)合物的成熟文庫。實施例4來自第一成熟文庫的Z變體的選擇、篩選和表征材料和方法成熟的IL-6結(jié)合Z變體的噬菌體展示選擇：如實施例1中描述的使靶蛋白hIL-6(R&DSystems,目錄號206-IL/CF)和mIL-6(Abnova,目錄號P4346Il6)生物素化。使用如實施例3中描述的Z變體分子的新的文庫，在基本上如實施例1中描述但有以下例外的針對hIL-6和mIL-6的四個循環(huán)中進(jìn)行噬菌體展示選擇。在選擇時，分別將胎牛血清(FCS,Gibco,目錄號10108-165)和人血清白蛋白(HSA,Albucult,Novozymes,目錄號230-005)添加至選擇緩沖液至10％和1.5μM的最終濃度。用補(bǔ)充有3％BSA的PBS0.1％預(yù)封閉在選擇中使用的所有管和珠。在循環(huán)1A中，通過將噬菌體儲備液與SA-珠一起孵育進(jìn)行預(yù)選擇步驟。對于所有軌道，在循環(huán)1中，選擇體積為2ml。為了捕獲噬菌體-靶復(fù)合體，每4μg生物素化的hIL-6或mIL-6使用1mg珠。循環(huán)1中的六個軌道(1-6)被劃分在第二循環(huán)或第三循環(huán)，導(dǎo)致在循環(huán)2中共七個軌道(1-1至6-2)，在循環(huán)3中共十二個軌道(1-1-1至6-2-1)，以及在循環(huán)4中共十二個軌道(1-1-1-1至6-2-1-1)。使用以下兩種不同程序洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒：1)500μl0.1M甘氨酸-HCl，pH2.2，隨后立即用50μl1MTris-HCl，pH8.0，和450μlPBS中和，或2)500μl的100mM磷酸鈉和150mM氯化鈉，pH5.5并用500μlPBS中和。在表7中顯示了選擇策略的概覽，描述了在隨后的循環(huán)中通過使用降低的靶濃度和增加的洗滌次數(shù)獲得的增加的嚴(yán)格性。表7：用于第一成熟的選擇策略的概覽噬菌體顆粒的擴(kuò)增：選擇循環(huán)1和2之間的噬菌體顆粒的擴(kuò)增基本如實施例1中描述的進(jìn)行，具有以下例外。使用大腸桿菌ER2738用于噬菌體擴(kuò)增，且以5x過量使用M13K07輔助噬菌體。選擇循環(huán)2和4之間的噬菌體顆粒的擴(kuò)增如下通過在溶液中進(jìn)行細(xì)菌感染完成。在用噬菌體顆粒感染對數(shù)生長期大腸桿菌ER2738后，加入補(bǔ)充有2％葡萄糖、10μg/ml四環(huán)素和100μg/ml氨芐青霉素的TSB，隨后在37℃伴隨旋轉(zhuǎn)孵育持續(xù)30min。此后，用M13K07輔助噬菌體感染細(xì)菌。將感染的細(xì)菌通過離心成團(tuán)，重懸于補(bǔ)充有100μMIPTG、25μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨芐霉素的TSB-YE培養(yǎng)基中并在30℃生長過夜。將過夜培養(yǎng)物離心并將上清液中的噬菌體顆粒用PEG/NaCl緩沖液沉淀兩次。最后，將噬菌體顆粒重懸于選擇緩沖液，然后進(jìn)入下一個選擇循環(huán)。在最后的選擇循環(huán)中，將對數(shù)生長期細(xì)菌用洗脫物感染，并稀釋，然后涂布在補(bǔ)充有0.2g/l氨芐青霉素的TBAB平板(30g/l胰蛋白胨血瓊脂基，Oxoid目錄號CMO233B)上以形成用于ELISA篩選的單菌落。潛在結(jié)合物的測序：挑取來自不同的選擇軌道的個體克隆用于測序。對ELISA篩選中運行的所有克隆進(jìn)行測序?；旧先鐚嵤├?中描述的進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增和基因片段的序列分析。Z變體的ELISA篩選：從IL-6成熟文庫的選擇的克隆隨機(jī)挑取包含Z變體(被表達(dá)為Z變體ABD融合蛋白)的單菌落，并如實施例1中描述的培養(yǎng)。如在實施例1中的進(jìn)行周質(zhì)上清液的制備，但以6個冷凍解凍循環(huán)。使用0.58nM濃度的生物素化的hIL-6，基本上如實施例1中描述的進(jìn)行ELISA篩選。初始IL-6結(jié)合物Z06814的周質(zhì)級分被用作陽性對照。通過使用只含有ABD的周質(zhì)產(chǎn)生陰性對照。人IL-6結(jié)合物的ELISAEC50分析：使選擇的IL-6結(jié)合物經(jīng)歷如以上描述的利用ELISA分析對生物素化的hIL-6的系列稀釋物的響應(yīng)。以25nM的濃度加入生物素化的蛋白，并且以1:3逐步稀釋直到11pM。還在不添加靶蛋白下測定所有Z變體作為背景對照。包含初始IL-6結(jié)合物Z06814(SEQID.NO:1512)的周質(zhì)樣品作為陽性對照被包括和分析。作為陰性對照，僅含有ABD的周質(zhì)被針對生物素化的hIL-6測定。使源自針對mIL-6的選擇的兩種結(jié)合物Z11612(SEQIDNO:151)和Z11616(SEQIDNO:152)如以上描述的經(jīng)歷利用ELISA分析對生物素化的mIL-6的系列稀釋物的響應(yīng)。以227nM的濃度加入生物素化的蛋白，并以1:3逐步稀釋直到104pM。利用GraphPadPrism5和非線性回歸分析得到的值。結(jié)果成熟的IL-6結(jié)合Z變體的噬菌體展示選擇：在各自包含4個循環(huán)的共12個平行軌道中進(jìn)行選擇。不同的選擇軌道在靶濃度、靶類型(hIL-6或mIL-6)、選擇時間、洗滌條件和洗脫緩沖液的pH方面不同。測序：對隨機(jī)挑取的克隆測序。如實施例1中描述的，每個個體Z變體被給予識別號碼Z#####?？傆嬭b定出809種新的獨特的Z變體分子。58個殘基長Z變體的氨基酸序列在圖1和序列表中被列為SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871。在每個序列中，推測的IL-6結(jié)合基序(BM)從位置8延伸至位置36。預(yù)測構(gòu)成這些Z變體的每個內(nèi)的完整三螺旋束(BMod)的49個氨基酸殘基長多肽的氨基酸序列從位置7延伸到位置55。Z變體的ELISA篩選：在四個選擇循環(huán)之后獲得的克隆在96孔板中產(chǎn)生并利用ELISA針對hIL-6結(jié)合活性篩選。對所有隨機(jī)挑取的克隆分析。發(fā)現(xiàn)809種獨特的Z變體中的796種針對0.58nM濃度的hIL-6給出3x陰性對照或更高(0.3-2.1AU)的響應(yīng)。來自使用hIL-6作為選擇靶的所有選擇軌道的克隆顯示出陽性信號。陰性對照具有0.078-0.102AU的吸光度。板的代表性組的空白對照的平均響應(yīng)為0.087AU。IL-6結(jié)合物的ELISAEC50分析：Z變體的亞組基于以上描述的ELISA實驗中的結(jié)果(分別對每個板上的陽性對照歸一化的最高ELISA值)來選擇，并以ELISA格式經(jīng)歷靶滴定。使周質(zhì)樣品與生物素化的hIL-6或mIL-6的系列稀釋物一起孵育。還針對hIL-6測定具有初始結(jié)合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周質(zhì)樣品作為陽性對照。分析獲得的值并計算它們的各自EC50值(表8和9)。表8：針對hIL-6的計算的EC50值表9：針對mIL-6的計算的EC50值實施例5IL-6結(jié)合Z變體的第二成熟文庫的設(shè)計和構(gòu)建在該實施例中,基本上如實施例4中描述的構(gòu)建第二成熟文庫。使用該文庫選擇IL-6結(jié)合Z變體。材料和方法文庫設(shè)計：文庫主要基于在實施例4中描述的選擇的人IL-6結(jié)合Z變體的序列。在新的文庫中，根據(jù)主要基于來自第一成熟的Z變體，即SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871定義的序列的策略，使Z分子支架中的13個可變位置向某些氨基酸殘基偏倚。