本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和藥物工業(yè)，特別地涉及具有針對登革病毒(DENV)的抗病毒特性的合成肽的設(shè)計和獲得。設(shè)計所述肽的一級結(jié)構(gòu)以有效地形成β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)和模擬該病毒的包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III(DIIIE)的功能性斑片。本發(fā)明還涉及包含這些合成肽的藥物組合物，其用于預(yù)防和/或治療由DENV引起的感染。

現(xiàn)有技術(shù)

DENV是黃病毒科(Flaviviridae)的成員，所述黃病毒科由具有正義單鏈核糖核酸(RNA)的有包膜病毒組成。黃病毒科由三個不同的屬構(gòu)成：黃病毒屬(Flavivirus)、丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus)和瘟病毒屬(Pestivirus)。黃病毒屬包括超過70種已知的病毒，其中許多在人或其他物種中引起重要的疾病。這些之中包括黃熱病毒(YFV)和DENV。感染人血清的黃病毒屬病毒是通過節(jié)肢動物媒介(例如蜱和蚊子)進(jìn)行傳播的，這使得這些疾病是非常難以根除的(Monath,T.P.,F.X.Heinz.1996.Flaviviruses,第961–1034頁.In:B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley(編者),Fields virology,第3版,vol.1.Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,Pa.)。

DENV是在熱帶地區(qū)大范圍流行的，并且其近期的再度出現(xiàn)在這些國家的公共衛(wèi)生中具有越來越大的重要性。據(jù)估計每年的感染為大約1億例；并且25億人生活在登革熱流行的地區(qū)(Gubler,D.J.(1998).Clin.Microbiol.Rev.11,480-496；Monath,T.P.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci USA 91,2395-2400)。在1990-1998年期間，向世界衛(wèi)生組織報告的登革出血熱(DHF)的病例的平均數(shù)是514,139例/年，包括15,000例死亡，雖然認(rèn)為DHF的真實發(fā)病率還要高至幾倍。然而，目前還不存在有商購可得的疫苗，也沒有針對DENV的特異性抗病毒治療。

術(shù)語“DENV”是指由在遺傳上和在抗原性上相關(guān)的四種病毒或血清型(DENV1－DENV4)組成的病毒復(fù)合體。DENV通過蚊子，主要通過埃及伊蚊(Aedes aegypti)傳播給人。感染引起存在變化的臨床表現(xiàn)：從無癥狀的和輕微的表現(xiàn)，例如無差別的發(fā)熱疾病，直至更嚴(yán)重的表現(xiàn)，例如DHF和可能致命的登革熱休克綜合征(DSS)。最嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)通常與由該病毒的兩種不同血清型引起的連續(xù)感染相關(guān)聯(lián)(KouríGP等人,(1987)Trans Roy Soc Trop Med Hyg,72:821-823；Halstead,S.B(2003).Adv.Virus Res.60:421-67)。該現(xiàn)象已通過由抗體介導(dǎo)的增強(qiáng)作用這一理論進(jìn)行了解釋，該理論基于通過在由靶細(xì)胞的Fc受體協(xié)助的病毒-抗體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞方面的增加而產(chǎn)生的病毒感染性的提高(Halstead SB.(1988).Science,239:476-481)。

病毒復(fù)制循環(huán)的第一步在于病毒吸在宿主細(xì)胞的表面上。已證明了DENV結(jié)合至可能構(gòu)成與細(xì)胞的初始相互作用位點的葡糖胺聚糖。還已證明了病毒結(jié)合至樹突細(xì)胞特異性細(xì)胞間粘附分子-3-抓捕性非整聯(lián)蛋白(DC-SIGN，Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin)，雖然可能的是這些分子的作用與在細(xì)胞表面上的病毒積累或者病毒在體內(nèi)散布至次級感染位點處相關(guān)。病毒向細(xì)胞中的生產(chǎn)性進(jìn)入通過由受體介導(dǎo)的胞吞作用而發(fā)生。在初始結(jié)合后，病毒與牽涉內(nèi)化過程的具有高親和力的受體和/或共同受體相互作用。一旦定位于胞吞區(qū)室中，pH的降低就誘導(dǎo)由病毒融合蛋白中的結(jié)構(gòu)變化所介導(dǎo)的內(nèi)體膜與病毒包膜膜的融合過程。該過程導(dǎo)致衣殼卸放到細(xì)胞質(zhì)中，其中RNA隨后被釋放。一旦在細(xì)胞質(zhì)中，RNA就通過其5’非翻譯區(qū)(5’UTR)與核糖體相互作用，其中發(fā)生它所編碼的病毒基因組的唯一開放讀碼框的翻譯。以該方式，合成出前體病毒多蛋白，其在黃病毒屬中包括三種結(jié)構(gòu)蛋白即衣殼蛋白(C)、膜蛋白(prM)和包膜蛋白(E)，以及非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-5)。該多蛋白通過病毒來源的和宿主細(xì)胞的蛋白酶來進(jìn)行共翻譯或翻譯后修飾，從而產(chǎn)生功能性的獨個病毒蛋白質(zhì)。與輔助因子相聯(lián)合的病毒RNA依賴性RNA聚合酶產(chǎn)生負(fù)義單鏈RNA拷貝，其反過來充當(dāng)用于合成正義單鏈基因組RNA的模板。參與復(fù)制的病毒蛋白質(zhì)與看起來與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的膜結(jié)構(gòu)相聯(lián)合。

在復(fù)制后，基因組RNA與核衣殼蛋白相聯(lián)合，并且在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜中，或者在由病毒所誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生包被有包含病毒蛋白質(zhì)的脂質(zhì)病毒包膜的未成熟病毒粒子的向著內(nèi)腔的芽體。通過胞吐途徑，包膜的蛋白質(zhì)被糖基化和成熟化，從而最后產(chǎn)生成熟病毒粒子向細(xì)胞外空間的釋放。

DENV的基因組由長度為大約11kb的正義單鏈RNA組成(Henchal,E.A.&Putnak,J.R.(1990).Clin.Microbiol.Rev.3,376-396)。病毒基因組編碼不間斷的開放讀碼框(ORF)，其大小根據(jù)每種病毒血清型(包括相同血清型的毒株)而變化(Yabar V.C.(2003).Rev.Perú.Med.Exp.Salud Publica 20,51-57)。關(guān)于結(jié)構(gòu)蛋白的基因位于朝向5’端，其中占據(jù)ORF的大約四分之一。在基因組的其余部分中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(Lindenbach,B.D.&Rice,C.M.(1999).J.Virol.73,4611-4621)。

DENV和其他黃病毒的蛋白E在與細(xì)胞受體的結(jié)合、膜的融合和病毒粒子的裝配中發(fā)揮著根本性的作用。因此，其特性是對于宿主范圍和毒力以及保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)來說重要的決定因素(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。

蛋白E具有53至54kDa的分子量，并且它是結(jié)構(gòu)多肽中最保守的。在血清型之間，相似性為60-70％。X射線晶體學(xué)(Modis,Y.,(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,6986-6991)和冷凍電子顯微鏡術(shù)(Kuhn,R.J.等人,(2002).Cell 108,717-725)的研究揭示，與在其他黃病毒中一樣，DENV的蛋白E在成熟病毒粒子的表面上形成二聚體。

在病毒粒子中，暴露于稍微酸性的pH(低于6.5)誘導(dǎo)該蛋白質(zhì)的不可逆的構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化在于二聚體的解離和其重新結(jié)合成三聚體。該構(gòu)象變化對于病毒膜與內(nèi)體膜的融合來說是必不可少的，所述融合在病毒粒子通過由受體所介導(dǎo)的胞吞作用而內(nèi)化到哺乳動物細(xì)胞中之后發(fā)生(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)。

在蛋白E的每個單體的大約500個氨基酸殘基中，80％構(gòu)成N-末端胞外結(jié)構(gòu)域的一部分。其余構(gòu)成跨膜區(qū)，其將蛋白E錨定在脂質(zhì)包膜中(Chambers,T.J.等人,(1990).Annu.Rev.Microbiol.44,649-688)，并且其通過具有大約53個殘基的莖區(qū)與N-末端胞外結(jié)構(gòu)域相連接(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)。使蛋白E的可溶性片段成形的多肽鏈折疊為三個結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域：β-片層類型折疊的中心結(jié)構(gòu)域(結(jié)構(gòu)域I)、延長的二聚體化區(qū)域(結(jié)構(gòu)域II)和其結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白的折疊類型相似的第三區(qū)域(結(jié)構(gòu)域III)(Modis,Y.等人,(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,6986-6991)。

DIIIE是蛋白E的唯一的連續(xù)多肽。其位于朝向每個單體的末端羧基端，在氨基酸294和392之間。DIIIE的結(jié)構(gòu)與免疫球蛋白恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)非常相似(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。DIIIE的三級結(jié)構(gòu)包括在位于位置302和333處的兩個Cys殘基(其在所有黃病毒中是嚴(yán)格保守的)之間建立的二硫橋。

DIIIE通過具有10個殘基的、延伸的且柔韌的區(qū)域與結(jié)構(gòu)域I相連(Modis,Y.等人,(2004).Nature 427,313-319)，這允許DIIIE采取相對于其余結(jié)構(gòu)域而言的方向(Rey,F.A.等人,(1995).Nature 375,291-298)。在二聚體至三聚體的轉(zhuǎn)換期間，DIIIE是遭受最顯著移位的結(jié)構(gòu)域，其中經(jīng)歷大約70°的旋轉(zhuǎn)和其質(zhì)量中心向著結(jié)構(gòu)域II的的移動。在DENV和其他黃病毒的DIIIE中，存在有大量的決定毒力、細(xì)胞向性和病毒宿主范圍的殘基(Rey,F.A.等人,(1995).Nature375,291-298)，以及構(gòu)成逃避中和突變的那些殘基(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。

許多來自對于DENV的蛋白E和病毒粒子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行的分析的數(shù)據(jù)，以及許多實驗證據(jù)暗示，DIIIE構(gòu)成蛋白E與細(xì)胞受體的相互作用區(qū)域的一部分。在所述結(jié)構(gòu)特征之中，要強(qiáng)調(diào)作為病毒粒子的最突出區(qū)域的結(jié)構(gòu)域的定位，其在與受體位點的相互作用中賦予更高度的可接近性(Mukhopadhyay,S.等人,(2005).Nat.Rev.Microbiol.3,13-22)。另外，該結(jié)構(gòu)域所具有的免疫球蛋白類型的特有結(jié)構(gòu)暗示了其在與細(xì)胞受體的相互作用中的可能作用，因為已在多種多樣的細(xì)胞粘附蛋白中發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)構(gòu)。暗示了DIIIE與受體的可能結(jié)合的其他結(jié)構(gòu)特征為在該結(jié)構(gòu)域中存在帶正電荷的親水性斑片。這些區(qū)域由殘基284-310和386-411形成，其可能牽涉該結(jié)構(gòu)域與硫酸肝素分子的結(jié)合(Modis,Y.等人,(2005).J.Virol.79,1223-1231)。

用通過重組脫氧核糖核酸(DNA)技術(shù)獲得的該相同血清型的DIIIE分子來進(jìn)行的研究證明，它們能夠直接結(jié)合至C6/36和BHK21細(xì)胞的表面并且阻斷病毒感染(Hung,J.J.等人,(2004).J.Virol.78,378-388)。

