本發(fā)明涉及瓜氨酸的制備方法，進一步詳細而言，涉及使用乳酸菌等微生物的瓜氨酸的制備方法。另外，本發(fā)明涉及以高濃度含有瓜氨酸的組合物(例如，乳制品)的制造方法。進一步地，本發(fā)明涉及提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法和提高了菌體濃度的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法。

背景技術：

瓜氨酸為功能性氨基酸，在日本，允許作為醫(yī)藥品使用后，在2007年允許作為食品使用。另外，瓜氨酸在國外具有如下實踐：從2007年以前作為食品攝取，例如，由于血流改善、動脈硬化預防、精力增強的功能而一直作為補充劑銷售。進一步地，有報告稱瓜氨酸除此以外還具有怕冷癥改善、皮膚功能改善、疲勞減輕·恢復、肌肉生長、運動功能提高等功能。

另一方面，瓜氨酸作為食品原材料極其昂貴，進一步地，為了發(fā)揮其功能所需的攝取量為較大量(例如，數(shù)百mg)。因此，若要在食品等中以有效量混合瓜氨酸，則其昂貴成為問題。

瓜氨酸現(xiàn)狀是主要通過發(fā)酵法來生產。例如，日本特開昭63－068091號公報(專利文獻1)中公開了一種培養(yǎng)屬于棒狀桿菌屬、短桿菌屬的微生物，使l－瓜氨酸生成蓄積在培養(yǎng)液中的l－瓜氨酸的制造方法。另外，在日本特開平05－168486號公報(專利文獻2)中記載了一種使屬于片球菌屬的乳酸菌感染噬菌體而溶菌，使得到的物質作用于l－精氨酸而生成l－瓜氨酸的l－瓜氨酸制造方法。另外，在日本特開平08－089269號公報(專利文獻3)中公開了一種使利用水溶性有機溶劑干燥了的l－鳥氨酸生產能力缺乏菌體作用于l－精氨酸而生成l－瓜氨酸的l－瓜氨酸制造方法。在該公報中例示了屬于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬的細菌。另外，在日本特開2010－088301號公報(專利文獻4)中公開了一種基于弧菌屬細菌的發(fā)酵法的l－瓜氨酸的制造方法。

然而，從瓜氨酸的生產效率和生產成本的觀點考慮，這些現(xiàn)有技術仍有改善的余地，可以說仍然期望一種生產效率、成本效益高的瓜氨酸的制備方法。

在此，據(jù)本發(fā)明人等了解，雖然沒有報告使用一種作為乳酸菌的乳酸乳球菌(l.lactis)由精氨酸生產瓜氨酸、鳥氨酸的情況，但報告了若干利用乳酸乳球菌代謝精氨酸的情況(非專利文獻1、2、和3)。例如，在非專利文獻1和2中，記載了利用乳酸乳球菌將全部精氨酸轉換為鳥氨酸。另外，在非專利文獻3中，記載了在利用乳酸乳球菌代謝精氨酸時，全部精氨酸被轉換為鳥氨酸是已知的事實。而且，在日本特開2009－112205號公報(專利文獻5)中，記載了在奶酪等的制造發(fā)酵過程中，產生l－鳥氨酸，制造含鳥氨酸的組合物。

進而，在有關精氨酸代謝的基因表達的研究中，報告了對于乳酸乳球菌，從精氨酸轉換為瓜氨酸的酶的精氨酸脫亞胺酶(adi)和將瓜氨酸轉換為鳥氨酸的酶的鳥氨酸氨甲酰基轉移酶(otc)的基因鄰接地進行編碼、這2個基因利用同一啟動子來控制其其表達(非專利文獻4)。

另外，在有關精氨酸代謝的基因表達的研究中，報告了作為乳酸乳球菌以外的乳酸菌，糞腸球菌(enterococcusfaecalis)和植物乳桿菌(lactobacillusplanturum)的adi和otc的基因均鄰接地進行編碼、這2個基因利用同一啟動子來控制其表達(非專利文獻5和6)。

在這些研究中，使用實時pcr確認了adi和otc的基因表達被同時控制。然后，對于乳酸乳球菌，在各種培養(yǎng)條件下測定adi和otc的活性(非專利文獻1)，報告了在其任一培養(yǎng)條件下，otc的活性均變得比adi高。

即，根據(jù)這些研究，表示在具有精氨酸代謝能力的微生物的情況下，通過adi，精氨酸被轉換為瓜氨酸，但通過otc，瓜氨酸立即被轉換為鳥氨酸，因此，瓜氨酸不會在培養(yǎng)液中蓄積。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開昭63－068091號公報

專利文獻2：日本特開平05－168486號公報

專利文獻3：日本特開平08－089269號公報

專利文獻4：日本特開2010－088301號公報

專利文獻5：日本特開2009－112205號公報

非專利文獻

非專利文獻1：crowv.l.,t.d.thomas.1982.argininemetabolisminlacticstreptococci.j.bacteriol.150:1024-1032.

非專利文獻2：poolmanb.,a.j.m.driessen,w.n.konings.1987.regulationofarginine-ornithineexchangeandargininedeiminasepathwayinstreptococcuslactis.bacteriol.,169:5597-5604

非專利文獻3：larsenr.,g.burist,o.p.kuipers,j.kok.2004.argrandahrcarerequiredforregulationofargininemetabolisminlactococcuslactis.j.bacteriol.186:1147-1157

非專利文獻4：budin-verneuila.,e.maguin,y.auffray,d.s.ehrlich,v.pichereau.2006.geneticstructureandtrascriptionalanalysisoftheargininedeiminase(adi)clusterinlactococcuslactismg1363.can.j.microbiol.52:617-622

非專利文獻5：barcelonab.,a.marina,v.rubio.2002.genestructure,organization,expression,andpotentialregulatorymechanismsofargininecatabolisminenterococcusfaecalis.j.bacteriol.184:6289-6300

非專利文獻6：spanog.,g.chieppa,l.beneduce,s.massa,2004.expressionanalysisofputativearca,arcbandarccgenespartiallyclonedfromlactobacillusplantarumisolatedfromwine.j.appl.microbiol.96185-193

發(fā)明概述

發(fā)明要解決的課題

為了使用乳酸菌等微生物有效地將大部分精氨酸轉換為瓜氨酸，認為有效的是抑制瓜氨酸被轉換為鳥氨酸。但是，據(jù)本發(fā)明人等了解，迄今為止沒有將大部分精氨酸有效地轉換為瓜氨酸的方法的報告。

本發(fā)明人等如今得出如下見解：通過使用具有瓜氨酸產生能力的微生物在比通常(微生物培養(yǎng)的最佳溫度)高的溫度下對培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，能夠有效地使微生物生產瓜氨酸。另外，本發(fā)明人等得出如下見解：通過使用具有瓜氨酸產生能力的微生物在比通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)高的溫度下使原料(例如，原料乳等)發(fā)酵，能夠制造以高濃度含有瓜氨酸的組合物(例如，發(fā)酵乳制品等飲食品)。

進而，本發(fā)明人等得出如下見解：通過將精氨酸添加到培養(yǎng)基、原料中進行培養(yǎng)、發(fā)酵，能夠提高微生物的瓜氨酸產生能力。而且，本發(fā)明人等得出如下見解：通過控制培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)的ph進行培養(yǎng)，能夠提高微生物的濃度(個數(shù))。本發(fā)明是基于這些見解而完成的。

因此，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠有效地生產瓜氨酸的瓜氨酸制備方法。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種以高濃度含有瓜氨酸的含瓜氨酸組合物的制造方法。

進而，本發(fā)明的目的在于提供提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物的培養(yǎng)方法、發(fā)酵方法。而且，本發(fā)明的目的在于提供一種提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的濃度的培養(yǎng)方法。

用于解決課題的手段：

即，本發(fā)明涉及以下的實施方案(1)～(18)。

(1)一種瓜氨酸的制備方法，其特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物接種于培養(yǎng)基，在40℃以上且70℃以下的溫度進行培養(yǎng)。