通過ColibraTM技術(shù)產(chǎn)生隨機(jī)化雙鏈接頭，ColibraTM技術(shù)利用連接和隨后建立的雙鏈DNA的限制性酶切使得能夠摻入隨機(jī)化三核苷酸構(gòu)造塊組。側(cè)翼為限制性位點XhoI和SacI，編碼Z變體氨基酸序列的部分地隨機(jī)化的螺旋1和2的雙鏈DNA5’-AAATAAATCTCGAGGTAGATGCCAAATACGCCAAAGAANNNNNNNNNGCTNNNNNNGAGATCNNNNNNCTGCCGAACCTGACCNNNNNNCAGNNNNNNGCCTTCATCNNNAAATTANNNGATGACCCAAGCCAGAGCTCATTATTTA-3’(SEQIDNO:1561；隨機(jī)化密碼子表示為NNN)的文庫購自Isogenica(Essex,UK)。在表10中給出了新的文庫中氨基酸殘基的理論分布，包括Z分子支架中的八個可變氨基酸位置(10、11、14、18、24、25、27和32)和五個恒定氨基酸位置(9、13、17、28和35)。得到的理論文庫大小為2.6x107個變體。文庫構(gòu)建和噬菌體儲備液制備：基本上如實施例3中描述的構(gòu)建文庫。如實施例3中描述的制備文庫的噬菌體儲備液表10：文庫設(shè)計，第二成熟結(jié)果文庫構(gòu)建和噬菌體儲備液制備：基于具有被證實的結(jié)合特性的一組IL-6結(jié)合Z變體(實施例4)來設(shè)計新文庫。設(shè)計的文庫的理論大小為2.6x107種Z變體。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ER2738細(xì)胞后通過滴定確定的文庫的實際大小為1.8x109種轉(zhuǎn)化株。文庫質(zhì)量通過測序192種轉(zhuǎn)化株和通過將它們的實際序列與理論設(shè)計比較來測試。與理論文庫比較，實際文庫的內(nèi)容物顯示是令人滿意的。因此成功構(gòu)建了IL-6的潛在結(jié)合物的成熟文庫。實施例6來自第二成熟文庫的Z變體的選擇、篩選和表征材料和方法成熟的IL-6結(jié)合Z變體的第二噬菌體展示選擇：如實施例4中描述的將靶蛋白hIL-6生物素化。使用實施例5中描述的Z變體分子的第二成熟文庫，基本上如實施例4中描述的針對hIL-6進(jìn)行噬菌體展示選擇，但有以下例外。對于所有軌道，在循環(huán)1中，選擇體積為4ml。在循環(huán)2中，選擇軌道1-2和1-3在一個共同的管中處理并且不被分離，直到在最后的1min洗滌后，屆時它們被分別處理。同樣，在循環(huán)4中，每組選擇軌道1-1-1-1至1-1-1-3、1-1-1-4至1-1-1-6、1-1-2-1至1-1-2-3以及1-1-2-4至1-1-2-6分別在共同的管中處理并在最后的1min洗滌后分至三個單獨的管中，并且然后分別利用表11中概括的不用洗滌策略處理。如實施例1中描述的，使用甘氨酸-HCl、pH2.2洗脫結(jié)合的噬菌體顆粒。基本上如實施例1中描述的進(jìn)行在選擇循環(huán)之間的噬菌體顆粒的擴(kuò)增。在表11中顯示了選擇策略和使用的參數(shù)的概覽，描述了在選擇軌道中在降低的靶濃度和增加的洗滌次數(shù)方面的不同。潛在結(jié)合物的測序：挑取來自不同的選擇軌道的個體克隆用于測序。對經(jīng)歷ELISA篩選的所有克隆測序?；救鐚嵤├?中描述的進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增和基因片段的序列分析。Z變體的ELISA篩選：從IL-6第二成熟文庫的所選克隆隨機(jī)挑取包含Z變體(如在實施例1中描述的被表達(dá)為Z變體ABD融合蛋白)的單菌落，并如實施例1中描述的培養(yǎng)。基本上如實施例1中描述的進(jìn)行周質(zhì)上清液的制備和ELISA篩選，并在150μlPBST0.05％中進(jìn)行冷凍解凍并重復(fù)8次。以0.25nM的濃度使用生物素化的hIL-6。在每個ELISA板上，以一式兩份使用IL-6結(jié)合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周質(zhì)級分作為陽性對照。作為陰性對照，針對生物素化的hIL-6測定僅含有ABD的周質(zhì)。表11：用于第二成熟的選擇策略的概覽IL-6結(jié)合物的ELISAEC50分析：使選擇的IL-6結(jié)合物經(jīng)歷如在實施例2中描述的利用ELISA分析對生物素化的hIL-6的系列稀釋物的響應(yīng)。以5nM的濃度加入生物素化的蛋白，并以1:3逐步稀釋直到83fM。作為背景對照，還在不加入靶蛋白下測定所有Z變體。含有初始IL-6結(jié)合Z06814(SEQIDNO:1512)以及成熟結(jié)合物Z11632(SEQIDNO:7)的周質(zhì)樣品被包括作為陽性對照。作為陰性對照，針對生物素化的hIL-6測定僅含有ABD的周質(zhì)。利用GraphPadPrism5和非線性回歸分析得到的值。結(jié)果成熟的IL-6結(jié)合Z變體的第二噬菌體展示選擇：在總共17個平行的軌道中進(jìn)行選擇，每個軌道含有四個循環(huán)。如表11中概述的，選擇軌道在靶濃度、選擇時間和洗滌條件方面不同。潛在結(jié)合物的測序：對隨機(jī)挑取的克隆測序。每個個體Z變體如實施例1中描述的被給予識別號碼Z#####?？傆嬭b定出707種新的獨特的Z變體分子。58個殘基長Z變體的氨基酸序列在圖1和序列表中被列為SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502。在每個序列中，推測的IL-6結(jié)合基序(BM)從位置8延伸至位置36。預(yù)測構(gòu)成這些Z變體的每個內(nèi)的完整三螺旋束(BMod)的49個氨基酸殘基長多肽的氨基酸序列從位置7延伸到位置55。Z變體的ELISA篩選：在四個選擇循環(huán)之后獲得的克隆在96孔板中產(chǎn)生并利用ELISA針對人IL-6結(jié)合活性篩選。對所有隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)707種獨特的Z變體中的705種針對0.25nM濃度的hIL-6給出3x陰性對照或更高(0.3-2.3AU)的響應(yīng)。源自所有選擇軌道的克隆都顯示出陽性信號。板上的陰性對照的平均響應(yīng)為0.085AU。IL-6結(jié)合物的ELISAEC50分析：基于以上描述的ELISA實驗中的結(jié)果選擇Z變體的亞組。使表現(xiàn)出超過1.6AU的吸光度或在將響應(yīng)針對每個板上的一式兩份的陽性對照Z06814(SEQIDNO:1512)的平均響應(yīng)歸一化之后超過1.7的響應(yīng)的所有Z變體經(jīng)歷如實施例4中描述的ELISA格式的靶滴定。具有成熟結(jié)合物Z11632(SEQIDNO:7)以及初始結(jié)合物Z06814(SEQIDNO:1512)的周質(zhì)樣品也被測定作為陽性對照。分析獲得的值并計算它們的各自EC50值(表12)。表12：從來自第二成熟的Z變體以及陽性對照Z06814和Z11632的ELISA滴定分析計算的EC50值實施例7IL-6結(jié)合Z變體的亞組的亞克隆、產(chǎn)生和表征在該實施例中，產(chǎn)生親和力成熟的IL-6結(jié)合Z變體的亞組并通過SPR、ELISA、基于細(xì)胞的測定和CD來功能測定。SPR被用來測量Z變體與IL-6相互作用的動力學(xué)參數(shù)。競爭ELISA被用來研究Z變體與人IL-6蛋白的結(jié)合模式?；赥F-1細(xì)胞的測定被用來測定Z變體阻斷IL-6依賴性信號傳導(dǎo)的能力。CD被用來研究Z變體的二級結(jié)構(gòu)并確定它們的熔解溫度。