以前的研究已證明，DIIIE以30μΜ或更低的表觀解離常數(shù)(KD)(取決于所述黃病毒)特異性地與宿主細(xì)胞結(jié)合(Halstead,S.B.等人,(2005).Vaccine 23,849-856)。另一方面，已知以最高效率阻斷DENV與宿主細(xì)胞的結(jié)合的單克隆抗體是識別DIIIE的那些單克隆抗體，這間接地表明，該結(jié)構(gòu)域構(gòu)成蛋白E與細(xì)胞受體的相互作用區(qū)域的一部分(Thullier,P.等人,(2001).J.Gen.Virol.82,1885-1892)。

DENV向宿主細(xì)胞中的進(jìn)入依賴于這些顆粒與在細(xì)胞表面上的特異性受體分子所建立的相互作用。在對DENV的受體進(jìn)行的研究過程中獲得的證據(jù)表明，這些分子可以在不同的細(xì)胞類型之間以及對于不同的病毒血清型而變化。從關(guān)于DENV的受體的研究中積累的許多結(jié)果暗示，該病毒利用多分子復(fù)合物，其中某些分子起初級受體的作用，從而將病毒顆粒集中在細(xì)胞表面上并促進(jìn)隨后與胞吞受體的相互作用。

阻斷病毒向細(xì)胞中的進(jìn)入是一個令人感興趣的抗病毒策略，因為它代表了用于阻止感染開始的初級屏障。通過X射線晶體學(xué)和核磁共振波譜法來進(jìn)行的分析已提供了該屬的三種結(jié)構(gòu)蛋白的原子分辨率結(jié)構(gòu)：蛋白C、蛋白prM和蛋白E。這些研究已招致抑制病毒復(fù)制的備選方法，其朝著阻斷對于病毒的有效繁殖來說必需的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換。在蛋白E與受體分子和中和抗體的相互作用的基礎(chǔ)上，已從結(jié)構(gòu)研究中涌現(xiàn)出了數(shù)種特異性區(qū)域，作為用于針對DENV的抗病毒藥物的合理設(shè)計的靶標(biāo)。

已提出被稱為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein)(LRP1)的膜蛋白是DENV的推定的胞吞受體，并且其是對于抗病毒藥物的設(shè)計來說有吸引力的靶標(biāo)(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。LRP1是有效地介導(dǎo)多于30種天然配體的胞吞作用的受體，并且還是次要群鼻病毒的受體。該受體直接地和間接地(這由能夠同時與病毒相結(jié)合并與受體相互作用的載體分子來介導(dǎo))與病毒的DIIIE相結(jié)合。蛋白質(zhì)α2-巨球蛋白(α2M)的情況就是如此，所述α2M結(jié)合DIIIE并且是LRP1的配體。

已顯示，基于DIIIE的結(jié)構(gòu)的β-發(fā)夾肽在體外和在體內(nèi)抑制登革病毒感染(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。這些肽由DIIIE的FGβ-發(fā)夾序列的片段組成，其序列依賴于病毒血清型而變化。它們通過在所選擇的發(fā)夾片段的N-末端和C-末端處所添加的兩個半胱氨酸之間所形成的二硫橋而環(huán)化。該系列的具有最高抗病毒活性的肽為肽HDIII3CL(其序列相應(yīng)于DENV3)，并且抑制由四種血清型引起的病毒感染。

然而，所述系列的肽具有重大的缺點。首先，效力是非常低的，在Vero細(xì)胞中的感染抑制測定試驗之中所測定的HDIII3CL的50％抑制濃度(IC50)的值為15μΜ(對于DENV1)、20μΜ(對于DENV2和DENV3)和40μΜ(對于DENV4)。這樣的效力值使得在這些分子的臨床開發(fā)中成功是不可能的。所希望的效力值應(yīng)當(dāng)至少在亞μΜ范圍內(nèi)，優(yōu)選地在nM或更優(yōu)范圍內(nèi)。

這些分子的另一個可以看到的缺點是，鏈間環(huán)的區(qū)域為抗病毒抗體應(yīng)答的免疫顯性表位(Matsui K.等人,(2009)Virology 384(1):16-20)。在公開文本Huerta G.V.等人,WO 2007/124698這一文獻(xiàn)中證明，中和抗體3H5識別包含鏈間環(huán)的肽。一部分抗結(jié)構(gòu)域應(yīng)答在血清型之間具有交叉反應(yīng)性。這樣的由先前的感染所誘導(dǎo)的交叉反應(yīng)性抗體可以具有針對該肽的中和效應(yīng)，結(jié)果造成為了抵消所述中和效應(yīng)，進(jìn)一步需要增加治療劑量。

根據(jù)先前所提及的要素，針對DENV的具有高效力(優(yōu)選地在nM范圍內(nèi))的抗病毒藥物的可得性是一個尚未解決的問題。本發(fā)明正是針對該目標(biāo)。

發(fā)明描述

本發(fā)明通過提供經(jīng)由對以前鑒定出的肽的效力進(jìn)行優(yōu)化而產(chǎn)生的抑制DENV的新型β-發(fā)夾肽而解決了前面所提及的問題。本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的特征在于，具有選自由下列各項組成的組的氨基酸序列：SEQ ID No.1至SEQ ID No.9，或者與所述序列類似的序列。

本發(fā)明的中心目標(biāo)是設(shè)計抑制DENV感染的肽，其特征在于，展示出高的(至少在亞μΜ范圍內(nèi)，優(yōu)選地在nM或更優(yōu)范圍內(nèi))效力。高的效力是對于取得足夠低的治療劑量來說必需的特性。目前在臨床中針對其他病理學(xué)狀況進(jìn)行使用的治療性合成肽是高度強(qiáng)有力的，其中具有在nM/亞nΜ范圍內(nèi)的效用值(IC50，50％有效濃度(EC50)，等等)，并且也是高度特異性的，其中具有低的毒性。具有微小效力的肽需要更高的治療劑量，這可以具有重大的缺點。例如，高劑量的使用由于非特異性相互作用而增加了副作用的可能性。而且，較大的肽濃度可能與聚集問題相關(guān)聯(lián)，在生產(chǎn)過程期間和在其體內(nèi)施用期間，所述聚集通過與血清蛋白質(zhì)的非特異性相互作用而發(fā)生。高劑量增加了免疫原性/抗原性問題的可能性。抗肽免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，特別是抗肽抗體的產(chǎn)生，可以中和所述肽的治療活性，尤其是在第二次施用中或者在足夠長的治療時間之后，從而導(dǎo)致需要進(jìn)一步增加劑量。

相反地，低的有效劑量的使用具有經(jīng)濟(jì)上的優(yōu)點，在生產(chǎn)成本方面和在待由患者支付的價格方面。肽的合成技術(shù)比基于小分子的藥物的合成更昂貴。所有這些可能限制能夠獲得針對登革熱的抗病毒藥物的患者或人員的數(shù)目，尤其是如果治療劑量是高的話。

肽的效力首先取決于該肽與生物學(xué)上重要的靶受體結(jié)合的親和力。模擬蛋白質(zhì)表面的功能性斑片的活性肽的設(shè)計是一個并不普通的問題，這是由于球狀蛋白質(zhì)的功能性斑片通常是形貌學(xué)的(topographic)(牽涉多肽鏈的多于一個區(qū)段)和構(gòu)象的(在與受體的相互作用中采取非常確定的空間結(jié)構(gòu))。相反，通常具有10-20個氨基酸的相應(yīng)于蛋白質(zhì)的短區(qū)段的肽在溶液中是柔韌的，并且不采取非常確定的唯一結(jié)構(gòu)。

特別地，其序列相應(yīng)于折疊蛋白質(zhì)的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的肽通常在溶液中不是在結(jié)構(gòu)上穩(wěn)定的，其中平衡地共存在多種構(gòu)象。一般地，所述肽在溶液中的構(gòu)象可以作為在兩個狀態(tài)之間的平衡來看待：折疊狀態(tài)(其三維結(jié)構(gòu)與該蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)相一致)和解折疊或變性狀態(tài)(該肽在溶液中所采取的多種非天然構(gòu)象的全體)。當(dāng)肽的發(fā)夾結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定(和與在蛋白質(zhì)的天然折疊中所采取的結(jié)構(gòu)越相像)時，與受體的相互作用的親和力就將會越大，這歸因于更小的與肽-受體復(fù)合物的形成過程相關(guān)聯(lián)的構(gòu)象熵的損失。

如果假設(shè)在溶液中肽采取雜亂的結(jié)構(gòu)并且結(jié)合過程通過構(gòu)象選擇機(jī)制而發(fā)生，那么肽與受體的結(jié)合過程的自由能變化可以表示為與肽的折疊相關(guān)聯(lián)的自由能變化和其與結(jié)合位點偶聯(lián)(剛性的，在偶聯(lián)已經(jīng)折疊的肽這一意義上來說)的能量之和。

因此，在這樣的情況下，可以通過下列方式來實現(xiàn)在與結(jié)合過程相關(guān)聯(lián)的自由能差方面的增加：a)通過將原始序列的氨基酸置換為對于肽在溶液中折疊的穩(wěn)定性正面地作出貢獻(xiàn)的其他氨基酸來對肽進(jìn)行修飾(尤其是當(dāng)被置換的殘基不直接參與與受體的接觸表面時)，和b)通過優(yōu)化在肽與受體之間的分子間相互作用來增加偶聯(lián)能。

對于肽HDIII3CL(SEQ ID No.10，表1)的序列進(jìn)行的檢查揭示了數(shù)種能夠關(guān)于發(fā)夾類型的折疊的穩(wěn)定性進(jìn)行改善的特征。例如：a)位于F和Gβ-鏈這些區(qū)段中的氨基酸Asn3和Asn16的存在，其具有非常低的形成β-片層的傾向(圖1E)；b)在所述鏈之間的具有六個殘基的長環(huán)；c)位于所述鏈間環(huán)中的兩個甘氨酸Gly7和Gly9的存在。氨基酸天冬酰胺是β-結(jié)構(gòu)的差的形成者，具有對于β-鏈而言非常低的固有傾向值和對于以正的扭轉(zhuǎn)角為特征的主鏈的環(huán)和結(jié)構(gòu)的偏愛(Swindells MB等人,(1995).Nat Struct Biol.,2(7):596-603)。HDIII3CL的環(huán)的大小以四個殘基而大于兩個殘基的最佳值(Branden C.&Tooze J.Introduction to protein structure.New York:Carland Publishing,1991)。此外，一般地，在蛋白質(zhì)的環(huán)中插入殘基導(dǎo)致與與其閉合相關(guān)聯(lián)的熵成本，所述熵成本隨著插入的大小而增加(Chan,H.S.&Dill,K.A.(1988).J.Chem.Phys.90:492-509；Nagi AD&Regan L.(1997)Fold Des.,2(1):67-75)。另外，甘氨酸是在折疊過程中損失最多構(gòu)象熵的殘基，因為它不具有與其余天然氨基酸相關(guān)聯(lián)的對于主鏈扭轉(zhuǎn)角的限制。