(2)根據(jù)(1)所述的瓜氨酸的制備方法，其中，具有瓜氨酸產生能力的微生物為乳酸菌、雙歧桿菌或丙酸菌。

(3)根據(jù)(2)所述的瓜氨酸的制備方法，其中，乳酸菌為選自乳酸乳球菌、發(fā)酵乳桿菌和布氏乳桿菌中的1種或2種以上。

(4)根據(jù)(2)所述的瓜氨酸的制備方法，其中，乳酸菌為選自乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1種或2種以上。

(5)一種含瓜氨酸組合物的制造方法，其特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物添加(混合)到原料中，在40℃以上且70℃以下的溫度進行發(fā)酵。

(6)根據(jù)(5)所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中，具有瓜氨酸產生能力的微生物為乳酸菌、雙歧桿菌或丙酸菌。

(7)根據(jù)(6)所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中，乳酸菌為選自乳酸乳球菌、發(fā)酵乳桿菌和布氏乳桿菌中的1種或2種以上。

(8)根據(jù)(6)所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中，乳酸菌為選自乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1種或2種以上。

(9)根據(jù)(5)～(8)中任一項所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中，原料為原料乳。

(10)根據(jù)(5)～(9)中任一項所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中，含瓜氨酸組合物為飲食品。

(11)一種制備方法，是含有具瓜氨酸產生能力且提高了在40℃以上且70℃以下的培養(yǎng)溫度下從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物在添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

(12)根據(jù)(11)所述的培養(yǎng)液的制備方法，其中，在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中和/或在培養(yǎng)途中間斷地添加精氨酸或者在培養(yǎng)途中連續(xù)地添加精氨酸。

(13)一種制備方法，是含有具瓜氨酸產生能力的微生物且提高了該微生物濃度的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物在ph處于5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，提高所述微生物的濃度。

(14)根據(jù)(13)所述的培養(yǎng)液的制備方法，其中，通過添加堿來調節(jié)培養(yǎng)基的ph。

(15)一種制備方法，是含有具瓜氨酸產生能力、提高了在35℃以上且70℃以下的培養(yǎng)溫度下從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物且提高了該微生物濃度(菌體濃度)的培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物在添加了精氨酸且處于ph為5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，提高所述微生物的濃度。

(16)根據(jù)(15)所述的培養(yǎng)液的制備方法，其中，在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中和/或在培養(yǎng)途中間斷地添加精氨酸或者在培養(yǎng)途中連續(xù)地添加精氨酸。

(17)一種提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的制備方法，所述微生物是將通過(11)～(16)中任一項所述的方法得到的培養(yǎng)液進行離心分離和/或膜分離而得到的微生物。

(18)根據(jù)(1)～(4)中任一項所述的瓜氨酸的制備方法，其中將通過(11)～(16)中任一項所述培養(yǎng)液的制備方法而得到的培養(yǎng)液或通過(17)所述微生物的制備方法而得到的微生物接種于培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；或者(5)～(10)中任一項所述的含瓜氨酸組合物的制造方法，其中將通過(11)～(16)中任一項所述培養(yǎng)液的制備方法而得到的培養(yǎng)液或通過(17)所述微生物的制備方法而得到的微生物添加到原料中進行發(fā)酵。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法，能夠有效地生產瓜氨酸。另外，根據(jù)本發(fā)明的含瓜氨酸組合物的制造方法，能夠得到以高濃度含有瓜氨酸的乳制品等營養(yǎng)組合物。另外，根據(jù)本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)方法、發(fā)酵方法，能夠提高從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。而且，根據(jù)本發(fā)明的微生物的培養(yǎng)方法，能夠提高微生物的濃度。進而，根據(jù)本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法、含瓜氨酸組合物的制造方法，使用提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率和/或提高了微生物的濃度的具有瓜氨酸產生能力的微生物以及/或者該培養(yǎng)液，能夠有效地生產瓜氨酸，還能夠得到以高濃度含有瓜氨酸的乳制品等營養(yǎng)組合物。

附圖說明

圖1是表示使用氫氧化鈉將培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)的ph控制在5.5對乳酸乳球菌ols3797株進行培養(yǎng)時，乳酸乳球菌ols3797株的菌體濃度經時變化的圖表。

圖2是表示控制培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)的ph對乳酸乳球菌ols3797株進行培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))時的從培養(yǎng)開始10、11、12小時后的培養(yǎng)液和對乳酸乳球菌ols3797株進行靜置培養(yǎng)時的培養(yǎng)液的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的比較的圖表。

圖3是表示在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到mrs培養(yǎng)基中對乳酸乳球菌ols3797株進行培養(yǎng)時的ph的經時變化、菌體濃度的經時變化、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化的圖表。

圖4是表示在從培養(yǎng)開始10小時后將精氨酸間斷地添加到mrs培養(yǎng)基中對乳酸乳球菌ols3797株進行培養(yǎng)時的ph的經時變化、菌體濃度的經時變化、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化的圖表。

圖5是表示在從培養(yǎng)開始4小時后將精氨酸連續(xù)地添加到mrs培養(yǎng)基中對乳酸乳球菌ols3797株進行培養(yǎng)時的ph的經時變化、菌體濃度的經時變化、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化的圖表。

具體實施方式

瓜氨酸的制備方法

本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法的特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物接種于培養(yǎng)基，在比通常(微生物培養(yǎng)的最佳溫度)高的溫度下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度具體而言為40℃以上且48℃以下，優(yōu)選為42℃以上且47℃以下，更優(yōu)選為44℃以上且46℃以下。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述培養(yǎng)溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。

如上所述，本發(fā)明中的培養(yǎng)溫度是比具有瓜氨酸產生能力的微生物的通常的培養(yǎng)溫度(例如，最佳溫度)高的溫度。通過在這樣的溫度區(qū)域對微生物進行培養(yǎng)，能夠有效地產生瓜氨酸。對于該理由，認為如下，但以下的說明(理論)僅是假設的，本發(fā)明并不受該理論的任何限定。即，認為如現(xiàn)有技術中記載所述，例如，具有精氨酸代謝能力的乳酸乳球菌具有將精氨酸轉換為瓜氨酸的酶即精氨酸脫亞胺酶(adi)的基因和具有從瓜氨酸轉換為鳥氨酸的酶即鳥氨酸氨甲?；D移酶(otc)的基因，這兩者利用同一啟動子來控制表達。此時，認為如本發(fā)明那樣，在培養(yǎng)溫度為高的溫度時，增強通過adi從精氨酸向瓜氨酸的轉換，抑制通過otc從瓜氨酸向鳥氨酸的轉換，或者通過這兩者的作用、現(xiàn)象，瓜氨酸在培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中蓄積。即，認為如本發(fā)明那樣，在培養(yǎng)溫度高時，精氨酸被有效地轉換為瓜氨酸，因此，能夠實現(xiàn)瓜氨酸的有效的制備方法。

本發(fā)明的培養(yǎng)時間只要從能夠培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選為2～48小時，更優(yōu)選為3～36小時，進一步優(yōu)選為4～24小時。

本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物只要產生瓜氨酸就沒有特別限定，但優(yōu)選在40℃以上且48℃以下、更優(yōu)選42℃以上且47℃以下、進一步優(yōu)選44℃以上且46℃以下的溫度進行培養(yǎng)而有效地產生瓜氨酸。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。而且，本發(fā)明中的具有瓜氨酸產生能力的微生物優(yōu)選為具有瓜氨酸產生能力的乳酸菌、雙歧桿菌或丙酸菌，更優(yōu)選為具有瓜氨酸產生能力的乳酸菌或雙歧桿菌，進一步優(yōu)選為具有瓜氨酸產生能力的乳酸菌。

本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的乳酸菌優(yōu)選為選自乳酸乳球菌、發(fā)酵乳桿菌、布氏乳桿菌、糞腸球菌、酒球菌、戊糖片球菌、食淀粉乳桿菌、短乳桿菌和路氏乳桿菌中的1種或2種以上，更優(yōu)選為選自乳酸乳球菌、發(fā)酵乳桿菌和布氏乳桿菌中的1種或2種以上，進一步優(yōu)選為乳酸乳球菌。