材料和方法將Z變體亞克隆進(jìn)表達(dá)載體：從文庫載體pAY02592擴(kuò)增以下14種IL-6結(jié)合Z變體的DNA：Z11632(SEQIDNO:7)、Z14630(SEQIDNO:6)、Z14700(SEQIDNO:8)、Z14712(SEQIDNO:9)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z14862(SEQIDNO:10)、Z14976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)、Z15036(SEQIDNO:11)、Z15110(SEQIDNO:12)、Z15122(SEQIDNO:3)、Z15126(SEQIDNO:13)和Z15142(SEQIDNO:14)。如實施例2中描述的進(jìn)行亞克隆。將Z基因片段亞克隆進(jìn)表達(dá)載體pAY01448，導(dǎo)致編碼序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####]-VD。蛋白表達(dá)和在變性條件下的純化：用包含每個各自的IL-6結(jié)合Z變體的基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta細(xì)胞(Novagen)，并在37℃在100ml補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的TSB-YE培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在OD600＝2時，通過以1mM的終濃度加入IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)，并使培養(yǎng)物在25℃孵育另外的16-20h。通過離心收獲細(xì)胞。在基本上如實施例2中描述的變性條件下進(jìn)行蛋白純化。通過測量在280nm處的吸光度，使用各自蛋白的消光系數(shù)來確定蛋白濃度。IL-6結(jié)合Z變體的純度通過用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE來分析。蛋白表達(dá)和在變性條件下的純化：用含有成熟變體Z11632(SEQIDNO:7)、Z14630(SEQIDNO:6)、Z14700(SEQIDNO:8)、Z14712(SEQIDNO:9)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z14862(SEQIDNO:10)、Z14976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)、Z15036(SEQIDNO:11)、Z15110(SEQIDNO:12)、Z15122(SEQIDNO:3)、Z15142(SEQIDNO:14)的基因片段、初始Z變體Z06814(SEQIDNO:1512)的基因片段以及對照Z變體Z04726(SEQIDNO:1553)的基因片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞(NEB,目錄號C2527I)。在37℃在1000ml補(bǔ)充有50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞。為了誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在OD600＝0.8時添加IPTG至0.1mM的最終濃度，并在25℃孵育培養(yǎng)物持續(xù)17h。通過在4℃和8000rpm離心持續(xù)30min收獲細(xì)胞。丟棄上清液并在10mlPBS中重懸細(xì)胞團(tuán)塊。在通過聲處理破碎細(xì)胞后，通過離心移除細(xì)胞碎片，并將每種上清液應(yīng)用到用20ml洗滌緩沖液(20mMNaH2PO4、10mMNaCl、20mM咪唑，pH6.0)平衡的2mlNi-NTA柱(QIAGEN,目錄號30410)上。通過用洗滌緩沖液洗滌移除污染物，并用洗脫緩沖液(20mMNaH2PO4、10mMNaCl、250mM咪唑，pH6.0)洗脫Z變體。使洗脫液在離子交換柱(LifeTechnologies,目錄號4481317)上經(jīng)歷純化，并通過增加鹽濃度洗脫Z變體。然后使用VIVASPIN6柱(Sartorius,目錄號VS0691)使洗脫液的緩沖溶液對PBS(10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4、137mMNaCl、2.7mMKCl)交換。通過用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE分析Z變體的純度。ProteOn動力學(xué)分析：對在變性條件下純化的6種帶His6標(biāo)簽的Z變體確定對人IL-6的動力學(xué)常數(shù)(kon和koff)和親和力(KD)。將IL-6結(jié)合變體Z06814(SEQIDNO:1512)、Z14861(SEQIDNO:4)、Z014976(SEQIDNO:1)、Z14984(SEQIDNO:5)、Z15015(SEQIDNO:2)和Z15122(SEQIDNO:3)在10mMNaAc緩沖液，pH4.5中稀釋至5μg/ml，并分別固定在GLC芯片(Bio-Rad,目錄號176-5011)上。利用胺偶聯(lián)化學(xué)根據(jù)制造商的建議進(jìn)行固定并且使用PBST0.05％作為運行緩沖液。在動力學(xué)實驗中也使用PBST0.05％作為運行緩沖液，使用的流速為60μl/min。將分析物hIL-6在PBST0.05％運行緩沖液中稀釋至50nM、12.5nM、3.1nM、0.78nM、0.19nM和0nM的終濃度并以一式三份注射3min，然后在運行緩沖液中解離持續(xù)90min。解離后，用補(bǔ)充有0.05％Tween20的HCl再生表面。在Bio-Radmanager軟件(Bio-Rad)中利用1:1模型從傳感圖計算動力學(xué)常數(shù)。結(jié)合位點的分析：如實施例2中描述的評估14種成熟IL-6結(jié)合Z變體(在變性條件下純化的)對人gp130(hgp130)和hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體之間的相互作用的干擾。初始結(jié)合物Z06814和hIL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗被包括用于比較?；赥F-1細(xì)胞的測定：在具有L-谷氨酰胺(HyClone,目錄號SH30027)補(bǔ)充有10％FBS(HyClone,目錄號SH30919.03)、Pen-Strep(HyClone,目錄號15140-163)和2ng/mlrhGM-CSF(R&DSystems,目錄號215-GM-010)的RPMI1640中培養(yǎng)TF-1細(xì)胞。在使用前，將細(xì)胞在rhGM-CSF的不存在下在RPMI-1640中洗滌兩次。然后對細(xì)胞計數(shù)并以4x104個細(xì)胞/孔的密度分配到96孔板(Corning,目錄號3596)中。在單獨的板中，在0.099nMrhIL-6(R&DSystems,目錄號206-IL/CF)的存在下孵育Z變體(在天然條件下純化的)的系列稀釋物(濃度范圍10-0.00061nM)、托珠單抗(Roche)和對照IgG(JacksonImmunoresearch,目錄號Jac-009-000-003)。然后將這些預(yù)混合物轉(zhuǎn)移至含有TF-1細(xì)胞的孔，所述含有TF-1細(xì)胞的孔被在37℃在加濕的5％CO2氣氛中孵育了持續(xù)72h。在孵育的最后4個小時，使每孔包含10μlWST(DoGen,目錄號EZ3000)。