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一種快速鑒定乳酸菌產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的方法與流程

文檔序號:11145932閱讀:1616來源:國知局
一種快速鑒定乳酸菌產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的方法與制造工藝

本發(fā)明涉及一種快速鑒定乳酸菌產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體物瓜氨酸的方法,屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。



背景技術(shù):

乳酸菌是發(fā)酵食品或飲料(例如醬油、發(fā)酵香腸、黃酒等)中廣泛存在的一種微生物,其代謝產(chǎn)生的乳酸是一種風(fēng)味物質(zhì),因此對發(fā)酵起積極作用。但是,最近國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),部分乳酸菌能夠分解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸,而瓜氨酸又是廣泛存在于發(fā)酵食品中的一種致癌物—氨基甲酸乙酯(EC)的一種重要前體物質(zhì),尤其在消費者日常食用(飲用)較多的醬油和黃酒中,EC的含量相對較高。瓜氨酸由乳酸菌經(jīng)精氨酸脫亞胺酶途徑降解精氨酸形成,但是并非所有乳酸菌都具有該途徑,其存在表現(xiàn)為菌株特異性,即不同菌株降解精氨酸或產(chǎn)生瓜氨酸的能力不盡相同。

乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的編碼基因,除了arcA、arcB、arcC、arcD基因,部分乳酸菌如清酒乳桿菌還有arcR(調(diào)控基因),PTP(可能與瓜氨酸分泌和重吸收有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因),不同乳酸菌菌株arc基因簇排列順序和完整性可能有所不同。研究證明,各乳酸菌菌株降解精氨酸和產(chǎn)生瓜氨酸的能力差異根源在于arc基因簇的多態(tài)性。

目前,檢測乳酸菌是否產(chǎn)生氨基甲酸乙酯前體瓜氨酸的方法主要是菌株分離后純培養(yǎng),然后在含有精氨酸的培養(yǎng)基中生長一段時間(例如在添加精氨酸的MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵3天),離心取上清液,使用高效液相色譜檢測胞外精氨酸和瓜氨酸的含量,進而確定該菌是否具有產(chǎn)瓜氨酸的能力。此方法耗時較長,不僅需要配制流動相,還需要做標準曲線,檢測周期約1周左右,并不是一個快速的檢測方法。另一種方法是以簡并引物擴增arcA、arcB、、arcC基因的部分序列,該方法快速簡便,但是普適性差,主要是用于檢測希氏乳桿菌、短乳桿菌、酒酒球菌、戊糖片球菌、腸膜明串珠菌等來源于葡萄酒中的乳酸菌,對于從黃酒中分離的乳酸菌檢測效果很差,主要表現(xiàn)為以該引物檢測時,許多能夠產(chǎn)生瓜氨酸的乳酸菌都不能擴增出arcA和arcB,已有報道的這些引物在實際應(yīng)用時具有相當(dāng)大的局限性。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

為了解決上述問題,本發(fā)明提供一種快速檢測乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的方法,所述方法是以乳酸菌基因組DNA為模板,分別用引物對A和引物對B進行PCR,如果能夠得到分別為200~300bp、450bp~550bp的PCR產(chǎn)物,那么該乳酸菌具有精氨酸脫亞胺酶途徑,否則該乳酸菌不具有精氨酸脫亞胺酶途徑。

其中引物對A由核苷酸序列為SEQ ID NO.1和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的核苷酸片段組成,或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同時進行反向互補后得到的兩個核苷酸片段組成;所述引物對B由核苷酸序列為SEQ ID NO.3和核苷酸序列為SEQ ID NO.4的核苷酸片段組成,或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同時進行反向互補后得到的兩個核苷酸片段組成。

在一種實施方式中,所述乳酸菌包括乳酸乳球菌、彎曲乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、乳桿菌、短乳桿菌、魏斯氏菌、德氏乳桿菌、干酪乳桿菌、棒狀乳桿菌、檸檬明串珠菌、假腸膜明串珠菌、腸膜明串珠菌。

在一種實施方式中,所述200~300bp具體是指250bp;所述用450bp~550bp具體是指500bp。

在一種實施方式中,所述PCR的反應(yīng)體系為:DNA模板<500ng,上游引物和下游引物各0.2~1μM,10×Ex Taq Buffer 5μL,dNTP4μL,滅菌蒸餾水補至50μL。