本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的乳酸乳球菌優(yōu)選為選自乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種中的1種或2種以上，更優(yōu)選為乳酸乳球菌乳酸亞種，進一步優(yōu)選為選自乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactisspp.lactis)ols3789株、ols3797株和ols3818株中的1種或2種以上。另外，這些菌株如后所述，在保藏機構保藏。

本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的乳酸乳球菌乳酸亞種如上所述是乳酸乳球菌乳酸亞種ols3789且在國家技術評估學會，專利微生物保藏中心以保藏號：nitebp-1387(識別表示：乳酸乳球菌乳酸亞種ols3789、保藏日：2012年7月18日)保藏；乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797且在國家技術評估學會，專利微生物保藏中心以保藏號：nitebp-1388(識別表示：乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797、保藏日：2012年7月18日)保藏；乳酸乳球菌乳酸亞種ols3818且在國家技術評估學會，專利微生物保藏中心以保藏號：nitebp-1389(識別表示：乳酸乳球菌乳酸亞種ols3818、保藏日：2012年7月18日)保藏。

在此，乳酸乳球菌乳酸亞種ols3789具有如下所述的科學性質(形態(tài)上、培養(yǎng)基上的特征、生理學性質等)。

(a)形態(tài)上的性質

培養(yǎng)基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性狀：圓形、白色、光滑型、扁平狀

(b)生理學性質

菌形態(tài)：球菌；革蘭氏染色：陽性；乳酸發(fā)酵形式：同型乳酸發(fā)酵；需氧發(fā)育：+

(c)其它表征該微生物的性質

16srdna序列如下所述。(ols3789)

gctggcgggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列號：1)

另外，乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797具有如下所述的科學性質(形態(tài)上、培養(yǎng)基上的特征、生理學性質等)。

(a)形態(tài)上的性質

培養(yǎng)基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性狀：圓形、白色、光滑型、扁平狀

(b)生理學性質

菌形態(tài)：球菌；革蘭氏染色：陽性；乳酸發(fā)酵形式：同型乳酸發(fā)酵；需氧發(fā)育：+

(c)其它表征該微生物的性質

16srdna序列如下所述。(ols3797)

gaagctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列號：2)

進而，乳酸乳球菌乳酸亞種ols3818具有如下所述的科學性質(形態(tài)上、培養(yǎng)基上的特征、生理學性質等)。

(a)形態(tài)上的性質

培養(yǎng)基(lactobacillimrsagar，difco)上的菌落性狀：圓形、白色、光滑型、扁平狀

(b)生理學性質

菌形態(tài)：球菌；革蘭氏染色：陽性；乳酸發(fā)酵形式：同型乳酸發(fā)酵；需氧發(fā)育：+

(c)其它表征該微生物的性質

16srdna序列如下所述。(ols3818)

gcgaagctggcggcgtgcctaatacatgcaagttgagcgctgaaggttggtacttgtaccgactggatgagcagcgaacgggtgagtaacgcgtggggaatctgcctttgagcgggggacaacatttggaaacgaatgctaataccgcataaaaactttaaacacaagttttaagtttgaaagatgcaattgcatcactcaaagatgatcccgcgttgtattagctagttggtgaggtaaaggctcaccaaggcgatgatacatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttcggcaatggacgaaagtctgaccgagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaaactctgttggtagagaagaacgttggtgagagtggaaagctcatcaagtgacggtaactacccagaaagggacggctaactacgt(序列號：3)

本發(fā)明的培養(yǎng)基只要從能夠培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)基中適當選擇即可，沒有特別限定，例如包含脫脂乳、脫脂濃縮乳、還原脫脂乳和它們的蛋白質分解物、乳清、乳清濃縮物、還原乳清和它們的蛋白質分解物、生乳、全脂乳(滅菌乳)、全脂濃縮乳、還原全脂乳等，優(yōu)選包含脫脂乳、還原脫脂乳和它們的蛋白質分解物、乳清、還原乳清和它們的蛋白質分解物。

在本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法中，瓜氨酸在培養(yǎng)基中產生。此時，可以將含有瓜氨酸的培養(yǎng)基作為飲食品的原料、原材料等、優(yōu)選作為乳制品的原料、原材料等直接利用，也可以從該培養(yǎng)基中分離(離析等)瓜氨酸或者通過濃縮等處理進行加工后，制備期望純度的瓜氨酸來利用。此時，飲食品可以舉出功能性食品、營養(yǎng)食品等，乳制品可以舉出例如乳飲料、發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)、乳酸菌飲料、奶酪、冰淇淋等。

含瓜氨酸組合物的制造方法

本發(fā)明的含瓜氨酸組合物的制造方法的特征在于，將具有瓜氨酸產生能力的微生物添加(混合)到原料中，在比通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)高的溫度下進行發(fā)酵。發(fā)酵溫度具體而言為40℃以上且48℃以下，優(yōu)選為42℃以上且47℃以下，更優(yōu)選為44℃以上且46℃以下。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述發(fā)酵溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。

如上所述，本發(fā)明中的發(fā)酵溫度是比具有瓜氨酸產生能力的微生物的通常的發(fā)酵溫度(例如，最佳溫度)高的溫度。通過在這樣的溫度區(qū)域對微生物進行培養(yǎng)，能夠有效地產生瓜氨酸。關于該理由，認為與本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法中已經說明的理由相同。

另外，在本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法中，可以不從含有氨酸的培養(yǎng)基中分離瓜氨酸而直接利用培養(yǎng)基作為含瓜氨酸組合物，或者也可以利用通過期望的操作(例如，離心分離、膜分離等)進行了處理的培養(yǎng)基作為含瓜氨酸組合物。

本發(fā)明的發(fā)酵時間只要從具有瓜氨酸產生能力的微生物能夠發(fā)酵的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選為2～24小時，更優(yōu)選為3～16小時，進一步優(yōu)選為4～12小時。

本發(fā)明的原料只要從具有瓜氨酸產生能力的微生物能夠發(fā)酵的原料中適當選擇即可，沒有特別限定，例如包含脫脂乳、脫脂濃縮乳、還原脫脂乳和它們的蛋白質分解物、乳清、乳清濃縮物、還原乳清和它們的蛋白質分解物、生乳、全脂乳(滅菌乳)、全脂濃縮乳、還原全脂乳等，優(yōu)選包含脫脂乳、還原脫脂乳和它們的蛋白質分解物、乳清、還原乳清和它們的蛋白質分解物。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，若使用原料乳作為原料，則得到乳原料或乳制品等作為含瓜氨酸組合物。該得到的乳原料或乳制品等(含瓜氨酸組合物)賦予有來自瓜氨酸的功能，提高了其營養(yǎng)價值。進而，本發(fā)明的乳原料或乳制品等不是從外部添加(混合)瓜氨酸，而是在其制造工序中能夠提高瓜氨酸含量，因此，可以降低基于該乳原料或乳制品的最終制品的制造費用等。

根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選的一個實施方案，若使用發(fā)酵乳混合物(更優(yōu)選為酸奶混合物)作為原料，則得到發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)作為含瓜氨酸組合物。該得到的發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)賦予有來自瓜氨酸的功能，提高了其營養(yǎng)價值。進而，本發(fā)明的發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)不是從外部添加(混合)瓜氨酸，而是在其制造工序中能夠提高瓜氨酸含量，因此，能夠降低基于該發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)的最終制品的制造費用等。

在本發(fā)明的含瓜氨酸組合物的制造方法中，瓜氨酸在原料中產生。此時，可以將含有瓜氨酸的原料作為飲食品的原料、原材料等、優(yōu)選作為乳制品的原料、原材料等直接利用，也可以從該原料中分離(離析等)瓜氨酸或者通過濃縮等處理進行加工后，制備期望純度的瓜氨酸來利用。此時，飲食品可以舉出功能性食品、營養(yǎng)食品等，乳制品可以舉出例如乳飲料、發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)、乳酸菌飲料、奶酪、冰淇淋等。

含瓜氨酸飲食品

如上所述，含有通過本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法得到的瓜氨酸的培養(yǎng)基或含有通過本發(fā)明的含瓜氨酸組合物的制造方法得到的瓜氨酸的原料或者它們的加工品通過在飲食品中選擇使用任意的培養(yǎng)基、原料作為上述培養(yǎng)基、原料，能夠分別制成飲食品本身或飲食品的原料或原材料。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠提供將本發(fā)明的含有瓜氨酸的培養(yǎng)基或含有瓜氨酸的原料或者它們的加工品作為飲食品本身或者飲食品的原料或原材料利用的含瓜氨酸飲食品。