利用VictorX3板讀取器(PerkinElmer)在450nM測量吸光度。通過使每個孔的吸光度除以每個板中的IL-6處理的孔的平均吸光度計算相對細(xì)胞生活力。通過對四參數(shù)劑量響應(yīng)曲線的非線性回歸來評價數(shù)據(jù)，并利用GraphPadPrism軟件確定半最大抑制濃度(IC50)。CD分析：使用在天然條件下純化的Z變體如實施例2中描述的進(jìn)行CD分析。結(jié)果ProteOn動力學(xué)分析：在ProteOn儀器上通過在包含不同的固定的Z變體的表面上注射多種濃度的hIL-6來分析6種帶His6標(biāo)簽的IL-6結(jié)合Z變體與人IL-6的相互作用。表面的配體固定水平在每個100-220RU之間。利用1:1相互作用模型，hIL-6與Z變體的結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)(KD、ka(kon)和kd(koff))的歸納在表13中給出。表13：hIL-6與Z變體的結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)Z變體SEQIDNO:kon(M-1s-1)koff(s-1)KD(M)His6-Z0681415124.3x1058.8x10-52.0x10-10His6-Z1486143.6x1056.3x10-51.7x10-10His6-Z1497613.1x1052.7x10-58.8x10-11His6-Z1498453.0x1057.4x10-52.5x10-10His6-Z1501524.3x1057.2x10-51.7x10-10His6-Z1512233.1x1053.9x10-51.2x10-10結(jié)合位點的分析：所有成熟IL-6結(jié)合Z變體顯示出對在預(yù)先形成的hIL-6/hIL-6Rα復(fù)合體和hgp130之間的類似反式信號傳導(dǎo)的相互作用的清晰的濃度依賴性阻斷(圖5)。每種成熟Z變體顯示出比初始結(jié)合物Z06814和托珠單抗兩者均高的阻斷能力，即所述阻斷能力會相應(yīng)于小于1.6nM的IC50值?；赥F-1細(xì)胞的測定：進(jìn)行基于TF-1細(xì)胞的測定，以評價IL-6結(jié)合Z變體在經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑中的效力和潛力。該測定顯示所有的親和力成熟的IL-6結(jié)合Z變體都能夠阻斷TF-1細(xì)胞的IL-6依賴性生長(圖6)。在表14中顯示了對Z變體以及對hIL-6Rα結(jié)合抗體托珠單抗計算的IC50值。表14：成熟Z變體阻斷TF-1細(xì)胞的IL-6依賴性生長的IC50值Z變體SEQIDNO:IC50(M)His6-Z1163271.2x10-10His6-Z1463068.7x10-11His6-Z1470081.0x10-10His6-Z1471292.2x10-10His6-Z1486141.9x10-10His6-Z14862104.3x10-10His6-Z1497614.2x10-11His6-Z1498452.7x10-10His6-Z1501522.7x10-11His6-Z15036111.8x10-10His6-Z15110129.3x10-10His6-Z1512238.5x10-11His6-Z15142145.1x10-10His6-Z0681415121.3x10-10托珠單抗N/A4.1x10-10CD分析：對10種成熟Z變體確定的CD光譜顯示，每種變體在20℃具有α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過可變溫度測量確定的熔解溫度(Tm)被顯示于表15中。表15：成熟Z變體的亞組的熔解溫度實施例8與ABD融合的IL-6結(jié)合Z變體的體內(nèi)活性:利用血清淀粉樣蛋白A(SAA)小鼠模型探索與ABD融合的IL-6結(jié)合Z變體的體內(nèi)阻斷效果。急性期蛋白SAA從肝細(xì)胞分泌并可由促炎性細(xì)胞因子IL-1、IL-6和TNF誘導(dǎo)。由于人和小鼠細(xì)胞因子的序列同一性，人變體能夠作用于其相應(yīng)的小鼠受體并引起鼠SAA響應(yīng)。要注意的是，人TNF蛋白僅能夠與鼠TNFRII相互作用(不是鼠TNFRI)。材料和方法如實施例2中描述的，克隆IL-6靶向Z變體Z06814(SEQIDNO:1512)和結(jié)合不相關(guān)靶的對照Z變體Z04726(SEQIDNO:1535)，并以與ABD變體PP013(SEQIDNO:1554)融合的方式產(chǎn)生。在以5μg/kg腹膜內(nèi)(i.p.)施用hIL-6(R&DSystems)之前9h，以多種劑量(0,0.025、2.5或25mg/kg體重)的Z06814-ABD皮下(s.c.)注射四組Balb/c小鼠(n＝8)。第5組小鼠(n＝8)接受25mg/kg的Z04726-ABD。兩個另外的對照組小鼠分別接受PBS(n＝4)和25mg/kg的Z06814-ABD(n＝8)，但無隨后的IL-6注射。20h后，通過心臟穿刺取得血液，并收集血清。通過ELISA(Tridelta)根據(jù)制造商的指示對血清測定鼠SAA的含量。簡而言之，將稀釋的血清樣品與抗SAA-HRP一起添加至SAA預(yù)包被的板。將板孵育持續(xù)1h并且然后洗滌4次。添加TMB底物20min，然后用終止溶液終止反應(yīng)。利用微板讀取器(Victor3,PerkinElmer)在450nm處測量吸光度。結(jié)果利用IL-6觸發(fā)的血清淀粉樣蛋白-A(SAA)釋放的小鼠模型體內(nèi)評估Z變體Z06814(SEQIDNO:1512)的抗關(guān)節(jié)炎效力。注射5μg/kg體重hIL-6之前9h，給予四組小鼠0、0.025、2.5或25mg/kg體重的IL-6結(jié)合Z06814-ABD融合蛋白或25mg/kg對照Z04726-ABD融合蛋白。在另外的22h后，測量SAA蛋白的水平并在不同組之間比較。在未接受Z06814-ABD或接受25mg/kg對照Z04726-ABD融合物的動物中，血清中的SAA蛋白水平增加至約500-600μg/ml的水平。僅給予PBS(且無hIL-6)的對照動物表現(xiàn)出16-64μg/ml的范圍內(nèi)的水平。在給予Z06814-ABD的動物中，以劑量依賴的方式測量到顯著較低的SAA蛋白水平(圖7)。對于給予最高劑量的Z06814-ABD(25mg/kg體重)的組，SAA蛋白水平與未給予hIL-6注射的動物一樣低。實施方案的分項列舉1.ABD結(jié)合多肽，包含IL-6結(jié)合基序BM，該基序由選自以下的氨基酸序列組成：i)EEX3X4AWX7EIHX11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28X29其中，彼此獨立地，X3選自A、F、H、K、Q、R、S、W和Y；X4選自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7選自F、H、I、K、L、M、N、R、S、T、V、W和Y；X11選自A、I、K、L、M、N、R、S、T和V；X16選自N和T；X17選自A、I、T和V；X18選自D、E、G、H、K、N、Q、R、S和T；X20選自I、L、M、R、T和V；X21選自A、S、T和V；X25選自I、M、Q、S、T、V和W；X26選自K和S；X28選自F、L、M和Y；并且X29選自D和R；和ii)與在i)中定義的序列具有至少93％同一性的氨基酸序列。2.根據(jù)項目1所述的IL-6結(jié)合多肽，其中在序列i)中：X3選自A、H、K、Q、R和Y；X4選自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V和Y；X7選自F、H、I、K、L、M、N、R、T、V、W和Y；X11選自A、I、K、L、N、S、T和V；X16為T；X17選自A、I、T和V；X18選自D、E、H、K、N、Q、R、S和T；X20選自I、L、M、R和V；X21選自A、S和V；X25選自I、Q、S、T、V和W；X26為K；X28選自F、L、M和Y；并且X29為D。