導(dǎo)致本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的更大的折疊穩(wěn)定性的序列設(shè)計的基礎(chǔ)在于，引入對于可修飾位置具有高的結(jié)構(gòu)傾向的殘基(比在待形成β-發(fā)夾類型的結(jié)構(gòu)的原始序列中存在的殘基更大的傾向)。待在β-發(fā)夾的折疊中占據(jù)特定位置的殘基類型的結(jié)構(gòu)傾向可以通過所述殘基類型在存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中的經(jīng)由實驗測定的結(jié)構(gòu)的β-發(fā)夾的所述位置處的出現(xiàn)頻率來估計。從數(shù)學(xué)上，計算所觀察到的所述殘基類型在該特定位置處的出現(xiàn)頻率與所預(yù)期的頻率(根據(jù)該殘基在數(shù)據(jù)庫中的相對豐度)之比的對數(shù)。

在本發(fā)明中被定義為“可修飾的”位置為：

a)該肽的β-發(fā)夾的第一條β-鏈的殘基，其相應(yīng)于DIIIE的結(jié)構(gòu)的F鏈的內(nèi)面(未暴露于溶劑的殘基)。這些殘基占據(jù)在該肽的第一條β-鏈和第二條β-鏈(相應(yīng)于該結(jié)構(gòu)域的G鏈的鏈)的主鏈的供者原子和受者原子之間建立氫橋的位置(HB位置)；

b)鏈間環(huán)；

c)該肽的第二條β-鏈(相應(yīng)于該結(jié)構(gòu)域的G鏈)的HB位置，除了相應(yīng)于保持不變的DIIIE的殘基TRP391(相應(yīng)于DENV2的編號)的位置外。對于其余的位置，允許用優(yōu)選地具有疏水特征的殘基來進(jìn)行改變；

d)最接近所述環(huán)的F鏈的非HB位置(NHB位置)；

e)第二條鏈(相應(yīng)于G鏈)的第一個HB位置。除了具有高的結(jié)構(gòu)傾向的殘基外，由于功能原因還允許Lys，因為該殘基模擬在所述四種血清型的DIIIE中在形貌學(xué)上保守的并且在與受體LRP1/α2M*(激活的α2M)的結(jié)合中可能重要的賴氨酸(Lys 385，相應(yīng)于DENV2的編號)的作用。

在(a)點中所定義的本發(fā)明的可修飾殘基為在DIIIE的結(jié)構(gòu)中對于溶劑來說不可接近的并因此不參與該結(jié)構(gòu)域與在病毒感染中重要的受體的相互作用界面的殘基。因此，它們可以被置換為對于折疊的穩(wěn)定性來說更有利的殘基。

鏈間環(huán)的殘基(b)被認(rèn)為是可修飾的，因為通過比較所述四種血清型的序列，它是可變區(qū)，這表明并不需要該環(huán)的任何區(qū)段的嚴(yán)格保守來保證與受體的相互作用。這得到了下述事實的支持：肽HDIII3CL抑制該病毒的四種血清型的感染，并且受體α2M*/LPR1的阻斷通常引起不依賴于血清型的抗病毒效應(yīng)。本發(fā)明的鏈間環(huán)的優(yōu)選變體由β-轉(zhuǎn)角的兩個中心殘基組成，其中該轉(zhuǎn)角的位置1和4與鄰近的β-鏈的末端的殘基相一致。所述環(huán)的該變體對于折疊的穩(wěn)定性來說是有利的，短的連接環(huán)在β-發(fā)夾中是最常見的(Branden C.&Tooze J.New York:Carland Publishing,1991)，并且該鏈間環(huán)的大小的減小降低了與變性狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的構(gòu)型熵，其隨著多肽鏈的大小增加而變得更大。

具有兩個殘基(本發(fā)明的環(huán)的優(yōu)選的長度)的環(huán)的中心殘基之一可以作為DENV3的DIIIE的殘基Lys385的模擬殘基而擔(dān)當(dāng)功能性作用。在本發(fā)明的某些肽中，在具有與DIIIE的FGβ-發(fā)夾相同的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽中，在IIP型β-轉(zhuǎn)角的情況下，所述功能性作用由位于該環(huán)的第二個位置處的賴氨酸殘基(占據(jù)該轉(zhuǎn)角的第二個中心位置)來執(zhí)行。在另一種肽中，在該肽的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與DIIIE的FGβ-發(fā)夾的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)反向的情況下，所述功能性作用由位于該環(huán)的第一個位置(IIP型β-轉(zhuǎn)角的位置2)處的d-Lys殘基(氨基酸賴氨酸的D-立體異構(gòu)體)來擔(dān)當(dāng)。

在(c)點下所定義的可修飾殘基位于該發(fā)夾的與(a)點的那些相同的面，并因此與這些是鄰近的并且在主鏈的原子之間形成氫橋。在該結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)中的相應(yīng)殘基部分地暴露于溶劑，因為G鏈?zhǔn)铅?片層的邊緣的鏈。等價于由殘基Trp391(相應(yīng)于DENV2的編號)所占據(jù)的位置的β-發(fā)夾的位置在本發(fā)明中不是可修飾殘基，因為該殘基在DENV的四種血清型中是嚴(yán)格保守的并因此可能是功能性的。在實施例2(表2)中證明，該位置在肽HDIII3CL(和表1的肽HDIII3CL2)的抗病毒活性中是必需的，因為將該殘基置換成丙氨酸引起抗病毒效應(yīng)的喪失。在第二條鏈的第一個位置(作為(e)而提及的可修飾殘基)處，允許氨基酸賴氨酸，目的是可以構(gòu)成DENV3的DIIIE的殘基Lys385的結(jié)構(gòu)/功能的模擬物，所述殘基Lys385是在該結(jié)構(gòu)域與蛋白質(zhì)α2M*(其是推定的胞吞受體α2M*/LRP1的組分)的相互作用中必需的陽離子殘基。

作為(d)而提及的可修飾位置位于相應(yīng)于該結(jié)構(gòu)域的暴露表面的那一面，雖然其在血清型之間不是嚴(yán)格保守的(圖1E)。

為了設(shè)計經(jīng)優(yōu)化的序列，在每一個可修飾位置處，選取具有最高的結(jié)構(gòu)偏好參數(shù)值的殘基。這些參數(shù)是從在具有已知結(jié)構(gòu)的有著8個殘基的片段中每個氨基酸的觀察頻率開始來進(jìn)行計算的，所述片段采取具有由兩個殘基組成的中心環(huán)的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)(所述片段的殘基4和5為β-轉(zhuǎn)角的兩個中心殘基)。通過使用具有大于的分辨率的非冗余蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)庫來進(jìn)行分析(WHAT IF的數(shù)據(jù)庫；Vriend,G.(1990),J.Mol.Graph.8,52-6)。偏好參數(shù)被定義為在發(fā)夾的一個位置處一種氨基酸類型的出現(xiàn)次數(shù)與根據(jù)在數(shù)據(jù)庫中該殘基的相對豐度而預(yù)期的次數(shù)之比的對數(shù)。對于具有IP和IIP型β-轉(zhuǎn)角的β-發(fā)夾，分開地計算所述參數(shù)。為了最后的選擇，獲得β-發(fā)夾的三維結(jié)構(gòu)模型，考慮側(cè)鏈的最常見的旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和鏈間接觸。

本發(fā)明還包括將非天然氨基酸引入到與所述氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體化學(xué)特性在結(jié)構(gòu)上相容的β-發(fā)夾的位置處。在采取正的主鏈扭轉(zhuǎn)角的發(fā)夾的位置處所引入的天然氨基酸的D-立體異構(gòu)體的情況就是如此。一個實例是d-Pro，其作為IIP型β-轉(zhuǎn)角的第二個殘基(等價于本發(fā)明的由兩個殘基組成的鏈間環(huán)的第一個殘基)是有利的。另一個實例是氨基酸d-Lys，其也被引入在相應(yīng)于IIP型β-轉(zhuǎn)角的第二個殘基的位置處，但是在具有反向拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽中。在該情況下，該Lys不是在該位置處在結(jié)構(gòu)上有利的氨基酸(考慮到偏好參數(shù)，其是不利的，這反映了Lys對于采取位于拉氏圖(Ramachandran plot)的右下象限中的扭轉(zhuǎn)角來說是不利的這一事實)，但是該殘基的側(cè)鏈值得想望作為結(jié)構(gòu)域III(DENV3)的殘基Lys385的潛在模擬物。殘基d-Lys對于采取在IIP型β-轉(zhuǎn)角的位置2處所要求的扭轉(zhuǎn)角來說是有利的。

在上面段落中所描述的可修飾殘基的定義相應(yīng)于其拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)與DIIIE的FGβ-發(fā)夾相同(天然拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu))的β-發(fā)夾肽。然而，本發(fā)明還揭示了具有反向拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽。在這樣的肽中，該序列的第一條和第二條β-鏈在功能上/在結(jié)構(gòu)上分別相應(yīng)于DIIIE的G和F鏈。在具有反向拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽中占據(jù)NHB位置的殘基相應(yīng)于具有天然拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽的HB位置，反之亦然。

保持該結(jié)構(gòu)域的FGβ-發(fā)夾的原始拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的所設(shè)計出的肽在NHB位置處包括二硫橋，其對于β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的折疊的穩(wěn)定性來說是有利的。所添加的半胱氨酸的位置為：a)F鏈的第一個殘基，和b)G鏈的最后一個殘基(圖1E)。

數(shù)種本發(fā)明的肽具有較大的β-鏈的大小，如果與肽HDIII3CL進(jìn)行比較。所述鏈的殘基數(shù)目的增加對于折疊的穩(wěn)定性作出貢獻(xiàn)，其中包括兩個額外的氫橋的添加(一個HB殘基/鏈)。

增加肽與受體的相互作用的親和力(和還有其抗病毒活性)的另一種方式在于通過修飾對于相互作用能的貢獻(xiàn)很少或為負(fù)的界面殘基來優(yōu)化分子間相互作用。一般地，大分子之間(特別地，蛋白質(zhì)之間)的相互作用的特征在于，由有限數(shù)目的界面殘基來支配。其余殘基僅具有有限的貢獻(xiàn)。在本發(fā)明的肽的情況下，既不知道肽-受體相互作用的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，也不知道DIIIE與受體之間的相互作用的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。盡管如此，作為首次接近，可以假定相應(yīng)于DIIIE的FG發(fā)夾的暴露殘基的殘基可能是功能性的，任選地牽涉肽-受體界面。

在本發(fā)明的實施例2(表2)和實施例6中顯示，肽HDIII3CL2的殘基Lys14(相應(yīng)于DENV3的DIIIE的殘基Lys388)被丙氨酸置換消除了在Vero細(xì)胞中該肽的抗病毒活性，并且影響該肽與受體LRP1的結(jié)合。通過用丙氨酸置換殘基Trp17(相應(yīng)于DIIIE的殘基Trp391)，獲得了相同的結(jié)果。因此，這兩個殘基在生物學(xué)活性中均是必需的，非?？赡芪挥诮缑嬷校⑶覍τ谙嗷プ饔米鞒鰧嵸|(zhì)性貢獻(xiàn)。因此，在本發(fā)明中它們不被置換。該肽的殘基Cys1和Cys18被丙氨酸雙重置換還消除了肽HDIII3CL2的抗病毒活性，以及其與受體LRP1結(jié)合的能力，但是該效應(yīng)歸因于在該肽的β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性方面的作用，而不是所述半胱氨酸對于分子間相互作用的有利貢獻(xiàn)。