在一種實施方式中,所述PCR的反應(yīng)條件為:預(yù)變性,94℃,4min;變性,94℃,35s;退火,50℃,35s,延伸,72℃,40s;變性、退火、延伸進行30個循環(huán),繼續(xù)延伸,72℃,10min,最后10℃保持直到取出。

在一種實施方式中,所述PCR產(chǎn)物的檢測是使用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種組合引物對,包括引物對A和引物對B;其中引物對A由核苷酸序列為SEQ ID NO.1和核苷酸序列為SEQ ID NO.2的核苷酸片段組成,或者是由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列同時進行反向互補后得到的兩個核苷酸片段組成;所述引物對B由核苷酸序列為SEQ ID NO.3和核苷酸序列為SEQ ID NO.4的核苷酸片段組成,或者是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的序列同時進行反向互補后得到的兩個核苷酸片段組成。

本發(fā)明還要求保護所述組合引物對在食品中乳酸菌檢測方面的應(yīng)用。

在一種實施方式中,所述食品包括發(fā)酵食品或飲料。

在一種實施方式中,所述食品是醬油、發(fā)酵香腸、醬油、黃酒等。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果:

本發(fā)明公開的引物特異性高、通用性好,檢測方法靈敏、準確、便捷,可以檢測不同食品來源不同種屬的乳酸菌,具有良好的食品安全檢測前景。

附圖說明

圖1為利用本發(fā)明設(shè)計的簡并引物檢測來源于黃酒發(fā)酵液的乳酸菌精氨酸脫亞胺酶途徑的凝膠圖像(A、B分別為利用兩對引物進行PCR擴增的產(chǎn)物),其中孔道M為2000bp marker(從上到下分別為2000、1000、750、500、250、100bp),孔道1-33依次為黃酒發(fā)酵液中分離的乳酸乳球菌1-20,彎曲乳桿菌1-21,發(fā)酵乳桿菌2-1,發(fā)酵乳桿菌2-17,發(fā)酵乳桿菌2-18,植物乳桿菌2-19,彎曲乳桿菌2-20,乳桿菌2-22,植物乳桿菌2-24,發(fā)酵乳桿菌2-28,短乳桿菌2-29,發(fā)酵乳桿菌2-32,短乳桿菌2-34,發(fā)酵乳桿菌2-36,發(fā)酵乳桿菌2-1-1,發(fā)酵乳桿菌2-1-17,乳桿菌2-1-19,魏斯氏菌2-1-26,魏斯氏菌4-15,魏斯氏菌4-19,短乳桿菌4-22,植物乳桿菌7-6,德氏乳桿菌7-13,發(fā)酵乳桿菌7-14,干酪乳桿菌14-1,發(fā)酵乳桿菌14-6,植物乳桿菌14-8,棒狀乳桿菌14-9,檸檬明串珠菌14-16,假腸膜明串珠菌1-5、檸檬明串珠菌1-6、腸膜明串珠菌1-15。

具體實施方案

下面是對本發(fā)明進行具體描述。

實施例1:

1、乳酸菌基因組DNA的提取:使用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程有限公司),根據(jù)說明書提取黃酒發(fā)酵液中分離的乳酸菌菌株的基因組DNA。

2、引物設(shè)計及PCR擴增:

設(shè)計了簡并引物對A和簡并引物對B;其中引物對A的上下游引物的核苷酸序列分別為5’-AACCAYGCHATGATGCAYYT-3’/5’-TTKGABCCRTCRTTCCATTG-3’,用于檢測arcA基因,產(chǎn)物長度為250bp;引物對B的上下游引物的核苷酸序列分別為5’-AYTCHGGKGTDGTTTGGAA-3’/5’-TCVGTMACTTCCATTTCHGT-3’,用于檢測arcB基因,產(chǎn)物長度為500bp;其中,Y=C/T,K=G/T,R=A/G,B=G/T/C,H=A/C/T,D=A/G/T。

乳酸菌菌株基因組DNA模板<500ng,上游引物和下游引物各0.2~1μM,10×Ex Taq Buffer5μL,dNTP 4μL,滅菌蒸餾水補至50μL。PCR擴增的條件為:預(yù)變性,94℃,4min;變性,94℃,35s;退火,50℃,35s,延伸,72℃,40s;變性、退火、延伸進行30個循環(huán),繼續(xù)延伸,72℃,10min,最后10℃保持直到取出。