3.根據(jù)項目1或2所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足以下11個條件I-XI中的至少6個：I.X3選自K和R；II.X11選自A和L；III.X16為T；IV.X17選自I和V；V.X18選自D和E；VI.X20為M；VII.X21為A；VIII.X25選自S和T；IX.X26為K；X.X28為F；以及XI.X29為D。4.根據(jù)項目3所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足所述11個條件I-XI中的至少7個。5.根據(jù)項目4所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足所述11個條件I-XI中的至少8個。6.根據(jù)項目5所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足所述11個條件I-XI中的至少9個。7.根據(jù)項目6所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足所述11個條件I-XI中的至少10個。8.根據(jù)項目7所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)滿足所有所述11個條件I-XI。9.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其中X17X20X21選自VMA和IMA。10.根據(jù)項目1-8中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中X20X21X28是MAF。11.根據(jù)項目1-8中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中X17X20X28選自VMF和IMF。12.根據(jù)項目1-8中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中X17X21X28選自VAF和IAF。13.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1551組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。14.根據(jù)項目13所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1502組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。15.根據(jù)項目14所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。16.根據(jù)項目14所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。17.根據(jù)項目13所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。18.根據(jù)項目17所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。19.根據(jù)項目17所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。20.根據(jù)項目18或19所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。21.根據(jù)項目19所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。22.根據(jù)項目20所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。23.根據(jù)項目18所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。24.根據(jù)項目23所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。25.根據(jù)項目24所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。26.根據(jù)項目16、22和25中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-5組成的組的序列中從位置8至位置36的序列。27.根據(jù)項目24所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列i)相應(yīng)于SEQIDNO:1512中從位置8至位置36的序列。28.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述IL-6結(jié)合基序形成三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域的一部分。29.根據(jù)項目28所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述IL-6結(jié)合基序基本上形成所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有相互連接環(huán)的雙螺旋的一部分。30.根據(jù)項目29所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自細(xì)菌受體結(jié)構(gòu)域。31.根據(jù)項目30所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述三螺旋束蛋白結(jié)構(gòu)域選自來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的結(jié)構(gòu)域或其衍生物。32.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含結(jié)合模塊BMod,所述結(jié)合模塊的氨基酸序列選自以下：iii)K-[BM]-DPSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ；其中[BM]為如項目1-27的任一項中定義的IL-6結(jié)合基序，條件是X29為D；Xa選自A和S；Xb選自N和E；Xc選自A、S和C；Xd選自E、N和S；Xe選自D、E和S；Xf選自A和S；以及iv)與由iii)定義的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。33.根據(jù)項目1-31中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含結(jié)合模塊BMod，所述結(jié)合模塊的氨基酸序列選自以下：v)K-[BM]-QPEQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ，其中[BM]為如項目1-27的任一項中定義的IL-6結(jié)合基序，條件是X29為R；Xa選自A和S；Xb選自N和E；Xc選自A、S和C；Xd選自E、N和S；Xe選自D、E和S；Xf選自A和S；以及vi)與由v)定義的序列具有至少91％同一性的氨基酸序列。34.根據(jù)項目1-32中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1551組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。