本發(fā)明將β-發(fā)夾肽的可能功能性的表面的延伸揭示為用于增加其效力的方式。在該情況下，向發(fā)夾結(jié)構(gòu)添加四個殘基，其中兩個相應(yīng)于DIIIE的FGβ-發(fā)夾的暴露面的殘基未包含在一系列與HDIII3CL類似的肽中。所述添加在于每條β-鏈兩個殘基，其中NHB位置被相應(yīng)于(DENV3的)包膜蛋白的殘基375(F鏈)和392(G鏈)的氨基酸占據(jù)。DIIIE的殘基375的特征在所述四種血清型之間是保守的，并且它被氨基酸Glu和Asp占據(jù)。這兩個殘基對于在本發(fā)明的β-發(fā)夾肽中的等價位置來說都是符合條件的，雖然優(yōu)選的解決方案是Glu，因為不利的采取延伸結(jié)構(gòu)并形成β-鏈的傾向在Asp上更明顯。對于等價于該結(jié)構(gòu)域的殘基392的位置，優(yōu)選地采取Phe和Tyr，其是DENV的四種血清型的最具代表性的殘基。發(fā)夾的延伸段的HB位置相應(yīng)于關(guān)于折疊的優(yōu)化而言的可修飾殘基。在這些位置處，采取具有形成β-鏈類型的二級結(jié)構(gòu)的傾向的、優(yōu)選地疏水的殘基。

與在實施例2中所確定的必需殘基(相應(yīng)于DIIIE的Lys388和Trp391的殘基)和相應(yīng)于位置Glu/Asp392的殘基不同，其余的外面殘基(NHB)被認(rèn)為能夠進(jìn)行修飾，因為其位置在血清型之間是更加可變的。本發(fā)明的優(yōu)選的解決方案是在DENV的四種血清型的同源序列中在相同位置處出現(xiàn)的殘基。相應(yīng)于DIIIE的位置377的殘基的情況就是如此，優(yōu)選的解決方案為(DENV1和DENV4的)殘基Tyr，而非(DENV3的)Asn。與Asn一樣，殘基Tyr是極性的并且是氫橋的供者/受者，但是暴露出更大的非極性表面，并且是在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點處更頻繁出現(xiàn)的氨基酸。此外，采取延伸結(jié)構(gòu)和β-鏈的傾向?qū)τ赥yr來說是更大的，其還可以具有有利的(π-陽離子)與相應(yīng)于DIIIE的Lys388的殘基的相互作用并且對發(fā)夾的穩(wěn)定性作出貢獻(xiàn)。

非必需的(但可能功能性的)位置通?？梢酝ㄟ^使用組合方法(例如，在噬菌體上表達(dá)的肽文庫)來進(jìn)行測定/挑選，其中可以使必需位置和結(jié)構(gòu)位置保持固定不動并且使其余的可能功能性的位置隨機(jī)化。最佳序列的選擇通過結(jié)合測定試驗來實現(xiàn)，其中選擇表達(dá)有效地與受體分子(例如LRP1和/或α2M*)相結(jié)合的肽序列的噬菌體。經(jīng)優(yōu)化的序列的選擇還可以通過合理設(shè)計方法來實現(xiàn)。

為了本發(fā)明的目的，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽可以通過合成途徑來獲得，或者如果序列僅包含天然氨基酸，那么可以通過重組DNA技術(shù)來獲得，單獨地或作為融合蛋白。在使用重組DNA技術(shù)的情況下，表達(dá)為融合蛋白可以提高表達(dá)水平以及所述肽對于蛋白水解的穩(wěn)定性?？梢詫⑺鲭耐ㄟ^蛋白酶特異性底物序列而連接至融合蛋白。因此，通過用這些蛋白酶進(jìn)行蛋白水解，能夠釋放出本發(fā)明的肽并隨后將其進(jìn)行純化。

在實施例1中顯示了新型β-發(fā)夾肽(SEQ ID No.1－SEQ ID No.9)的設(shè)計。這些肽的序列的基本結(jié)構(gòu)由四個區(qū)段組成：兩個β-鏈區(qū)段(其與DIIIE的FGβ-發(fā)夾在結(jié)構(gòu)上類似)，它們被一個β-轉(zhuǎn)角分隔開并且跟隨有一個包含三個賴氨酸的C-末端陽離子延伸段。這些肽的設(shè)計按照前面所討論的結(jié)構(gòu)/功能標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行，其目標(biāo)是增加這些分子的抗病毒活性效力以及其與細(xì)胞受體的結(jié)合。

為了本發(fā)明的目的，如果一個肽序列與至少一種選自PHB1-9的肽的序列相似，從而相應(yīng)的序列同一性百分比等于或大于70％，優(yōu)選地等于或大于80％，那么認(rèn)為那個序列與PHB1-9β-發(fā)夾肽是類似的。所述類似肽的序列在一個或數(shù)個選自下列的位置處不同：1)上面所描述的可修飾位置a)-e)，在該情況下，PHB1-9的殘基被置換為也具有高的在β-發(fā)夾中占據(jù)所述位置的結(jié)構(gòu)傾向的殘基；2)上面所描述的可能功能性的位置，在該情況下，PHB1-9的所述殘基被置換為DENV的一種血清型的DIIIE的FG發(fā)夾的殘基，以便所述殘基在肽PHB1-9的β-發(fā)夾中占據(jù)類似的位置；3)相應(yīng)于C-末端賴氨酸尾巴的殘基的位置，在該情況下，所述尾巴可以包含兩個或三個賴氨酸，優(yōu)選地三個賴氨酸；和4)相應(yīng)于形成肽PHB1-4和PHB7-9的二硫橋的半胱氨酸的位置，在該情況下，所述半胱氨酸可以被置換為殘基Asp/Glu或Lys，以便該橋的配對半胱氨酸分別被置換為Lys或Asp/Glu，并且所述肽通過在所述殘基(一邊為Asp/Glu，和另一邊為Lys)的側(cè)鏈之間形成酰胺鍵而環(huán)化。

肽PHB1-9的活性通過在Vero細(xì)胞中的蝕斑形成抑制測定試驗來進(jìn)行評價，并且顯示在實施例2中。所有這些肽均顯示出抗病毒活性，它們中的六個在所采用的實驗?zāi)Ｐ椭斜入腍DIII3CL更強(qiáng)有力。肽PHB4具有針對該病毒的四種血清型的在nM范圍內(nèi)的強(qiáng)有力的抗病毒活性，并且顯示出非常有利的選擇性指數(shù)(在1290和6450之間，取決于血清型)。該肽是作為針對DENV的抗病毒藥物的具有優(yōu)異特性的先導(dǎo)分子，并且展示出比以前所報道的抗病毒藥物更大的效力。

因此，本發(fā)明的目標(biāo)還為包含一種或多種β-發(fā)夾肽和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物，所述β-發(fā)夾肽具有選自由下列各項組成的組的氨基酸序列：SEQ ID No.1－SEQ ID No.9，或者與所述序列類似的序列。

在本發(fā)明的一個實施方案中，在所述藥物組合物中，所述肽形成超分子聚集體。由于肽PHB4(和一般地，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽)是為了采取兩親性β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)而設(shè)計的兩親分子，因而其能夠依賴于濃度和環(huán)境條件而形成超分子聚集體。

在實施例5中顯示，該肽進(jìn)行自裝配并且形成納米結(jié)構(gòu)，其大小和形態(tài)取決于實驗條件，例如濃度、溫度、溶劑、聚集時間、添加物的存在等。該肽的抗病毒活性可以依據(jù)這些條件而改變。

在本發(fā)明的背景下，“超分子聚集體”是指由許多肽分子(優(yōu)選地，多于十個分子)形成的聚集體。

在實施例8中證明，在肽PHB4的鹽水溶液中于確定的溫育時間添加蛋白質(zhì)人白蛋白(或稱為人血清白蛋白(HSA))導(dǎo)致獲得在低于nM/亞nM范圍內(nèi)的效力。該結(jié)果表明，在HSA存在下配制該肽是可能的，并且肽聚集體與該蛋白質(zhì)的推定的相互作用導(dǎo)致高度有活性的復(fù)合物。這樣的相互作用可能在該肽的藥物代謝動力學(xué)特性方面是非常有利的，因為HSA具有非常高的半壽期。此外，其可以提供針對蛋白酶的保護(hù)作用，并且影響與血清成分的不希望的可能相互作用。因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，包含所公開的β-發(fā)夾肽的藥物組合物還包含HSA。

不依賴于HSA的存在，肽PHB4自裝配成納米顆粒是從藥物代謝動力學(xué)/藥效動力學(xué)的觀點來看有利的特性。由于其大小，納米顆?？梢哉故境霰葐误w肽(其常常被迅速清除和被代謝)更長的在血液中的半壽期。單體肽易被宿主的蛋白酶降解，而納米顆粒提供更大的針對蛋白水解的保護(hù)作用。在納米顆粒的背景下，多個與受體的結(jié)合位點的呈現(xiàn)可以增加該受體對該肽的親和力，并且對于該肽的抗病毒活性效力作出有利貢獻(xiàn)。

在實施例3和6中證明，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽能夠結(jié)合蛋白質(zhì)α2M*和受體LRP1(其是DENV的推定的胞吞受體的組分)，并且是用于設(shè)計抗病毒藥物的有吸引力的靶標(biāo)，根據(jù)在Huerta G.V.等人的專利申請公開文本W(wǎng)O 2007/124698中所報道的。

本發(fā)明的實質(zhì)性要素是分析在nM范圍內(nèi)的β-發(fā)夾肽的生物學(xué)活性。如在實施例3中所顯示的，在nM/亞μM范圍內(nèi)，肽PHB2、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9抑制DENV1-牙買加毒株的重組DIIIE的生物素化變體(“DIIIE1J-生物素化的”)與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合，并且所述抑制能力明顯高于由非生物素化的DIIIE(DIIIE1J)所展示的。所述肽的抑制百分比為DIIIE1J的1.5至3倍。在該濃度范圍內(nèi)，由肽HDIII3CL所顯示出的抑制是非常低的，相比于DIIIE1J而言。在實施例6中證明，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽以高親和力結(jié)合受體LRP1，其中肽PHB4顯示出最強(qiáng)有力的與受體的結(jié)合的那一個。該結(jié)果與PHB4是關(guān)于抗病毒活性而言最強(qiáng)有力的肽這一事實相一致。

在實施例8中證明，所述β-發(fā)夾肽的抗病毒活性與其結(jié)合受體LRP1和蛋白質(zhì)α2M*的能力相關(guān)，這是抗病毒作用機(jī)制涉及抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的非常堅實的證據(jù)。這還支持了優(yōu)化在本發(fā)明中所公開的β-發(fā)夾肽的效力的策略。

本發(fā)明的β-發(fā)夾肽結(jié)合蛋白質(zhì)α2M和受體LRP1的能力可以用于設(shè)計用于控制由這些蛋白質(zhì)介導(dǎo)的疾病的治療性試劑。在本發(fā)明中所顯示的對于DENV感染的強(qiáng)有力的抑制是該可能性的一個例子。