另外，能夠將通過上述的本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法而得到的瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品添加到(混合)到飲食品(優(yōu)選為乳制品，更優(yōu)選為發(fā)酵乳)來對該飲食品賦予來自瓜氨酸的功能。因此，根據(jù)本發(fā)明，能夠將本發(fā)明的瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品添加到飲食品中來提供含瓜氨酸飲食品。

根據(jù)本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法，對于瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品，能夠降低其制備費用(加工費用)、制造費用等而有效地提供它們。因此，通過使用本發(fā)明的瓜氨酸或含瓜氨酸組合物，賦予來自瓜氨酸的功能等而提高商品價值，同時，對于含瓜氨酸飲食品，在其制造工序中能夠提高瓜氨酸含量等，通過這些理由，能夠降低其制造費用等而提供。

本發(fā)明的含瓜氨酸飲食品只要允許含有瓜氨酸即可，沒有特別限定，例如可以舉出：乳飲料、發(fā)酵乳(更優(yōu)選為酸奶)、乳酸菌飲料、奶酪、冰淇淋等乳制品。

含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法

本發(fā)明的含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法的特征在于，將上述微生物在比通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)高的培養(yǎng)溫度下在添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。上述培養(yǎng)溫度具體而言為40℃以上且48℃以下，優(yōu)選為42℃以上且47℃以下，更優(yōu)選為44℃以上且46℃以下。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述培養(yǎng)溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，能夠提供一種上述微生物的瓜氨酸產生能力的提高方法，將本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物在40℃以上且48℃以下、優(yōu)選42℃以上且47℃以下、更優(yōu)選44℃以上且46℃以下的溫度進行培養(yǎng)。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，在40℃以上且70℃以下進行上述培養(yǎng)，優(yōu)選的培養(yǎng)的上限溫度為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限溫度為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。此時，本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物可以使用通過對由本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法得到的培養(yǎng)物或組合物進行適當處理而得到的提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物。

如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案的培養(yǎng)基是添加了精氨酸的培養(yǎng)基。通過以這樣的培養(yǎng)基的組成(混合)對微生物進行培養(yǎng)，能夠有效地產生瓜氨酸。關于該理由，認為如下，但以下的說明(理論)僅是假設的，本發(fā)明并不受該理論任何限定。即，如現(xiàn)有技術中記載所述，例如，在上述的非專利文獻1和2中報告了關于乳酸乳球菌的精氨酸的代謝活性，若將精氨酸添加到培養(yǎng)基中，則編碼adi和oct的基因的轉錄量增大。根據(jù)該見解，可以預測通過向培養(yǎng)基添加精氨酸，編碼adi的基因的轉錄量增大，認為在40℃以上且70℃、某種情況下為48℃以下這樣的培養(yǎng)溫度高的溫度時也能夠維持該現(xiàn)象。需要說明的是，通過將精氨酸添加到培養(yǎng)基中，編碼adi的基因的轉錄量增大、在40℃以上且70℃以下、某種情況下為48℃以下這樣的培養(yǎng)溫度高的溫度時也能夠維持該現(xiàn)象或者抑制編碼oct的基因的轉錄量難以直接預測。因此，根據(jù)非專利文獻1和2判斷本發(fā)明顯而易見是不恰當?shù)摹?/p>

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中和/或在培養(yǎng)途中間斷地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中或者在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。由此，能夠提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的瓜氨酸產生能力。此時，具有瓜氨酸產生能力的微生物優(yōu)選與充分濃度的精氨酸接觸的時間長。因此，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，優(yōu)選在培養(yǎng)之前將精氨酸添加(混合)到培養(yǎng)基中，更優(yōu)選在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中，并且在培養(yǎng)途中間斷地或者連續(xù)地將精氨酸添加(追加)到培養(yǎng)基中，尤其是進一步優(yōu)選在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。

本發(fā)明的精氨酸的添加量只要從能夠制備、制造瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選相對于培養(yǎng)基為0.5～5質量％，更優(yōu)選為0.7～4質量％，進一步優(yōu)選為1～3質量％。

本發(fā)明的精氨酸的添加方法只要能夠對培養(yǎng)基無菌地添加(混合)精氨酸即可，沒有特別限定，可以在對培養(yǎng)基添加精氨酸后對該培養(yǎng)基進行加熱殺菌、過濾滅菌，或者也可以另行制備精氨酸水溶液，對該精氨酸水溶液進行加熱殺菌、過濾滅菌后，對培養(yǎng)基添加該精氨酸水溶液。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，使用ph處于5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基，優(yōu)選使用ph處于5以上且6.5以下范圍的培養(yǎng)基，更優(yōu)選使用ph處于5以上且6以下范圍的培養(yǎng)基，進一步優(yōu)選使用ph處于5.5以上且6以下范圍的培養(yǎng)基。由此，能夠提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的濃度(菌體濃度)，能夠提高瓜氨酸產生能力。此時，優(yōu)選通過添加堿來調節(jié)培養(yǎng)基的ph，更優(yōu)選使用精氨酸或堿金屬氫氧化物作為堿。

在本發(fā)明的一個實施方案中，“在ph為5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)”優(yōu)選是指從培養(yǎng)初期到結束為止，培養(yǎng)基的ph處于5以上且7以下范圍，并不是指從培養(yǎng)初期到結束為止，培養(yǎng)基的ph一定總是處于5以上且7以下范圍。即，只要以在培養(yǎng)基的ph處于5以上且7以下范圍的狀態(tài)下于足以提高從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的時間培養(yǎng)即可，具體而言，培養(yǎng)1～60小時、優(yōu)選2～48小時、更優(yōu)選3～36小時、進一步優(yōu)選4～24小時即可。

本發(fā)明的堿的添加方法只要從能夠將培養(yǎng)基的ph控制或管理在規(guī)定的范圍的條件中適當選擇即可，沒有特別限定。例如，優(yōu)選使用ph計和計算機等一邊間斷或連續(xù)地觀察培養(yǎng)基的ph，一邊間斷或連續(xù)地將培養(yǎng)基的ph控制或管理在規(guī)定的范圍，更優(yōu)選一邊連續(xù)地觀察培養(yǎng)基的ph，一邊將培養(yǎng)基的ph連續(xù)地控制、管理在規(guī)定的范圍。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，可以在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物之前對該微生物進行活化培養(yǎng)?；罨囵B(yǎng)的培養(yǎng)條件只要根據(jù)具有瓜氨酸產生能力的微生物的種類適當選擇即可，沒有特別限定。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液中對該微生物的菌體進行離心分離、膜分離等處理后，在本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法中也可以使用該菌體。

含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的組合物的制造方法

本發(fā)明的含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的組合物的制造方法的特征在于，將上述微生物在比通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)高的培養(yǎng)溫度下在添加了精氨酸的原料中進行發(fā)酵。上述培養(yǎng)溫度具體而言為40℃以上且48℃以下，優(yōu)選為42℃以上且47℃以下，更優(yōu)選為44℃以上且46℃以下。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述培養(yǎng)溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，能夠提供上述微生物的瓜氨酸產生能力提高的方法，將本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物在40℃以上且48℃以下、優(yōu)選42℃以上且47℃以下、更優(yōu)選44℃以上且46℃以下的溫度進行發(fā)酵。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，上述發(fā)酵溫度為40℃以上且70℃以下，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃。此時，本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物可以使用通過對由本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法得到的培養(yǎng)物或組合物進行適當處理而得到的提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物。

如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案的原料是添加了精氨酸的原料。通過以這樣的原料的組成(混合)對微生物進行發(fā)酵，能夠有效地產生瓜氨酸。關于該理由，認為與在本發(fā)明的含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法中說明的理由相同。

在本發(fā)明的含有提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法中，可以不從含有瓜氨酸的培養(yǎng)基中使瓜氨酸分離而直接利用培養(yǎng)基作為含瓜氨酸組合物，或者也可以利用通過期望的操作(例如，離心分離、膜分離等)進行了處理的培養(yǎng)基作為含瓜氨酸組合物。