35.根據(jù)項目34所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-1502組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。36.根據(jù)項目35所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。37.根據(jù)項目35所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。38.根據(jù)項目34所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。39.根據(jù)項目38所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。40.根據(jù)項目35或38所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-152組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。41.根據(jù)項目39或40所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-150組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。42.根據(jù)項目40所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。43.根據(jù)項目41所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。44.根據(jù)項目39所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。45.根據(jù)項目44所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。46.根據(jù)項目45所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-14組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。47.根據(jù)項目37、43和46中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于選自由SEQIDNO:1-5組成的組的序列中從位置7至位置55的序列。48.根據(jù)項目45所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列iii)相應(yīng)于SEQIDNO:1512中從位置7至位置55的序列。49.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含選自以下的氨基酸序列：vii)YA-[BMod]-AP；其中[BMod]是如項目32-48的任一項中定義的IL-6結(jié)合模塊；和viii)與由vii)定義的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。50.根據(jù)項目1-48中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含選自以下的氨基酸序列：ix)FN-[BMod]-AP；其中[BMod]是如項目32-48的任一項中定義的IL-6結(jié)合模塊；和x)與由ix)定義的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。51.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含選自以下的氨基酸序列：ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK；AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；AEAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLSESQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-QPEQSSELLSEAKKLESSQAPK；VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；以及AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK；其中[BM]為如項目1-27的任一項中定義的IL-6結(jié)合基序。52.根據(jù)項目1-49中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含選自以下的氨基酸序列：xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]為如項目1-27的任一項中定義的IL-6結(jié)合基序；以及xii)與xi)中定義的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。53.根據(jù)項目1-49中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其包含選自以下的氨基酸序列：xiii)AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK；其中[BM]為如項目1-27的任一項中定義的IL-6結(jié)合基序；以及xiv)與xiii)中定義的序列具有至少89％同一性的氨基酸序列。54.根據(jù)項目52所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-1551組成的組。55.根據(jù)項目54所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-1502組成的組。56.根據(jù)項目55所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-871組成的組。57.根據(jù)項目55所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14、SEQIDNO:90-150和SEQIDNO:872-1502組成的組。58.根據(jù)項目54所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-152和SEQIDNO:1503-1515組成的組。59.根據(jù)項目58所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-150和SEQIDNO:1503-1515組成的組。60.根據(jù)項目55或58所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-152組成的組。61.根據(jù)項目59或60所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-150組成的組。62.根據(jù)項目60所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:15-89和SEQIDNO:151-152組成的組。63.根據(jù)項目61所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-6、SEQIDNO:8-14和SEQIDNO:90-150組成的組。