所述病毒與推定的胞吞受體α2M*/LRP1的結(jié)合的抑制(蛋白E的結(jié)合的抑制)是開發(fā)相對于在現(xiàn)有技術(shù)中所鑒定出的其他受體而言更優(yōu)的針對DENV的抗病毒試劑的一個策略。由其他作者所描述的受體是粘附受體，其介導(dǎo)與質(zhì)膜的結(jié)合，但其不介導(dǎo)胞吞作用過程。因此，本發(fā)明的肽通過阻斷進(jìn)入過程的后面步驟而將會是有效的，而不依賴于由DENV所使用的粘附受體。

考慮到這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明還包括在本發(fā)明中所公開的β-發(fā)夾肽用于制備藥物的用途。在一個實施方案中，所述藥物用于抑制或減弱DENV感染。在另一個實施方案中，用本發(fā)明的β-發(fā)夾肽制備的藥物用于治療由蛋白質(zhì)α2M或蛋白質(zhì)LRP1介導(dǎo)的疾病。

本發(fā)明的目標(biāo)還在于提供用于在有此需要的受試者中抑制或減弱DENV感染的方法，其特征在于，給所述個體施用一種或多種本發(fā)明的β-發(fā)夾肽，或者包含至少一種這些肽的藥物組合物。

附圖簡述

圖1.抑制登革病毒的β-發(fā)夾肽的設(shè)計。A)對于具有8個殘基和IP型中心β-轉(zhuǎn)角的β-發(fā)夾的每一個位置所計算出的20種天然氨基酸的偏好參數(shù)的圖。更大的偏好參數(shù)值相應(yīng)于更深的灰色色調(diào)。對于在用WHATIF選擇出的樣品中在β-發(fā)夾的特定位置處未觀察到的氨基酸，給其分配0.5的觀察值并計算相應(yīng)的偏好參數(shù)。B)對于具有8個殘基和IIP型中心β-轉(zhuǎn)角的β-發(fā)夾的每一個位置所計算出的20種天然氨基酸的偏好參數(shù)的圖。著色方案和偏好參數(shù)的計算與在(A)中的相同。C-D)“標(biāo)識(logo)”類型的圖，其顯示了來自具有IP型(C)和IIP型(D)中心β-轉(zhuǎn)角的β-發(fā)夾的比對的共有序列，其中氨基酸的字母的大小與在樣品中所觀察到的氨基酸頻率(每個位置)和按照所使用的數(shù)據(jù)庫的氨基酸組成所預(yù)期的頻率之間的比率成正比。E)DENV的四種血清型的DIIIE的片段(相應(yīng)于FGβ-發(fā)夾)與肽PHB4的序列比對。MP：在本發(fā)明中所定義的可修飾位置(a-e)，*為相應(yīng)于在功能上重要的殘基Lys385的位置；SS：肽PHB4的“經(jīng)設(shè)計的”二級結(jié)構(gòu)；RN：PHB4的序列的殘基數(shù)目；SSDEN：DIIIE的二級結(jié)構(gòu)；RNDEN：病毒DENV2的蛋白E的序列的殘基數(shù)目；鏈：相應(yīng)于該病毒的DIIIE的F和G鏈的β-鏈。

圖2：抑制DENV的β-發(fā)夾肽的三維結(jié)構(gòu)模型。A)β-發(fā)夾肽HDIII3CL，顯示了相應(yīng)于發(fā)夾(沒有陽離子延伸段)的區(qū)段并且突顯了一些重要的殘基。在括號中出現(xiàn)了在DIIIE中等價的殘基的編號。B)肽PHB4。用大括號標(biāo)示出了相對于HDIII3CL而言的β-鏈的延伸段的殘基。C)這兩個肽的結(jié)構(gòu)疊加。

圖3.經(jīng)生物素化的病毒DENV1的DIIIE(DIIIE1Jbiot)與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合的抑制。在縱坐標(biāo)軸上顯示了在0.05-3μΜ的濃度范圍內(nèi)的本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的抑制百分比。包括了肽HDIII3CL和重組DIIIE(DIIIE1J)的抑制活性。

圖4.劑量-應(yīng)答曲線，其相應(yīng)于經(jīng)生物素化的DIIIE(DIIIE1Jbiot，病毒DENV1的序列)與α2M*的結(jié)合的抑制。顯示了相應(yīng)于β-發(fā)夾肽PHB5、肽HDIII3CL和重組DIIIE(DIIIE1J)的抑制百分比。

圖5.所示的β-發(fā)夾肽對于經(jīng)生物素化的病毒DENV1的DIIIE(DIIIE1Jbiot)與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合的抑制，以及與抗病毒活性的關(guān)系。在縱坐標(biāo)軸上顯示了相對于對于DIIIE1J所測定的抑制百分比而言的結(jié)合抑制百分比。顯示了相應(yīng)于亞μM(50-200nM)濃度范圍的數(shù)據(jù)。

圖6.質(zhì)粒pET-DIII DENV1的示意圖。

圖7.在與蛋白質(zhì)α2M的相互作用中必需的DIIIE的殘基的作圖。在縱軸上顯示了在每個丙氨酸突變體(相應(yīng)于在橫軸上的每個特定殘基)的IC50值與重組DIIIE(DIIIE1PRS)的IC50值之間的比例。深色帶陰影的橢球體指明了限定初級相互作用位點的殘基。具有邊緣的淺色橢球體限定了次級相互作用位點。

圖8.參與與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用的位點在DIIIE的三維結(jié)構(gòu)中的定位。顯示了病毒DENV1的DIIIE的結(jié)構(gòu)的兩種視圖，包括二級結(jié)構(gòu)的“棍”式詳細(xì)圖示和示意性圖示(分別用箭狀物和管狀物來強(qiáng)調(diào)β-片層和環(huán))。鑒定了在相互作用中重要的殘基。重要的殘基集聚在由帶陰影的橢球體所呈現(xiàn)的兩個位點(第一個位點(A)和第二個位點(B))中。三維結(jié)構(gòu)的圖示用PyMol(The PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.2r3pre,LLC.)來制作。

圖9.在磷酸緩沖鹽水(PBS)存在下肽PHB4的聚集動力學(xué)。A-B)在PBS中，10μΜ的肽PHB4的聚集動力學(xué)?？v坐標(biāo)軸相應(yīng)于相對于在零時間處(在PBS中溶解的那一時刻處)該肽的散射而言的散射光的強(qiáng)度。A：0至300分鐘的聚集變化圖。B：聚集的最初30分鐘。C-D)：在PBS中，5μΜ的肽PHB4的聚集動力學(xué)。C：早聚集，0-40分鐘。D：晚聚集，30-230分鐘。

圖10.通過透射電子顯微鏡術(shù)來進(jìn)行的肽PHB4的聚集體的形態(tài)研究。研究了在水中和在PBS中以2mg/ml的濃度的該肽的聚集。所研究的條件為：剛剛在水中(A)和在PBS中(B)重懸浮的肽；在水中(C)和在PBS中(D)重懸浮并于50℃加熱一小時的肽；以及在水中(E)和在PBS中(F)溶解、于50℃加熱一小時并在環(huán)境溫度下溫育兩小時的肽。所述標(biāo)尺條分別地在A、B、E和F中等于100nm，和在C-D中等于200nm。

圖11.在用于測定DENV的DIIIE與受體LRP1的直接相互作用的測定試驗中所使用的蛋白質(zhì)。A)LRP1的結(jié)構(gòu)域的構(gòu)造的示意性圖示。MP：質(zhì)膜。指明了相應(yīng)于與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域簇的區(qū)域。B)嵌合蛋白sLRP1-CIV的示意性圖示，F(xiàn)c：免疫球蛋白恒定區(qū)片段。C)重組蛋白質(zhì)DIIIE1-4的示意性圖示。D)通過在變性條件下的聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)對蛋白質(zhì)DIIIE的最終制備物進(jìn)行的分析：1.DIIIE1(尤其是DIIIE1J)；2.DIIIE2；3.DIIIE3；和4.DIIIE4。指明了相應(yīng)于所使用的分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的14kDa那部分的條帶的位置。

圖12.在ELISA型測定試驗中DENV的DIIIE與LRP1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用。在每張圖的上面部分中，指明了在平板孔的包被中所使用的蛋白質(zhì)。通過使用綴合至過氧化物酶的抗人免疫球蛋白Fc的多克隆抗體制備物來進(jìn)行蛋白質(zhì)sLPR1-CII-IV的結(jié)合。

圖13.sLRP1-CIV的表面的表征。A)通過施加α2M*和受體相關(guān)蛋白(RAP，Receptor-Associated Protein)(兩者都在100nM)而獲得的傳感圖(sensorgram)。顯示了在兩個溝道上獲得的信號：Fc1，具有經(jīng)固定化的sLRP1-CIV；和Fc2，具有經(jīng)固定化的HSArec。B)從針對濃度的最大共振單位(RU)的數(shù)據(jù)開始來測定RAP與sLRP1的相互作用的親和力。實線表示與具有兩個相互作用位點的模型的擬合。所述擬合通過使用程序GraphPad Prism v5.03來進(jìn)行。在Biacore X上進(jìn)行測量。

圖14.β-發(fā)夾肽與sLRP1-CIV的相互作用。A和B)通過施加濃度為20μΜ的肽而獲得的傳感圖；C)在160s的相互作用下獲得的RU；和(D)在270s的相互作用下獲得的RU。

圖15.在β-發(fā)夾肽與蛋白質(zhì)LRP1(片段sLRP1-CIV)的結(jié)合和β-發(fā)夾肽的體外抗病毒活性之間所觀察到的關(guān)系。顯示了在于Vero細(xì)胞中針對DENV2所測定的抗病毒活性的效力值[log(IC50,uM)]與在時間經(jīng)過400s時所觀察到的Biacore信號的量值(RU_rem)之間的線性回歸。該分析用與肽HDIII3CL共有相同的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)(天然拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu))的PHB系列的肽來進(jìn)行。95％的置信帶用虛線來顯示。在插入圖中顯示了不包括肽PHB4的相似的分析。

圖16.在β-發(fā)夾肽與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合和β-發(fā)夾肽的體外抗病毒活性之間所觀察到的關(guān)系。顯示了DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合的抑制值針對相應(yīng)于在Vero細(xì)胞中病毒DENV2感染的抑制的IC50值的線性回歸。相對于在關(guān)于所述肽的等摩爾濃度下對于重組DIIIE(DIIIE1J)所測定的抑制百分比而言來表示與α2M*的結(jié)合的抑制百分比。顯示了平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的值，其在亞μM和nM的所述肽的濃度下測定：50、100、200和400nM。

圖17.肽PHB4的溫育溫度對于其抗病毒活性的影響?？共《净钚缘脑u價通過用DENV2(16803毒株)進(jìn)行感染的Vero細(xì)胞的感染后(p.i.)24小時的上清液的滴度測定來進(jìn)行。對于上清液的滴度測定，使用在Vero細(xì)胞上的裂解斑形成測定試驗。IC50的估計用統(tǒng)計學(xué)程序GraphPad Prism v5.3來進(jìn)行。實線表示用“l(fā)og₁₀(濃度)vs應(yīng)答”曲線模型來進(jìn)行的非線性回歸擬合。

圖18.實驗設(shè)計流程，其用于評價聚集體的生長時間對于肽PHB4的抗病毒活性效力的影響。

圖19.肽PHB4的溫育時間和溫度對于抗病毒活性的影響。抗病毒活性的評價通過用DENV2(16803毒株)進(jìn)行感染的Vero細(xì)胞的感染后24小時的上清液的滴度測定來進(jìn)行。對于上清液的滴度測定，使用在Vero細(xì)胞上的裂解斑形成測定試驗。在沒有肽存在的情況下被感染的細(xì)胞的上清液的病毒滴度為4log₁₀。A.在10℃下進(jìn)行溫育；B.在37℃下進(jìn)行溫育。