本發(fā)明的精氨酸的添加量只要從能夠制備、制造瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選相對于原料為0.5～5質量％，更優(yōu)選為0.7～4質量％，進一步優(yōu)選為1～3質量％。

本發(fā)明的精氨酸的添加方法只要能夠對培養(yǎng)基無菌地添加(混合)精氨酸即可，沒有特別限定，可以在對原料添加精氨酸后對該原料進行加熱殺菌、過濾滅菌，或者也可以另行制備精氨酸水溶液，對該精氨酸水溶液進行加熱殺菌、過濾滅菌后，對原料添加該精氨酸水溶液。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中和/或在培養(yǎng)途中間斷地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中或者在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。由此，能夠提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的瓜氨酸產生能力。此時，對具有瓜氨酸產生能力的微生物而言，優(yōu)選與充分濃度的精氨酸接觸的時間長。因此，優(yōu)選在培養(yǎng)之前將精氨酸添加(混合)到培養(yǎng)基或原料中，更優(yōu)選在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中，并且在培養(yǎng)途中間斷地(例如，每次添加預定量)或連續(xù)地(例如，少量緩慢地添加)將精氨酸添加(追加)到培養(yǎng)基中，尤其是進一步優(yōu)選在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。由此，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，能夠提高從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，可以在使用具有瓜氨酸產生能力的微生物進行發(fā)酵之前對該微生物進行活化培養(yǎng)。活化培養(yǎng)的培養(yǎng)條件只要根據(jù)具有瓜氨酸產生能力的微生物的種類適當選擇即可，沒有特別限定。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從含有提高了精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的具有瓜氨酸產生能力的微生物的組合物中對該微生物的菌體進行離心分離、膜分離等后，本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法可以使用該菌體。

提高了微生物濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法

本發(fā)明的提高了微生物濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法的特征在于，將上述微生物在通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)的培養(yǎng)溫度下在ph處于5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其特征在于，將上述微生物在35℃以上且48℃以下、優(yōu)選38℃以上且48℃以下、更優(yōu)選40℃以上且48℃以下、進一步優(yōu)選42℃以上且47℃以下、特別優(yōu)選44℃以上且46℃以下的培養(yǎng)溫度下在ph處于5以上且7以下范圍、優(yōu)選ph處于5以上且6.5以下范圍、更優(yōu)選ph處于5以上且6以下范圍、進一步優(yōu)選ph處于5.5以上且6以下范圍的添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。即，在此，可以在適于具有瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)的溫度(例如，最佳溫度)下對上述微生物進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，其特征在于，將上述微生物在35℃以上且70℃以下的培養(yǎng)溫度(在此，下限優(yōu)選為38℃，更優(yōu)選為40℃，進一步優(yōu)選為42℃，特別優(yōu)選為44℃，上限優(yōu)選為68℃，進一步優(yōu)選為65℃)下在ph處于5以上且7以下范圍、優(yōu)選ph處于5以上且6.5以下范圍、更優(yōu)選ph處于5以上且6以下范圍、進一步優(yōu)選ph處于5.5以上且6以下范圍的添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，能夠提供一種上述微生物的濃度(菌體濃度)的提高方法，將本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物在35℃以上且48℃以下、優(yōu)選38℃以上且48℃以下、更優(yōu)選40℃以上且48℃以下、進一步優(yōu)選42℃以上且47℃以下、特別優(yōu)選44℃以上且46℃以下的溫度進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，能夠提供一種上述微生物的濃度(菌體濃度)的提高方法，將上述微生物在35℃以上且70℃以下的培養(yǎng)溫度(在此，下限優(yōu)選為38℃，更優(yōu)選為40℃，進一步優(yōu)選為42℃，特別優(yōu)選為44℃，上限優(yōu)選為68℃，進一步優(yōu)選為65℃)下進行培養(yǎng)。此時，本發(fā)明的具有瓜氨酸產生能力的微生物可以使用通過對由本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法得到的培養(yǎng)物或組合物進行適當處理而得到的提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的微生物。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，能夠提供一種上述微生物的濃度(菌體濃度)的提高方法，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，使用ph處于5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基，優(yōu)選使用ph處于5以上且6.5以下范圍的培養(yǎng)基，更優(yōu)選使用ph處于5以上且6以下范圍的培養(yǎng)基，進一步優(yōu)選使用ph處于5.5以上且6以下范圍的培養(yǎng)基。由此，能夠提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的濃度(菌體濃度)，能夠提高瓜氨酸產生能力。此時，優(yōu)選通過添加堿來調節(jié)培養(yǎng)基的ph，更優(yōu)選使用精氨酸或堿金屬氫氧化物作為堿。

本發(fā)明的精氨酸的添加量只要從能夠制備、制造瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選相對于培養(yǎng)基為0.5～5質量％，更優(yōu)選為0.7～4質量％，進一步優(yōu)選為1～3質量％。

對于本發(fā)明的一個實施方案，“在ph為5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)”優(yōu)選是指從培養(yǎng)初期到結束為止，培養(yǎng)基的ph處于5以上且7以下范圍，并不是指從培養(yǎng)初期到結束為止，培養(yǎng)基的ph一定總是處于5以上且7以下范圍。即，只要以在培養(yǎng)基的ph處于5以上且7以下范圍的狀態(tài)下于足以提高菌體濃度的時間進行培養(yǎng)即可，具體而言，以1～60小時、優(yōu)選以2～48小時、更優(yōu)選以3～36小時、進一步優(yōu)選以4～24小時進行培養(yǎng)即可。

堿的添加方法只要從能夠將培養(yǎng)基的ph控制或管理在規(guī)定的范圍的條件中適當選擇即可，沒有特別限定。例如，優(yōu)選使用ph計和計算機等一邊間斷或連續(xù)地觀察培養(yǎng)基的ph，一邊將培養(yǎng)基的ph控制或管理在規(guī)定的范圍，更優(yōu)選一邊連續(xù)地觀察培養(yǎng)基的ph，一邊將培養(yǎng)基的ph控制或管理在規(guī)定的范圍。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，可以在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物之前對該微生物進行活化培養(yǎng)?；罨囵B(yǎng)的培養(yǎng)條件只要根據(jù)具有瓜氨酸產生能力的微生物的種類適當選擇即可，沒有特別限定。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，從提高了菌體濃度的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液中對該微生物的菌體進行離心分離、膜分離等處理后，在本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法或含瓜氨酸組合物的制造方法中可以使用該菌體。

在本發(fā)明的一個實施方案中，在使用精氨酸作為堿時，該精氨酸與本發(fā)明的瓜氨酸的制備方法、本發(fā)明的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法等中添加于培養(yǎng)基的精氨酸是共同的。因此，在上述的制備方法等中將精氨酸過量地添加于培養(yǎng)基時，當該培養(yǎng)基的ph變化成堿側，該培養(yǎng)基的ph有時大幅偏離5以上且7以下范圍。如上將精氨酸過量地添加于培養(yǎng)基時，一定程度提高了瓜氨酸產生能力，因此，若僅以提高瓜氨酸產生能力為目的，則可以允許，但有時無法充分提高菌體濃度。因此，在這樣的情況下，雖然提高了每個具有瓜氨酸產生能力的微生物(菌體)的瓜氨酸的產生量(瓜氨酸的相對量)，但有可能無法充分提高每個含有該微生物的培養(yǎng)液(培養(yǎng)基)的瓜氨酸的產生量(瓜氨酸的絕對量)，因此，需要注意。

提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率且提高了微生物的濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法