3、瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物:如果使用引物對A和引物對B進行擴增,分別出現(xiàn)250bp、500bp大小的條帶,則說明該乳酸菌菌株具有精氨酸脫亞胺酶途徑,能夠利用精氨酸產(chǎn)瓜氨酸,其在發(fā)酵食品或飲料中就有產(chǎn)生一種致癌物-氨基甲酸乙酯(EC)的可能性;如果沒有相應(yīng)大小的條帶,則說明該乳酸菌不具有精氨酸脫亞胺酶途徑,不能利用精氨酸產(chǎn)瓜氨酸。

實施例2:本發(fā)明方法的有效性驗證

結(jié)合黃酒發(fā)酵過程中乳酸菌的檢測實例,對本發(fā)明作進一步說明,但本發(fā)明的保護范圍并非局限于此,也可以推廣到其他食品或飲料中乳酸菌的檢測。

如圖1所示,從黃酒發(fā)酵液中分離的33株乳酸菌(包括發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌、德氏乳桿菌、棒狀乳桿菌、檸檬明串珠菌、乳酸乳球菌等種屬的乳酸菌),采用實施例1的方法進行處理,有30株均能擴增出相應(yīng)大小的條帶,有3株無法檢測到相應(yīng)的條帶。

然后,將這些乳酸菌進行發(fā)酵并利用高效液相色譜檢測乳酸菌降解精氨酸、產(chǎn)瓜氨酸的能力,具體是:甘油保藏菌在MRS培養(yǎng)基中活化2次至OD600=0.8-1.0,轉(zhuǎn)接到MRS-Arg(添加5g/L精氨酸的MRS培養(yǎng)基,pH5.0),30℃靜置培養(yǎng)72h,然后10000rpm離心5min,取上清液,以5%TCA溶液稀釋1倍以沉淀上清液中的蛋白,再以高效液相色譜檢測樣品中精氨酸和瓜氨酸含量。HPLC檢測氨基酸的方法如下:使用安捷倫1260高效液相色譜,色譜柱為ODS HYPERSIL C-18column(250×4.6mm,5μm),流動相A為0.8%(w/v)乙酸鈉,0.5%(v/v)四氫呋喃的水溶液,流動相B為乙酸鈉:水:甲醇:乙腈=1:50:100:100。洗脫程序為0min,A:B=92:8;15-22min,A:B=40:60;22-25min,A:B=92:8。流速保持1mL/min,以保留時間定性,以峰面積定量。

測定結(jié)果顯示,上一步檢測到均能擴增出相應(yīng)大小的條帶的這30株乳酸菌在發(fā)酵72h后都能利用完5g/L的瓜氨酸,并產(chǎn)生一定量的瓜氨酸(不同菌株產(chǎn)量有事差異,多數(shù)菌株產(chǎn)量約100mg/L);而上一步檢測到無法擴增出相應(yīng)大小的條帶的3株菌,無法產(chǎn)生瓜氨酸。

除此之外,發(fā)明人還嘗試了大量其他來源的乳酸菌的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),如果使用本發(fā)明的引物對進行擴增能夠分別出現(xiàn)250bp、500bp左右大小的條帶的乳酸菌,經(jīng)發(fā)酵驗證后確實具有利用精氨酸和產(chǎn)瓜氨酸的性能;而經(jīng)檢測沒有相應(yīng)大小的條帶乳酸菌,經(jīng)發(fā)酵驗證后確實無法利用瓜氨酸和/或產(chǎn)瓜氨酸。

以上數(shù)據(jù)說明,本發(fā)明的簡并引物,具有較強的通用性、特異性和準確性。

實施例3:引物序列對檢測有效性、準確性的影響

發(fā)明人還采用了已有報道的來自Detection ofarc Genes Related with the Ethyl Carbamate Precursors in Wine Lactic Acid Bacteria文獻中的引物進行PCR擴增以檢測從黃酒中分離的乳酸菌能否產(chǎn)生瓜氨酸,結(jié)果顯示很多通過高效液相色譜檢測確定能夠產(chǎn)生瓜氨酸的菌株基因組不能擴增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物,說明該文獻中報道的引物并不適用于黃酒來源的乳酸菌的檢測。然而,用本發(fā)明中的引物檢測來源于黃酒中的乳酸菌產(chǎn)瓜氨酸是全部適用的,而且本發(fā)明還對其他來源(如酸奶)的乳酸菌進行檢測,結(jié)果也是與菌株產(chǎn)瓜氨酸能力吻合的,進一步說明本發(fā)明的檢測方法有效性高,適用性廣。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上,但其并非用以限定本發(fā)明,任何熟悉此技術(shù)的人,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi),都可做各種的改動與修飾,因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。

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