圖20.實驗設(shè)計流程，其用于評價在開始聚集體的生長過程時肽PHB4的初始濃度對于抗病毒活性效力的影響。

圖21.肽在水中的初始溶液的濃度對于抗病毒活性的影響?？共《净钚缘脑u價通過用DENV2(16803毒株)進(jìn)行感染的Vero細(xì)胞的感染后24小時的上清液的滴度測定來進(jìn)行。對于上清液的滴度測定，使用在Vero細(xì)胞上的裂解斑形成測定試驗。

圖22.肽PHB與組氨酸尾巴的融合的設(shè)計。在上圖中，將尾巴添加在該肽的C-末端處。在下圖中，尾巴位于N-末端處。

圖23.具有組氨酸尾巴的融合肽的聚集體/納米顆粒的示意性圖示，所述聚集體/納米顆粒通過用金屬離子的間隔物和絡(luò)合物EGTA(Me2)的間隔物進(jìn)行交聯(lián)來穩(wěn)定化。

圖24.單獨的以及與Zn和與EGTA(Zn2)形成絡(luò)合物的肽H5PHB4和PHB4H5的抗病毒活性。

實施方式的詳細(xì)描述/實施例

實施例1.抑制登革病毒感染的β-發(fā)夾肽的設(shè)計和合成

在本發(fā)明中所使用的β-發(fā)夾肽的序列的描述

設(shè)計了在表1中命名為PHB1-9的新型β-發(fā)夾肽(其相應(yīng)于SEQ ID No.1-9)，這按照旨在相對于HDIII3CL(SEQ ID No.10)而言提高這些分子的抗病毒活性效力(和與細(xì)胞受體的結(jié)合)的結(jié)構(gòu)/功能標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行。這些肽的序列的基本結(jié)構(gòu)由四個區(qū)段組成：兩個β-鏈區(qū)段(其與該病毒的DIIIE的FGβ-發(fā)夾在結(jié)構(gòu)上類似)，它們被一個β-轉(zhuǎn)角分隔開并且跟隨有一個包含三個賴氨酸的C-末端陽離子延伸段。定義了兩種不同的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)：肽PHB1-4和PHB7-9具有與DIIIE的FGβ-發(fā)夾相同的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)(多肽鏈的方向是相同的或天然的)，和肽PHB5和PHB6具有相反的或反向的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)。具有天然拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽的第一個β-鏈區(qū)段(在表1中的β1)在結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于Fβ-鏈，和β2區(qū)段相應(yīng)于Gβ-鏈(圖1E)。肽PHB1、PHB2和PHB7的鏈長與肽HDIII3CL的相應(yīng)鏈(有著六個殘基的鏈)相一致，而肽PHB3-4和PHB8-9具有有著八個殘基的鏈，和PHB5-6具有有著七個殘基的鏈。鏈的較大的大小對于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性作出有利貢獻(xiàn)(Stanger,H.E.等人,(2001).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98,12015–12020)。

肽PHB1、PHB2和PHB7的殘基Cys1、Asn/Tyr3和Thr5相應(yīng)于DIIIE的FGβ-發(fā)夾的NHB暴露位置。對于位置3，在PHB1和PHB7中選擇殘基Asn3，其等價于病毒DENV3的DIIIE的殘基Asn377；和對于肽PHB2，選擇殘基Tyr3，其等價于DENV1、DENV2和DENV4的Tyr377。Tyr3是比Asn3更優(yōu)選的，因為它在血清型之間更保守，更好地形成β-鏈結(jié)構(gòu)，并且占據(jù)Lys10的對角線位置，這促進(jìn)Tyr3和Lys10可以在其側(cè)鏈之間建立π-陽離子類型的有利的相互作用(圖2B)。在位置5處，選擇殘基Thr5，以代替DENV的DIIIE的序列的Val/Ile379(圖1E)。這是由于殘基Thr是相對于Val/Ile而言保守的氨基酸，是β-鏈結(jié)構(gòu)的良好形成者，但是它是更親水的(這對于肽的更大的可溶性作出貢獻(xiàn))并且顯示出更高的結(jié)構(gòu)偏好參數(shù)值(圖1E的具有八個殘基的β-發(fā)夾的位置2)。這些肽的殘基Cys14、Asn12和Lys10在β-發(fā)夾的相同面上分別占據(jù)與Cys1、Tyr/Asn3和Thr5相鄰的位置，但是主鏈不在所述殘基之間形成氫橋。殘基Lys10和Asn12在結(jié)構(gòu)/功能上相應(yīng)于殘基Lys388(其是在DENV1-3中保守的)和Asn390(其是在DENV2-3中保守的)。在位置13處選擇殘基Trp，因為DIIIE的相應(yīng)殘基Trp391在所述四種血清型中是嚴(yán)格保守的。Cys1和Cys14這兩個半胱氨酸形成執(zhí)行必需結(jié)構(gòu)作用的二硫橋。這些殘基占據(jù)NHB位置，并且在該位置處的二硫橋?qū)τ讦?發(fā)夾的穩(wěn)定性是有利的(Santiveri C.M.等人,(2008).Chem.Eur.J.,14,488-499)。在本發(fā)明的后面，通過實驗證明了殘基Lys10、Trp13以及半胱氨酸Cys1和Cys14對于所述肽的抗病毒活性來說是必需的。與HDIII3CL類似的肽(其中一個位置(Lys10→Ala或Trp17→Ala，HDIII3CL的Trp17在結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于PHB1、PHB2和PHB7的殘基Trp10)或兩個位置(Cys1→Ser和Cys18→Ser，在HDIII3CL中Trp18在結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于PHB1、PHB2和PHB7的殘基Trp13)被置換)在所檢驗的濃度范圍內(nèi)不具有抗病毒效應(yīng)。另外，在后面還證明了Tyr3優(yōu)于Asn3，其中考慮到肽PHB9比肽PHB8更有強(qiáng)有力，并且這些肽僅在相應(yīng)于DENV1-2和DENV4的DIIIE的Tyr375的位置處不同。

表1.β-發(fā)夾肽的設(shè)計

p，脯氨酸的D-立體異構(gòu)體；k，賴氨酸的D-立體異構(gòu)體；天然拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，與DIIIE的FGβ-發(fā)夾的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)相同；反向拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)，與DIIIE的FGβ-發(fā)夾的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)相反。

殘基Val2、Trp/Val4、Glu/Arg/Ile6、Lys/Trp9、Val/Tyr11和Trp13形成該發(fā)夾的對面，其中占據(jù)HB位置。位置2、4和6分別與位置13、11和9相鄰，并且在主鏈的原子之間通過氫橋形成連接。由于在上面的段落中所闡明的原因，位置13僅被Trp占據(jù)。通過考慮每個殘基的偏好參數(shù)值來選擇其余的位置(圖1A和B)。在位置6和9的情況下，選擇偶對Glu6-Lys9(PHB1)和Arg6-Trp9(PHB2)，它們是有利的，因為其分別可以建立鹽橋和π-陽離子相互作用。Lys9(PHB1和PHB7)可以作為DIIIE的Lys385的模擬物而發(fā)揮功能性作用。該殘基在DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用中是必需的，如在本發(fā)明的后面所證明的那樣。

肽PHB1和PHB2被設(shè)計成在殘基6和9之間形成IIP型β-轉(zhuǎn)角。這些肽的位置7被殘基d-Pro(其是氨基酸脯氨酸的D-立體異構(gòu)體)占據(jù)。該氨基酸對于占據(jù)IIP型β-轉(zhuǎn)角的第二個位置來說是有利的(Pantoja-Uceda D.等人,(2006)Methods Mol Biol.,340:27-51)。肽PHB1的殘基Asp8因高的偏好參數(shù)值而被選擇。PHB2的Lys8被選擇用于模擬DIIIE的殘基Lys385。在肽PHB7的情況下，在殘基6和9之間設(shè)計了一個IP型β-轉(zhuǎn)角。通過考慮偏好參數(shù)值而選擇了殘基Asn7和Gly8(圖1A和B)。該二肽是IP型β-轉(zhuǎn)角中非常常見的序列。

另外，肽PHB3和PHB4的β-發(fā)夾的序列分別包含肽PHB1和PHB2的相應(yīng)發(fā)夾的序列(表1)。在該情況下，前者的位置4-15等價于后者的位置2-13，因此PHB3和PHB4的殘基4-15的選擇用在上面對于肽PHB1和PHB2所描述的標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行。

類似地，PHB8和PHB9包含PHB7的序列，并且殘基4-15以與PHB7的殘基2-13相同的方式來進(jìn)行選擇。PHB3、PHB4、PHB8和PHB9的殘基Glu3和Phe16被選擇用于模擬DIIIE的殘基Glu375(其在DENV1和DENV3中是保守的，在DENV2和DENV4中為Asp)和Phe392(其在DENV1、DENV2和DENV4中是保守的，在DENV3中為Tyr)(圖1E)。選擇PHB3-4和PHB8-9的殘基Ile2和Ile17，因為這些殘基具有高的形成β-鏈結(jié)構(gòu)的傾向。殘基Cys1和Cys18占據(jù)NHB位置，并且被引入用于形成使β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的二硫橋(圖1E和圖2)。

肽PHB5和PHB6具有反向拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)。殘基Phe1、Asn3、Lys5、Thr12、Asn14和Glu16在結(jié)構(gòu)上等價于肽PHB3的殘基Phe16、Asn14、Lys12、Thr7、Asn5和Glu3，但是占據(jù)通過氫橋連接的HB位置。殘基Trp4和Trp6與殘基Trp11和Trp13相鄰，占據(jù)NHB位置，并且被設(shè)計用于形成對于β-發(fā)夾的穩(wěn)定性來說非常有利的Trp拉鏈。殘基Trp2在結(jié)構(gòu)上相應(yīng)于DIIIE的殘基Trp391，并且由于上面所闡明的原因而被選擇。殘基Glu7和Lys10具有高的偏好參數(shù)值，并且可以形成對于發(fā)夾的穩(wěn)定性來說有利的鹽橋。氨基酸Asn9也通過偏好參數(shù)而被選擇。選擇PHB6的殘基d-Pro8，因為它在IIPβ-轉(zhuǎn)角的位置2中是有利的。引入PHB5的d-Lys以用于模擬DIIIE的殘基Lys385，因為殘基d-Lys對于占據(jù)IIP型β-轉(zhuǎn)角的位置2來說是非常有利的，相比于與立體異構(gòu)體L-Lys而言。備選地，PHB5和PHB6的殘基Lys10也可以模擬DIIIE的殘基Lys385。

所有的肽PHB1-9的C-末端延伸段都包含三肽LysLysLys，其被引入用于提高肽的可溶性，因為受體LRP1是陰離子分子，其可以與本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的陽離子三肽建立有利的靜電相互作用。在肽PHB5和PHB6的情況下，所述陽離子三肽通過二肽GlyGly而與β-發(fā)夾分隔開，以在這兩個區(qū)段之間引入柔韌性并且阻斷β2鏈的延伸的β結(jié)構(gòu)的延長。