本發(fā)明的提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率且提高了微生物的濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備方法的特征在于，將上述微生物在比通常(微生物發(fā)酵的最佳溫度)高的培養(yǎng)溫度下在ph處于5以上且7以下范圍的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其特征在于，將上述微生物在40℃以上且48℃以下、優(yōu)選42℃以上且47℃以下、更優(yōu)選44℃以上且46℃以下的培養(yǎng)溫度下在ph處于5以上且7以下范圍、優(yōu)選ph處于5以上且6.5以下范圍、更優(yōu)選ph處于5以上且6以下范圍、進一步優(yōu)選ph處于5.5以上且6以下范圍的添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。另外，根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，本發(fā)明的制備方法的特征在于，將上述微生物在40℃以上且70℃以下的溫度范圍(在此，優(yōu)選的上限為68℃，更優(yōu)選的上限為65℃，優(yōu)選的下限為42℃，更優(yōu)選的下限為43℃)下在ph處于5以上且7以下范圍、優(yōu)選ph處于5以上且6.5以下范圍、更優(yōu)選ph處于5以上且6以下范圍、進一步優(yōu)選ph處于5.5以上且6以下范圍的添加了精氨酸的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

即，通過并用本發(fā)明的提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備條件和本發(fā)明的提高了微生物濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液的制備條件，能夠制備提高了從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率且提高了微生物的濃度(菌體濃度)的含有具瓜氨酸產生能力的微生物的培養(yǎng)液。

在本發(fā)明的一個實施方案中，精氨酸向培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)的添加方法和培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)的ph調節(jié)(控制)方法只要能夠提高從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率且提高微生物的濃度(菌體濃度)，則能應用上述方法。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的一個實施方案，在培養(yǎng)具有瓜氨酸產生能力的微生物時，在培養(yǎng)之前將精氨酸添加到培養(yǎng)基中和/或在培養(yǎng)途中間斷地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中或者在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。由此，能夠提高具有瓜氨酸產生能力的微生物的瓜氨酸產生能力。此時，對具有瓜氨酸產生能力的微生物而言，優(yōu)選在培養(yǎng)開始時培養(yǎng)基的ph為中性左右。因此，優(yōu)選在培養(yǎng)之前不將精氨酸添加(混合)到培養(yǎng)基中，更優(yōu)選在培養(yǎng)之前不將精氨酸添加到培養(yǎng)基中且在培養(yǎng)途中間斷地(例如，將規(guī)定量一并添加)或連續(xù)地(例如，少量緩慢地添加)將精氨酸添加(追加)到培養(yǎng)基中，尤其是進一步優(yōu)選在培養(yǎng)途中連續(xù)地將精氨酸添加到培養(yǎng)基中。由此，在培養(yǎng)或發(fā)酵具有瓜氨酸產生能力的微生物時，能夠提高從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率且提高微生物的濃度(菌體濃度)。

本發(fā)明的精氨酸的添加量只要從能夠制備、制造瓜氨酸或含瓜氨酸組合物或者它們的加工品的條件中適當選擇即可，沒有特別限定，但優(yōu)選相對于培養(yǎng)基為0.5～5質量％，更優(yōu)選為0.7～4質量％，進一步優(yōu)選為1～3質量％。

實施例

以下，通過實施例對本發(fā)明進一步詳細地進行說明。但是，本發(fā)明并不限定于這些實施例。

在本發(fā)明的實施例中，菌體濃度通過“乳和乳制品的成分標準等相關省令(乳等省令)(日本)”中記載的乳酸菌數(shù)的測定方法來測定。其中，bcp培養(yǎng)基的培養(yǎng)溫度為30℃。另外，精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度通過hplc法來測定。

實施例1：乳酸菌和雙歧桿菌的精氨酸的代謝能力

對下述表1中記載的乳酸菌和雙歧桿菌調查精氨酸的代謝能力。首先，將mrs培養(yǎng)基或gam培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。然后，將精氨酸水溶液進行過濾滅菌，然后，添加到這些培養(yǎng)基中，調節(jié)精氨酸濃度為27mm。在這些經調節(jié)的培養(yǎng)基中以1重量％接種下述的表1所示的乳酸菌和雙歧桿菌的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液。對于乳球菌，使培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為16小時，在靜置狀態(tài)下進行需氧培養(yǎng)，對于其它菌體，使培養(yǎng)溫度為37℃、培養(yǎng)時間是16小時，在靜置狀態(tài)下進行需氧培養(yǎng)。

該結果如下述表1所示。對發(fā)酵乳桿菌jcm1173t、布氏乳桿菌ncimb8007t、乳酸乳球菌乳酸亞種jcm5805t和ifo12007確認精氨酸的代謝能力。

表1乳酸菌和雙歧桿菌的精氨酸代謝能力的比較

表1

表中，arg：精氨酸；cit：瓜氨酸；orn：鳥氨酸

實施例2：乳酸乳球菌乳酸亞種(lactococcuslactisssp.lactis)和乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種(lactococcuslactisssp.diacetylactis)的精氨酸的代謝能力

根據(jù)實施例1的結果，對于乳酸乳球菌乳酸亞種，2個菌株中2個菌株均確認到精氨酸的代謝能力。但是，對于這2個菌株，將精氨酸全部轉換為瓜氨酸后，該瓜氨酸的大部分轉換為鳥氨酸。

因此，接著，使用下述表2中記載的29株乳酸乳球菌乳酸亞種和作為乳酸乳球菌乳酸亞種的近緣種的乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種1株探索不將瓜氨酸轉換為鳥氨酸的菌株。表2中的no.1～no.29為乳酸乳球菌乳酸亞種，no.30為乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種。

首先，將mrs培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。然后，將精氨酸水溶液過濾滅菌，然后，添加到這些培養(yǎng)基中，調節(jié)精氨酸濃度為27mm。在這些經調節(jié)的培養(yǎng)基中以1重量％接種下述表2的菌株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液。對于這些菌株，使培養(yǎng)溫度為30℃、培養(yǎng)時間為16小時，在靜置狀態(tài)下進行需氧培養(yǎng)。

該結果如下述的表2所示。乳酸乳球菌乳酸亞種的29株菌株全部確認到精氨酸的代謝能力。但是，精氨酸的大部分被轉換為鳥氨酸，瓜氨酸相對于鳥氨酸的生產比率(“cit/orn”)為0.02～0.13這樣的低值。另外，對于乳酸乳球菌二乙酰乳酸亞種的1株菌株，未確認到精氨酸的代謝能力。

表2乳酸菌的精氨酸代謝能力的比較

表2

續(xù)表2

實施例3：在乳酸乳球菌乳酸亞種代謝精氨酸中，培養(yǎng)溫度(37℃、40℃)的影響

使培養(yǎng)溫度為37℃或40℃，除此以外，與實施例2同樣地對菌體進行培養(yǎng)，調查精氨酸的代謝能力。該結果如下述的表3所示。在此，查找cit/orn較高的菌株，挑選了6個菌株。

表3乳酸菌的精氨酸代謝能力和培養(yǎng)溫度的關系(mrs培養(yǎng)基)

表3

續(xù)表3

實施例4：還原脫脂乳中的乳酸乳球菌乳酸亞種的精氨酸的代謝能力的驗證(1)

根據(jù)實施例3的結果，查找cit/orn較高的菌株，挑選5個菌株來使用。即，對下述表4中記載的5個菌株調查精氨酸的代謝能力。此時，作為培養(yǎng)基，使用以1重量％添加了精氨酸的還原脫脂乳(脫脂奶粉的濃度：10重量％)(下文記為“1％arg+10％還原脫脂乳”)。

將下表4中記載的5個菌株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液20ml進行離心分離(8000rpm、10分鐘)，回收這5個菌株的菌體。然后，將“1％arg+10％還原脫脂乳”40ml以95℃、3分鐘進行殺菌，此時接種如上回收的5個菌株的菌體。另外，在還原脫脂乳中添加精氨酸時，首先，制備精氨酸的水溶液，用鹽酸調節(jié)ph后，與還原脫脂乳混合。對于這5個菌株，使培養(yǎng)溫度為40℃和43℃、培養(yǎng)時間為4小時和8小時，在靜置狀態(tài)下進行需氧培養(yǎng)。

該結果如下表4所示。在此，查找cit/orn較高的菌株，并且查找cit/orn較高的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。對于這些菌株，整體來說確認到培養(yǎng)溫度越高，而且培養(yǎng)時間越長，則cit/orn變得越高的傾向。

表4乳酸菌的精氨酸代謝能力和培養(yǎng)溫度·時間的關系(脫脂奶粉培養(yǎng)基)(1)