64.根據(jù)項目59所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1503-1515組成的組。65.根據(jù)項目64所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-14和SEQIDNO:1512組成的組。66.根據(jù)項目65所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-14組成的組。67.根據(jù)項目57、63和66中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)選自由SEQIDNO:1-5組成的組。68.根據(jù)項目65所述的IL-6結(jié)合多肽，其中序列xi)為SEQIDNO:1512。69.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其能夠阻斷經(jīng)由順式信號傳導(dǎo)途徑和/或反式信號傳導(dǎo)途徑的IL-6依賴性信號傳導(dǎo)。70.根據(jù)項目69所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述阻斷的半最大抑制濃度(IC50)為至多1x10-6M，諸如至多1x10-7M，諸如至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。71.根據(jù)項目69或70所述的IL-6結(jié)合多肽，其能夠阻斷IL-6/IL-6Rα與gp130的相互作用。72.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其能夠與IL-6結(jié)合，以使得相互作用的EC50值為至多1x10-7M，諸如至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。73.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其能夠與IL-6結(jié)合，以使得相互作用的KD值為至多1x10-8M，諸如至多1x10-9M，諸如至多1x10-10M。74.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，其在C-末端和/或N-末端包含另外的氨基酸。75.根據(jù)項目74所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述另外的氨基酸改進(jìn)所述多肽的產(chǎn)生、純化、體內(nèi)或體外的穩(wěn)定、偶聯(lián)或檢測。76.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽為多聚體形式，所述多聚體形式包含至少2個IL-6結(jié)合多肽單體單元，所述單體單元的氨基酸序列可以是相同或不同的。77.根據(jù)項目76所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述IL-6結(jié)合多肽單體單元共價地偶聯(lián)在一起。78.根據(jù)項目77所述的IL-6結(jié)合多肽，其中所述IL-6結(jié)合多肽單體單元表達(dá)為融合蛋白。79.根據(jù)項目78所述的IL-6結(jié)合多肽，所述IL-6結(jié)合多肽為二聚體形式。80.融合蛋白或綴合物，所述融合蛋白或綴合物包含：-第一部分，所述第一部分由根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽組成；和-第二部分，所述第二部分由具有期望的生物學(xué)活性的多肽組成。81.根據(jù)項目80所述的融合蛋白或綴合物，其中所述期望的生物學(xué)活性是治療活性。82.根據(jù)項目80所述的融合蛋白或綴合物，其中所述期望的生物學(xué)活性是結(jié)合活性。83.根據(jù)項目82所述的融合蛋白或綴合物，其中所述結(jié)合活性是白蛋白結(jié)合活性，所述白蛋白結(jié)合活性增加所述融合蛋白或綴合物的體內(nèi)半衰期。84.根據(jù)項目83所述的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分包含鏈球菌G蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其衍生物。85.根據(jù)項目82所述的融合蛋白或綴合物，其中所述結(jié)合活性發(fā)揮作用阻斷生物學(xué)活性。86.根據(jù)項目80所述的融合蛋白或綴合物，其中所述期望的生物學(xué)活性是酶促活性。87.根據(jù)項目81所述的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分是治療活性多肽。88.根據(jù)項目87所述的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分是免疫應(yīng)答改變劑。89.根據(jù)項目87所述的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分是抗癌劑。90.根據(jù)項目80、81、86、88和89中任一項所述的融合蛋白或綴合物，其中所述第二部分選自由人內(nèi)源酶、激素、生長因子、趨化因子、細(xì)胞因子和淋巴因子組成的組。91.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物，所述IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物還包含標(biāo)記物。92.根據(jù)項目91所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物，其中所述標(biāo)記物選自由熒光染料和金屬、發(fā)色團(tuán)染料、化學(xué)發(fā)光化合物和生物發(fā)光蛋白、酶、放射性核素和放射性顆粒組成的組。93.根據(jù)任一前述項目所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物，所述IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物包括由經(jīng)由半胱氨酸殘基的硫醇基或賴氨酸殘基的胺基綴合至所述IL-6結(jié)合多肽的聚氨基聚羧酸鹽螯合劑提供的螯合環(huán)境。94.多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)項目1-79中任一項所述的多肽。95.表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含根據(jù)項目94所述的多核苷酸。96.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含根據(jù)項目95所述的表達(dá)載體。97.制備根據(jù)項目1-79中任一項所述的多肽的方法，所述方法包括-在容許所述多肽由所述表達(dá)載體表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)項目96所述的宿主細(xì)胞，和-分離所述多肽。98.組合物，所述組合物包含根據(jù)項目1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。99.根據(jù)項目98所述的組合物，所述組合物還包含至少一種另外的活性劑，諸如選自免疫應(yīng)答改變劑和抗癌劑的劑。100.