圖1C和1D是“標(biāo)識”類型的圖(J.Gorodkin等人,(1997).Comput.Appl.Biosci.,Vol.13,no.6:583-586；T.D.Schneider&R.M.Stephens.(1990).Nucleic Acids Research,Vol.18,No.20,第6097-6100頁)，其分別顯示了來自具有IP和IIP型中心β-轉(zhuǎn)角的有著八個殘基的β-發(fā)夾的比對的共有序列。這些圖通過使用web服務(wù)器“Protein Sequence Logos using Relative Entropy”(http://www.cbs.dtu.dk/～gorodkin/appl/plogo.html)來獲得。該呈現(xiàn)形式是在圖1A和1B中所顯示的偏好參數(shù)矩陣的備選方式，在此相應(yīng)于每個氨基酸的字母的噴泉大小與該殘基類型在每個位置處的“重要性”成正比，即更大的字母意味著該殘基在結(jié)構(gòu)上是更有利的。

除了肽PHB1-9外，表1還顯示了肽HDIII3CL(SEQ ID No.10)和其數(shù)種類似物(在其中殘基被變成丙氨酸)的序列，所述類似物被引入是為了調(diào)查所述肽的數(shù)種位置在抗病毒活性中的作用。以該目的而設(shè)計的肽為HDIII3CL2，其是與肽HDIII3CL類似的具有有著三個賴氨酸的延伸區(qū)段的肽(SEQ ID No.11)；HDIII3CLW-，其是肽HDIII3CL2的Trp17→Ala突變體(SEQ ID No.12)；HDIII3CLK-，其是肽HDIII3CL2的Lys14→Ala突變體(SEQ ID No.13)；和HDIII3CLC-，其是肽HDIII3CL2的Cys1→Ala和Cys18→Ala雙突變體(SEQ ID No.14)。

圖2集合了β-發(fā)夾肽HDIII3CL(A)和PHB4(B)的三維結(jié)構(gòu)模型。在肽HDIII3CL的情況下(圖2A)，顯示了相應(yīng)于發(fā)夾(沒有陽離子延伸段)的區(qū)段并且突顯了一些重要的殘基。在括號中出現(xiàn)了在DIIIE中等價的殘基的編號。在肽PHB4的情況下(圖2B)，用大括號標(biāo)示出了相對于HDIII3CL而言的β-鏈的延伸段的殘基。強(qiáng)調(diào)了在本發(fā)明中所描述的肽的生物學(xué)活性中重要的側(cè)鏈：1)位于相應(yīng)于DIIIE的殘基Lys385的轉(zhuǎn)角/環(huán)中的Lys，2)位于第二條β-鏈中且相應(yīng)于DIIIE的殘基Lys388的Lys，3)位于第二條β-鏈中且相應(yīng)于DIIIE的殘基Trp391的Trp，4)位于第一條β-鏈中且相應(yīng)于DIIIE的殘基Tyr377的Tyr。圖2C顯示了這兩個肽的結(jié)構(gòu)疊加。

本發(fā)明的肽PHB1-9代表了可以從在發(fā)明詳述部分中和在該實施例中所闡明的一般原理出發(fā)而設(shè)計出的β-發(fā)夾肽的具體示例，而所述設(shè)計旨在獲得針對DENV的高度強(qiáng)有力的抗病毒肽。因此，本發(fā)明保護(hù)與至少一種選自PHB1-9的肽的序列相似的β-發(fā)夾肽的序列，從而相應(yīng)的序列同一性百分比等于或大于70％，優(yōu)選地等于或大于80％。所述類似肽的序列在一個或數(shù)個選自下列的位置處不同：1)在發(fā)明詳述部分中所描述的可修飾位置a-e)，在該情況下，PHB1-9的殘基被置換為也具有高的在β-發(fā)夾中占據(jù)所述位置的結(jié)構(gòu)傾向的殘基；2)在發(fā)明詳述部分中所描述的可能功能性的位置，在該情況下，PHB1-9的所述殘基被置換為DENV的一種血清型的DIIIE的FG發(fā)夾的殘基，以便所述殘基在肽PHB1-9的β-發(fā)夾中占據(jù)類似的位置；3)相應(yīng)于C-末端賴氨酸尾巴的殘基的位置，在該情況下，所述尾巴包含兩個或三個賴氨酸，優(yōu)選地三個賴氨酸；和4)相應(yīng)于形成肽PHB1-4和PHB7-9的二硫橋的半胱氨酸的位置，在該情況下，所述半胱氨酸可以被置換成殘基Asp/Glu或Lys，以便該橋的配對半胱氨酸分別被置換為Lys或Asp/Glu，并且所述肽通過在所述殘基(一邊為Asp/Glu，和另一邊為Lys)的側(cè)鏈之間形成酰胺鍵而環(huán)化。

一般地，與PHB1-9類似的β-發(fā)夾肽的序列可以以下述方式來進(jìn)行描述：

i.與PHB1和PHB2類似的肽為其序列具有相對于PHB1和PHB2的序列而言的70％或更高(優(yōu)選地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述序列由下列組成，

位置1(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置14的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置14的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置2(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或Met

位置3(可能功能性的)：Tyr或Asn

位置4(“a”類可修飾的)：Trp或Val或Phe或Glu

位置5(“d”類可修飾的)：Thr或Val或Ile(后兩者為在DENV的序列中出現(xiàn)的殘基)

位置6(“a”類可修飾的)：Arg或Ile或Val或Glu或Leu

位置7(“b”類可修飾的)：d-Pro

位置8(“b”類可修飾的)：Asp或Lys或Asn

位置9(“a”和“e”類可修飾的)：Trp或Lys或Met或Thr或Gln

位置10(可能功能性的)：Lys

位置11(“a”類可修飾的)：Val或Met或His或Leu

位置12(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His

位置13(必需位置)：Trp

位置14(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置1的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置1的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置15-17或15-16(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽Lys-Lys；

ii.與PHB3和PHB4類似的肽為其序列具有相對于PHB3和PHB4的序列而言的70％或更高(優(yōu)選地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述序列由下列組成，

位置1(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置18的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置18的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置2(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或Met

位置3(可能功能性的)：Glu或Asp

位置4(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或Met

位置5(可能功能性的)：Tyr或Asn

位置6(“a”類可修飾的)：Trp或Val或Phe或Glu

位置7(“d”類可修飾的)：Thr或Val或Ile(后兩者為在DENV的序列中出現(xiàn)的殘基)

位置8(“a”類可修飾的)：Arg或Ile或Val或Glu或Leu

位置9(“b”類可修飾的)：d-Pro

位置10(“b”類可修飾的)：Asp或Lys或Asn

位置11(“a”和“e”類可修飾的)：Trp或Lys或Met或Thr或Gln

位置12(可能功能性的)：Lys

位置13(“a”類可修飾的)：Val或Met或His或Leu

位置14(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His

位置15(必需位置)：Trp

位置16(可能功能性的)：Phe或Tyr

位置17(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或Met

位置18(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置1的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置1的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置19-21或19-20(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽Lys-Lys；

iii.與PHB7類似的肽為其序列具有相對于PHB7的序列而言的70％或更高(優(yōu)選地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述序列由下列組成，

位置1(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置14的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置14的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置2(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或Met

位置3(可能功能性的)：Tyr或Asn

位置4(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Phe或Tyr或Leu

位置5(“d”類可修飾的)：Thr或Val或Ile(后兩者為在DENV的序列中出現(xiàn)的殘基

位置6(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Tyr，His或Lys

位置7(“b”類可修飾的)：Asn或Asp

位置8(“b”類可修飾的)：Gly

位置9(“a”和“e”類可修飾的)：Lys或His或Arg或Val或Tyr或Glu或Met

位置10(可能功能性的)：Lys

位置11(“a”類可修飾的)：Tyr或Val或Gln或Trp，Phe

位置12(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His

位置13(必需位置)：Trp

位置14(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置1的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置1的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置15-17或15-16(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽Lys-Lys；

iv.與PHB8和PHB9類似的肽為其序列具有相對于PHB8和PHB9的序列而言的70％或更高(優(yōu)選地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述序列由下列組成，

位置1(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置18的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置18的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置2(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或Met

位置3(可能功能性的)：Glu或Asp

位置4(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Trp或Phe或Tyr或Met

位置5(可能功能性的)：Tyr或Asn

位置6(“a”類可修飾的)：Val或Ile或Phe或Tyr或Leu

位置7(“d”類可修飾的)：Thr或Val或Ile(后兩者為在DENV的序列中出現(xiàn)的殘基)

位置8(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Tyr或His或Lys

位置9(“b”類可修飾的)：Asn或Asp

位置10(“b”類可修飾的)：Gly

位置11(“a”和“e”類可修飾的)：Lys或His或Arg或Val或Tyr或Glu或Met

位置12(可能功能性的)：Lys

位置13(“a”類可修飾的)：Tyr或Val或Gln或Trp，Phe

位置14(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His

位置15(必需位置)：Trp

位置16(可能功能性的)：Phe或Tyr

位置17(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或Met

位置18(結(jié)構(gòu)的，環(huán)化)：Cys或Lys或Asp或Glu，如果是Cys，那么其與位置1的殘基Cys形成二硫橋，如果是Glu/Asp(Lys)，那么其側(cè)鏈與位置1的Lys(Glu/Asp)的側(cè)鏈形成酰胺鍵

位置19-21或19-20(C-末端延伸段)：三肽Lys-Lys-Lys或二肽Lys-Lys；

v.與PHB5和PHB6類似的肽為其序列具有相對于PHB5和PHB6的序列而言的70％或更高(優(yōu)選地，80％或更高)同一性的相似性的肽，并且所述序列由下列組成，

位置1(可能功能性的)：Phe或Tyr

位置12(必需位置)：Trp

位置3(可能功能性的)：Asn或Asp或Ser或His

位置4(“a”類可修飾的)：Trp

位置5(可能功能性的)：Lys

位置6(“a”類可修飾的)：Trp

位置7(可能功能性的，“b”類可修飾的)：Glu或Val或Arg或Ile或Asp

位置8(“b”類可修飾的)：d-Pro或d-Lys

位置9(“b”類可修飾的)：Asn或Asp或Lys

位置10(可能功能性的，“b”類可修飾的)：Lys或Met或Trp或Gln或Thr

位置11(“a”類可修飾的)：Trp

位置12(“d”類可修飾的)：Thr或Val或Ile(后兩者為在DENV的序列中出現(xiàn)的殘基

位置13(“a”類可修飾的)：Trp

位置5(可能功能性的)：Tyr或Asn

位置13(“a”類可修飾的)：Ile或Val或Trp或Phe或Tyr或Met

位置14(可能功能性的)：Glu或Asp

位置15-19或15-18(C-末端延伸段)：五肽Gly-Gly-Lys-Lys-Lys或四肽Gly-Gly-Lys-Lys。

肽的合成

在表1中所列出的肽的合成通過使用Fmoc/tBu策略在Fmoc-AM-MBHA樹脂上以固相方式來進(jìn)行(Barany,G.&Merrifield,R.B.(1977)J Am Chem Soc.99 7363-7365)。所述合成在具有多孔玻璃料的10mL注射器中手工地進(jìn)行，并且所有試劑和溶劑通過在真空中過濾來去除。氨基酸通過使用用DIC/HOBt進(jìn)行活化的方法來進(jìn)行偶聯(lián)，并且通過使用茚三酮測定試驗來驗證偶聯(lián)反應(yīng)的完成(Kaiser,E.等人,(1970)Anal Biochem.34:595-598)。通過用三氟乙酸/EDT/H₂O/TIS(94％/2.5％/2.5％/1％)的溶液進(jìn)行處理來將肽與樹脂分開，用醚進(jìn)行沉淀，并凍干72小時。將肽通過經(jīng)由用二甲亞砜(DMSO)進(jìn)行氧化而形成二硫橋來進(jìn)行環(huán)化(Andreu,D.等人,(編者),Peptide Synthesis Protocols,Methods in Molecular Biology,Totowa,NJ,1994,第91-169頁)，并且在RP-C18柱上通過制備型RP-HPLC來進(jìn)行純化。將收集的級分獨立地在分析型RP-HPLC中進(jìn)行分析，并且通過合并具有大于99％純度的級分來制得每種肽的最終制備物。肽的最終制備物的分子量通過質(zhì)譜法ESI-MS來進(jìn)行驗證。