實施例5：還原脫脂乳中的乳酸乳球菌乳酸亞種的精氨酸的代謝能力的驗證(2)

將培養(yǎng)溫度從44.5℃、46℃、以及50℃開始以5度間隔升溫至70℃，除此以外，與實施例4同樣地對菌體進行培養(yǎng)，調查精氨酸的代謝能力。該結果如下述的表5所示。另外，根據(jù)實施例4的結果，查找cit/orn較高的菌株，挑選3個菌株來使用。

表5乳酸菌的精氨酸代謝能力和培養(yǎng)溫度·時間的關系(脫脂奶粉培養(yǎng)基)(2)

續(xù)表5

續(xù)表5

實施例6：使用了乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株或ols3818株的含有瓜氨酸的酸奶的制造

使用乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株或ols3818株制造含有瓜氨酸的發(fā)酵乳(酸奶)。即，調配下述的表6中記載的原料乳(酸奶基料)，以95℃、3分鐘進行殺菌。然后，在該原料乳中以2重量％添加保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合發(fā)酵起子作為酸奶發(fā)酵起子，并且添加乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株或ols3818株，在45℃下使其發(fā)酵，制造酸奶。需要說明的是，在此，作為乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株和ols3818株，將mrs培養(yǎng)基的培養(yǎng)液進行離心分離(8000rpm、10分鐘)，僅回收菌體來使用。此時，mrs培養(yǎng)基的使用量為與下述的表6中記載的原料乳的使用量相同的重量。

表6原料乳(酸奶基料)的組成(質量％)

*將精氨酸溶解于鹽酸溶液中，將溶解后的ph調節(jié)至5左右

使用乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株時，在5小時30分鐘酸度達到0.80％。另外，使用乳酸乳球菌乳酸亞種ols3818株時，在4小時30分鐘酸度達到0.83％。使用這2個菌株時，確認到發(fā)酵順利地進行。另外，這些發(fā)酵乳(酸奶)的風味和物性與通常產品、現(xiàn)有產品相比，沒有很大的差別。

對這些發(fā)酵乳(酸奶)的精氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸的濃度進行測定。該結果如下述的表7所示。確認到精氨酸的大部分被代謝，其大部分被轉換為瓜氨酸。即，明確了使用乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株或ols3818株，能夠制造以高濃度含有瓜氨酸的發(fā)酵乳(酸奶)。

表7酸奶中的乳酸菌的精氨酸的代謝能力

實施例7：從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株)的培養(yǎng)液的制備方法的研究(1)

對從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率(活性)高的培養(yǎng)液的制備方法進行研究。在上述的實施例中，將乳酸乳球菌在mrs培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)而制備培養(yǎng)液。作為其結果，若對乳酸乳球菌進行靜置培養(yǎng)，則觀察到隨著培養(yǎng)液的ph的降低，乳酸乳球菌的增殖停止，菌體濃度未提高。因此，一邊在培養(yǎng)液中添加堿來抑制培養(yǎng)液的ph降低、控制其ph，一邊將乳酸乳球菌在mrs培養(yǎng)基中進行攪拌培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))，由此研究對菌體濃度的影響。即，對通過將乳酸乳球菌在mrs培養(yǎng)基中進行ph控制培養(yǎng)，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中的每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高的可能性進行研究。另外，將mrs培養(yǎng)基于121℃、15分鐘進行滅菌。

將氫氧化鈉水溶液(naoh：10重量％)添加到培養(yǎng)液中，一邊將培養(yǎng)液的ph控制為5.5一邊將乳酸乳球菌ols3797株進行攪拌培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))，經時測定菌體濃度。具體而言，將乳酸乳球菌ols3797株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)以1重量％接種于mrs培養(yǎng)基進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、攪拌速度：200rpm)。該菌體濃度的經時變化如圖1所示。

采取從培養(yǎng)開始10、11、12小時后的ph控制培養(yǎng)的培養(yǎng)液，將這些培養(yǎng)液在冰水中冷卻保存。然后，將該培養(yǎng)液以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：8小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。此時，作為比較對照，將上述的培養(yǎng)液以5重量％接種于mrs培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如圖2和下述的表8所示。

表8.乳酸菌的瓜氨酸轉換效率和培養(yǎng)條件的關系

如上所述，確認到與在mrs培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)的情況相比，在mrs培養(yǎng)基中進行ph控制培養(yǎng)的情況時，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中的每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高。另一方面，與在mrs培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)的情況相比，在mrs培養(yǎng)基中進行ph控制培養(yǎng)的情況時，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中的每單位時間·單位菌體的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率沒有差別。即，可以判斷與靜置培養(yǎng)相比，ph控制培養(yǎng)的菌體濃度提高，但每單位菌體的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率沒有變化。需要說明的是，每單位時間·單位菌體的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率是從培養(yǎng)開始4小時后和8小時后的瓜氨酸的濃度除以起始的活菌數(shù)和培養(yǎng)時間(4小時和8小時)而得到的數(shù)值算出。

進而，對使用ph控制培養(yǎng)的培養(yǎng)開始12小時后的培養(yǎng)液的情況調查“1％arg+10％還原脫脂乳”中的從培養(yǎng)開始4小時后和8小時后的菌數(shù)。作為其結果，它們的菌數(shù)分別為1×10⁶cfu/ml和1×10⁴cfu/ml(cfu：菌落形成單位)，從培養(yǎng)開始隨著時間的經過，菌數(shù)降低。因此，在從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率的測定中，可以推測產生adi的可能性低，通過菌體自身所持有的adi，從精氨酸轉換成瓜氨酸。此時，從培養(yǎng)開始隨著時間的經過，adi的活性有可能降低若干，但從培養(yǎng)開始4小時和8小時后的轉換效率沒有很大的差別。

實施例8：從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亞種3797株)的培養(yǎng)液的制備方法的研究(2)

在實施例7中，若對乳酸乳球菌進行ph控制培養(yǎng)，則菌體濃度(菌數(shù))提高，但每單位時間·單位菌體的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率沒有變化。因此，在開始乳酸乳球菌的培養(yǎng)之前，對通過將精氨酸添加于mrs培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中的每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高的可能性進行研究。即，將乳酸乳球菌ols3797株在含有通常的mrs培養(yǎng)基和以0.5重量％含有精氨酸的mrs培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)，使用該培養(yǎng)液測定“1％arg+10％還原脫脂乳”中的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。在此，將mrs培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。

具體而言，將乳酸乳球菌3797株的活化培養(yǎng)液(培養(yǎng)溫度30℃、培養(yǎng)時間16小時)以1重量％接種于mrs培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)。然后，將該培養(yǎng)液20ml進行離心分離(8000rpm、10分鐘)，僅回收菌體，然后接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”40ml中，進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：4小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如下述的表9所示。

另一方面，將上述的活化培養(yǎng)液以1重量％接種于以0.5重量％含有精氨酸的mrs培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)。然后，將該培養(yǎng)液20ml進行離心分離(8000rpm、10分鐘)，僅回收菌體，然后，接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”40ml中，進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：4小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如下述的表9所示。

表9乳酸菌的瓜氨酸轉換效率和培養(yǎng)基組成的關系

如上所述，確認到與在通常的(現(xiàn)有的)mrs培養(yǎng)基中進行靜置培養(yǎng)的情況相比，在含有精氨酸的mrs培養(yǎng)基進行靜置培養(yǎng)的情況時，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中每單位時間、單位菌體的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高至2倍以上。

實施例9：從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株)的培養(yǎng)液的制備方法的研究(3)

在實施例8中，若將精氨酸添加于培養(yǎng)基，則乳酸乳球菌的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高。因此，在開始乳酸乳球菌的培養(yǎng)之前，對通過在將精氨酸添加于mrs培養(yǎng)基后進行ph控制培養(yǎng)，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高的可能性進行研究。即，將乳酸乳球菌ols3797株在以0.5重量％含有精氨酸的mrs培養(yǎng)基中進行ph控制培養(yǎng)，使用該培養(yǎng)液測定“1％arg+10％還原脫脂乳”中的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。在此，將mrs培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。然后，將精氨酸水溶液進行過濾滅菌后，添加于該培養(yǎng)基，以精氨酸濃度為0.5重量％的方式進行調整。