根據(jù)項目1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物，用于口服、局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肺、經(jīng)皮、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、含服、舌下或栓劑施用，諸如用于局部施用。101.根據(jù)項目1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物，用于作為藥物、診斷劑或預(yù)后劑使用。102.根據(jù)項目1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物，用于作為藥物使用。103.根據(jù)項目102所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，其中所述多肽、融合蛋白、綴合物或組合物體內(nèi)調(diào)控IL-6功能。104.根據(jù)項目101-103中任一項所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，用于在IL-6相關(guān)紊亂的治療、預(yù)后或診斷中使用。105.根據(jù)項目101-103中任一項所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，用于在IL-6相關(guān)紊亂的治療中使用。106.根據(jù)項目105所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病和抑郁癥。107.根據(jù)項目106所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由炎性疾病和自身免疫疾病組成的組。108.根據(jù)項目107所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物和組合物，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，脈管炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，慢性炎癥性腸疾病諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；格雷夫斯病，貝賽特氏病，葡萄膜炎，巨細(xì)胞動脈炎，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，全身性紅斑狼瘡(SLE)，多肌炎，風(fēng)濕性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，胰腺炎，腹膜炎，腎炎，川崎病，干燥綜合征和成人斯蒂爾病。109.根據(jù)項目106所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，其中所述IL-6相關(guān)紊亂為癌癥，諸如選自由以下組成的組的癌癥：結(jié)腸炎相關(guān)癌癥、腎癌(renalcancer)、腎癌(kidneycancer)、前列腺癌、惡性淋巴細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡斯?fàn)柭?、乳腺癌和肺癌?10.根據(jù)項目106所述的用于使用的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、膿毒癥、惡病質(zhì)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宮內(nèi)膜異位和骨質(zhì)疏松。111.治療IL-6相關(guān)紊亂的方法，所述方法包括對有相應(yīng)需要的受試者施用有效量的根據(jù)項目1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物。112.根據(jù)項目111所述的方法，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組：炎性疾病、自身免疫疾病、感染性疾病、癌癥、糖尿病、神經(jīng)性疾病和抑郁癥。113.根據(jù)項目112所述的方法，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由炎性疾病和自身免疫疾病組成的組。114.根據(jù)項目113所述的方法，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自由以下組成的組:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年RA、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎或全身性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，脈管炎，銀屑病性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，慢性炎癥性腸疾病諸如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎；格雷夫斯病，貝賽特氏病，葡萄膜炎，巨細(xì)胞動脈炎，多發(fā)性硬化癥(MS)，全身性硬化癥，全身性紅斑狼瘡(SLE)，多肌炎，風(fēng)濕性多肌痛，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，胰腺炎，腹膜炎，腎炎，川崎病，干燥綜合征和成人斯蒂爾病。115.根據(jù)項目112所述的方法，其中所述IL-6相關(guān)紊亂為癌癥，諸如選自由以下組成的組的癌癥：結(jié)腸炎相關(guān)癌癥、腎癌(renalcancer)、腎癌(kidneycancer)、前列腺癌、惡性淋巴細(xì)胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡斯?fàn)柭?、乳腺癌和肺癌?16.根據(jù)項目112所述的方法，其中所述IL-6相關(guān)紊亂選自以下：阿耳茨海默氏病、HIV、糖尿病、膿毒癥、惡病質(zhì)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、肝硬化、移植物抗宿主疾病、心肌梗死、子宮內(nèi)膜異位和骨質(zhì)疏松。117.檢測IL-6的方法，所述方法包括：提供疑似含有IL-6的樣品，使所述樣品與根據(jù)項目1-90中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物接觸，以及檢測IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物的結(jié)合以指示IL-6在所述樣品中的存在。118.用于確定IL-6在受試者中存在的方法，所述方法包括以下步驟：--使所述受試者、或從受試者分離的樣品與根據(jù)項1-93中任一項所述的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白或綴合物或根據(jù)項目98-99中任一項所述的組合物接觸，以及-獲得對應(yīng)于已在所述受試者中或與所述樣品結(jié)合的IL-6結(jié)合多肽、融合蛋白、綴合物或組合物的量的值。119.根據(jù)項目118所述的方法，所述方法還包括將所述值與參照比較的步驟。120.根據(jù)項目118或119所述的方法，其中所述受試者為哺乳動物受試者，諸如人類受試者。121.根據(jù)項目118-120中任一項所述的方法，其中所述方法在體內(nèi)進(jìn)行。122.根據(jù)項目118-120中任一項所述的方法，其中所述方法在體外進(jìn)行。當(dāng)前第1頁1 2 3