將氫氧化鈉水溶液(naoh：10重量％)添加到培養(yǎng)液中，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5，一邊對乳酸乳球菌ols3797株進行攪拌培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))，經時測定菌體濃度等。具體而言，將乳酸乳球菌ols3797株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)以1重量％接種于以0.5重量％含有精氨酸的mrs培養(yǎng)基后，添加naoh，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5一邊進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、攪拌速度：200rpm)。該菌體濃度、ph、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化如圖3所示。

如上所述，在開始乳酸乳球菌的培養(yǎng)之前，將精氨酸添加于培養(yǎng)基，結果培養(yǎng)開始時的培養(yǎng)基的ph上升至8.3。而且，認為由于該培養(yǎng)開始時(培養(yǎng)的初期)的培養(yǎng)基的ph的上升，菌株的增殖延遲。但是，在培養(yǎng)的后期(后半部分)，乳酸菌(菌體)順利地增殖，從培養(yǎng)開始10小時以后，精氨酸開始被消耗，在13小時后精氨酸濃度成為0。需要說明的是，在該培養(yǎng)中，最高到達的菌體濃度為2.7×10⁹cfu/ml，與實施例7相比，菌體濃度降低至一半(2分之1)以下。

采取從培養(yǎng)開始8、9、10、11、12、13小時后的培養(yǎng)液，將這些培養(yǎng)液在冰水中冷卻保存。然后，將該培養(yǎng)液以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：8小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如下述的表10所示。

表10乳酸菌的瓜氨酸轉換效率和ph控制培養(yǎng)的關系

如上所述，從培養(yǎng)開始11小時以后精氨酸的消耗急劇增加。確認到若使用這些精氨酸的消耗快的培養(yǎng)液，則從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高。

實施例10：從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株)的培養(yǎng)液的制備方法的研究(4)

在實施例9中，在開始乳酸菌(菌體)的培養(yǎng)之前，若將精氨酸添加于培養(yǎng)基，則從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率大幅提高，但與未添加精氨酸的情況相比，最高到達的菌體濃度降低。在此，認為若培養(yǎng)開始時的培養(yǎng)基的ph高，則最高到達的菌體濃度容易降低。因此，對通過在培養(yǎng)乳酸乳球菌的途中將精氨酸一并(間斷地)添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)進行ph控制培養(yǎng)，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高的可能性進行研究。在此，將mrs培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。

將氫氧化鈉水溶液(naoh：10重量％)添加到培養(yǎng)液中，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5一邊對乳酸乳球菌ols3797株進行攪拌培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))，經時測定菌體濃度等。此時，從培養(yǎng)開始10小時后，對精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)進行過濾滅菌，然后，添加于該培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，以精氨酸濃度為0.5重量％的方式進行調整。具體而言，將乳酸乳球菌ols3797株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)以1重量％接種于mrs培養(yǎng)基后，添加naoh，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5一邊進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、攪拌速度：200rpm)，并且從培養(yǎng)開始10小時后對精氨酸水溶液進行過濾滅菌，然后，添加于該培養(yǎng)基，以精氨酸濃度為0.5重量％的方式進行調整。該菌體濃度、ph、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化如圖4所示。

采取從培養(yǎng)開始8、10、12、13小時后的培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液在冰水中冷卻保存。然后，將該培養(yǎng)液以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：4.5小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如下述的表11所示。

表11乳酸菌的瓜氨酸轉換效率和精氨酸添加時間的關系

以上所述，最高達到的菌體濃度為7.1×10⁹cfu/ml，與實施例7相比，菌體濃度為大致相同。另一方面，與實施例9相比，從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率降低。

實施例11：從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率高的菌株(乳酸乳球菌乳酸亞種ols3797株)的培養(yǎng)液的制備方法的研究(5)

在實施例10中，若在培養(yǎng)乳酸菌(菌體)的途中將精氨酸一并(間斷地)添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)進行ph控制培養(yǎng)，則與通常(現(xiàn)有)的進行ph控制培養(yǎng)的情況相比，雖然最高到達的菌體濃度為大致相同，但與在開始乳酸菌(菌體)的培養(yǎng)之前，將精氨酸添加于培養(yǎng)基的情況相比，從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率降低。因此，對通過在培養(yǎng)乳酸乳球菌的途中一邊將精氨酸每次少量(連續(xù)地)添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)一邊進行ph控制培養(yǎng)，乳酸乳球菌的培養(yǎng)液中每單位容量的從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高的可能性進行研究。在此，將mrs培養(yǎng)基以121℃、15分鐘進行滅菌。

將精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)添加到培養(yǎng)液中，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5一邊對乳酸乳球菌ols3797株進行攪拌培養(yǎng)(ph控制培養(yǎng))，經時測定菌體濃度等。此時，從培養(yǎng)開始4小時后對精氨酸水溶液(精氨酸：10重量％)進行過濾滅菌，然后添加于該培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，以培養(yǎng)基的ph為5.5的方式進行調整。具體而言，將乳酸乳球菌ols3797株的mrs培養(yǎng)基的活化培養(yǎng)液(培養(yǎng)溫度：30℃、培養(yǎng)時間：16小時)以1重量％接種于mrs培養(yǎng)基后，添加精氨酸，一邊將培養(yǎng)液的ph控制在5.5一邊進行攪拌培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：30℃、攪拌速度：200rpm)，并且從培養(yǎng)開始4小時后對精氨酸水溶液進行過濾滅菌，然后，添加于該培養(yǎng)基，以培養(yǎng)基的ph為5.5的方式進行調整。該菌體濃度、ph、精氨酸濃度、瓜氨酸濃度、鳥氨酸濃度的經時變化如圖5所示。

采取從培養(yǎng)開始8、10、12、13小時后的培養(yǎng)液，將該培養(yǎng)液在冰水中冷卻保存。然后，將該培養(yǎng)液以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”進行靜置培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度：44.5℃、培養(yǎng)時間：4.5小時)，調查從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率。該結果如下述的表12所示。在此，表中，“培養(yǎng)物”是將培養(yǎng)液直接以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”的物質。另外，“上清液”是將離心分離培養(yǎng)液而得到的上清以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”的液體。進而，“細胞”是將離心分離培養(yǎng)液并除上清之后回收的菌體在－80℃冷凍保存，然后，將解凍的細胞以5重量％接種于“1％arg+10％還原脫脂乳”的物質。

表12乳酸菌的瓜氨酸轉換效率和精氨酸添加時間·ph控制培養(yǎng)的關系

在此，從培養(yǎng)開始4小時后，開始將精氨酸(中和劑、基質)添加于培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)，繼續(xù)直到培養(yǎng)結束。此時，在開始將精氨酸添加于培養(yǎng)基后的一段時間內，精氨酸立即轉換為鳥氨酸，但在培養(yǎng)的后半部分，若干精氨酸未轉換為鳥氨酸，直接蓄積。

如上所述，最高達到的菌體濃度為6.5×10⁹cfu/ml，與實施例7和實施例10相比，菌體濃度為大致相同。而且，與實施例9相比，從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率為大致相同。即，在此，菌體濃度提高，并且從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率提高。

另外，與直接使用菌體的培養(yǎng)液的情況相比，在僅回收菌體進行冷凍保存的情況下，從精氨酸向瓜氨酸的轉換效率也為大致相同。而且，從培養(yǎng)開始4～8小時后，精氨酸全部被代謝，精氨酸的大部分被轉換為瓜氨酸。

而且，與直接使用菌體的培養(yǎng)液的情況相比，在僅回收菌體來使用的情況下，在培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)中的添加濃度(接種量)減少至20分之1～50分之1左右。在此，由于在培養(yǎng)基中的添加濃度為5重量％，因此，在僅回收菌體來使用的情況下，可以估算在培養(yǎng)基中的添加濃度為0.25～0.1重量％。即，在一邊將精氨酸(作為中和劑)在培養(yǎng)途中連續(xù)地(例如，直到培養(yǎng)結束為止)添加，一邊進行ph控制培養(yǎng)來制備培養(yǎng)液的情況下，若僅回收菌體來使用，則能夠有效地制造以高濃度含有瓜氨酸的乳制品。