在配備有Z-噴射電霧化電離源的、具有八角形幾何形狀的混合型質(zhì)譜儀QTOF-2TM(Micromass,UK)中獲取質(zhì)譜。所使用的質(zhì)譜加工和獲取程序為MassLinx,3.5版(Waters,USA)。

實施例2.在Vero細(xì)胞中病毒感染的抑制

為了證明本發(fā)明的β-發(fā)夾合成肽在體外抑制DENV感染的能力，將所述肽在Vero細(xì)胞中在蝕斑形成抑制測定試驗中進(jìn)行評價。

使Vero細(xì)胞在24-孔平板中生長，直至單層達(dá)到大約90％匯合。用沒有胎牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基(極限必需培養(yǎng)基)洗滌單層兩次，添加肽的稀釋物，并且典型地在37℃下溫育1小時。接著，以0.001的感染復(fù)數(shù)(m.o.i.)添加病毒(DENV血清型2，NIBSC編碼S16803)，并且在37℃下重新將細(xì)胞溫育1小時。在用病毒進(jìn)行的溫育結(jié)束時，重新洗滌細(xì)胞以去除未結(jié)合的病毒，并且在37℃下在高密度培養(yǎng)基(補(bǔ)充有非必需氨基酸、1％FBS、1％羧甲基纖維素的MEM)中溫育5天，以有助于裂解斑的形成。對于染色，使用在0.15M乙酸鈉中的0.1％萘酚藍(lán)黑。在每個實驗中，以每個點兩次重復(fù)來進(jìn)行檢定，并且進(jìn)行三次獨立的測定。

β-發(fā)夾肽的毒性效應(yīng)借助于MTT(溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑Invitrogen,USA)方法(Mosmann,T.(1983).J.Immunol.Methods 65,55-63)并經(jīng)由通過使用Newbauer計數(shù)室的細(xì)胞計數(shù)來進(jìn)行測定。用200μL/孔的處于1×10⁵個細(xì)胞/mL的Vero細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液接種96-孔平板(Costar,USA)。溫育平板直至達(dá)到大約90％匯合，典型地18-24小時。將細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基)洗滌2次，然后添加50μL/孔的待評價的肽和/或添加物的稀釋物。作為毒性的陽性對照，使用溶解在PBS中的Triton X-100^TM。將平板在37℃和5％CO₂下溫育2或24小時。對于細(xì)胞單層，采用兩種不同的毒性測定：

a)添加50μL/孔的在PBS中的2mg/ml的MTT溶液。將平板在37℃和5％CO₂下溫育四小時。在平板中，撤去培養(yǎng)基，并添加100μL/孔的DMSO以溶解甲月朁沉淀物。最后，在平板閱讀器(Sensident Scan^TM,Merck,Alemania)中于540nm處測量光密度(OD)。

b)用200μL/孔的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，然后添加50μL/孔的胰蛋白酶(Sigma,USA)。通過添加150μL/孔的補(bǔ)充有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基來使胰蛋白酶失活。然后，通過使用活體染料錐蟲藍(lán)(Gibco,USA)來對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。通過使用統(tǒng)計學(xué)程序GraphPad Prism v5.3來分析數(shù)據(jù)。用“l(fā)og₁₀(濃度)vs應(yīng)答”曲線模型來進(jìn)行非線性回歸擬合。

表2顯示了相應(yīng)于在Vero細(xì)胞中β-發(fā)夾肽針對DENV2的抗病毒活性的IC50值，以及其毒性和選擇性指數(shù)。在該系統(tǒng)中所有肽都具有抗病毒活性，其中肽PHB2、PHB3、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9比肽HDIII3CL更強(qiáng)有力。在該體外系統(tǒng)中，肽PHB3、PHB5和PHB8的活性僅稍微更優(yōu)，而肽PHB1、PHB6和PHB7較不強(qiáng)有力。肽PHB4具有在nM范圍內(nèi)的抗病毒活性，并且顯示出4333的選擇性指數(shù)，這是非常有利的。該肽是作為針對DENV的抗病毒藥物候選物的具有優(yōu)異特性的先導(dǎo)分子。

結(jié)果證明，肽HDIII3CL的鏈間環(huán)是可有可無的，因為在本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的序列中，已去除了具有六個殘基的環(huán)。取而代之，引入了具有兩個中心殘基的β-轉(zhuǎn)角，其沒有保持與DIIIE的環(huán)的原始序列的(部分的序列)相似性。所述肽的該特征在其用于繼發(fā)感染的情況下是有利的，因為所述環(huán)是抗病毒抗體應(yīng)答的免疫顯性區(qū)域(Sukupolvi-Petty S.等人,(2007).J Virol.,81(23):12816-26)。這些預(yù)先存在的抗體可以中和基于FGβ-發(fā)夾的肽的抗病毒活性，并且在本發(fā)明的肽中環(huán)的去除消除了可能的被這些抗體的識別。

所獲得的結(jié)果還暗示了所述β-發(fā)夾肽的數(shù)個殘基在抗病毒活性中的有利作用。在鏈間β-轉(zhuǎn)角的中心位置處賴氨酸(d-賴氨酸)的存在的情況就是如此。肽PHB5比PHB6更強(qiáng)有力，并且它們之間的差異僅在于轉(zhuǎn)角的序列，即在PHB6中不包含賴氨酸(表1)。該觀察結(jié)果還支持這樣的事實，即PHB2和PHB4比其對應(yīng)物PHB1和PHB3(其在環(huán)的中心位置處也不具有賴氨酸)更強(qiáng)有力。該賴氨酸在功能上/在結(jié)構(gòu)上模擬該病毒的DIIIE的殘基Lys385。另一個有利的特征是在等價于DIIIE的殘基377(病毒DENV3的包膜蛋白的編號)的位置處酪氨酸殘基的存在。包含殘基Tyr5的肽PHB9的效力比PHB8(其差異僅在于殘基Asn5的存在)更高。該結(jié)論也與下述事實相一致：PHB2(包含Tyr3)和PHB4(包含Tyr5)比其對應(yīng)物肽PHB1和PHB3(其在等價的位置處也包含天冬酰胺)更強(qiáng)有力。

結(jié)果顯示，導(dǎo)致引入四個額外的氨基酸(兩個/鏈)的β-發(fā)夾的延伸對于所述肽的抗病毒活性來說是有利的。肽PHB4(與PHB2相比)、PHB8和PHB9(與PHB7相比)的效力是更高的。肽PHB4是該系列中最強(qiáng)有力的，并且是唯一的在其序列中包含所鑒定的三種有利特征的肽。因此，在該實施例中獲得的實驗數(shù)據(jù)以其整體方式支持了本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的設(shè)計的本質(zhì)基礎(chǔ)。

表2.β-發(fā)夾肽的效力、體外毒性和選擇性指數(shù)

*，抗病毒活性(50％抑制活性)；NA，在小于或等于100μM的濃度下不具有抗病毒活性；在1000μM下沒有毒性；ND，未測定。

接著，測定了肽PHB4和HDIII3CL針對DENV的四種血清型的抗病毒活性，以為了比較各自的IC50值。在Vero細(xì)胞中在蝕斑形成抑制測定試驗中對所述肽進(jìn)行評價，對于所述四種血清型(DENV1，NIBSC編號West Pac 74；DENV2，NIBSC編號S16803；DENV3，NIBSC編號CH53489；DENV4，NIBSC編號TVP360)使用0.001的感染復(fù)數(shù)。如在表3中所觀察到的，肽PHB4針對所述四種血清型是高度強(qiáng)有力的，其效力是肽HDIII3CL的4000至7500倍，取決于血清型。PHB4抑制所述四種血清型這一觀察結(jié)果與提議受體α2M*/LRP1作為DENV的四種血清型的內(nèi)吞受體相一致，并且與后面給出的PHB4與這些蛋白質(zhì)相結(jié)合的證據(jù)相一致。

表3.肽PHB4和HDIII3CL針對登革病毒的四種血清型的抗病毒活性

實施例3.β-發(fā)夾肽抑制結(jié)構(gòu)域III與α2M*的結(jié)合

人α2M的純化和激活

從由合并30-40歲的健康人的血漿樣品而得到的380mL人血漿開始來純化人α2M。將血漿在4℃下逆去離子水透析72小時，其中經(jīng)常更換。通過以10000x g離心30分鐘來分離出不溶性物質(zhì)。將上清液逆PBS(pH 6.0)進(jìn)行透析；并施加到XK 50/30柱(Amersham,UK)上，所述柱裝有事先加載了Zn²⁺并用PBS(pH 6.0)進(jìn)行平衡的65mL的Chelating Sepharose Fast Flow(Amersham,UK)。緊接著，將柱用PBS(pH 6.0)進(jìn)行洗滌，直至在280nm下洗出液的吸光度達(dá)到基線。通過施加10mM乙酸鈉、150mM氯化鈉的緩沖液(pH 5.0)來洗脫經(jīng)結(jié)合的蛋白質(zhì)。將所收集的蛋白質(zhì)通過超濾進(jìn)行濃縮。然后，將樣品施加到裝有用PBS(pH 7.8)進(jìn)行平衡的Superdex 200基質(zhì)(Amersham,UK)的凝膠過濾柱上。在具有最高分子量的級分中蛋白質(zhì)的存在通過Western印跡測定試驗來進(jìn)行確證，其中使用抗人α2M的多克隆抗體制備物(Sigma,USA)。對于經(jīng)純化的α2M的激活，將其與200mM甲胺一起在50mM磷酸鈉、150mM氯化鈉(pH 7.4)中進(jìn)行溫育。將α2M_MeNH₂(α2M*)逆50mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉(pH 7.8)進(jìn)行徹底透析。

競爭性測定試驗

肽PHB1-9和HDIII3CL抑制重組DIIIE(DIIIE1J)與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用的能力通過競爭性ELISA測定試驗來進(jìn)行分析。將平板用經(jīng)純化的α2M*級分進(jìn)行包被，并且在數(shù)種濃度的肽和/或重組DIIIE(DIIIE1J)存在下與“DIIIE1J-生物素化的”(經(jīng)純化的并事先經(jīng)生物素化的DIIIE1J)一起進(jìn)行溫育。與α2M*結(jié)合的“DIIIE1J-生物素化的”的檢測通過使用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物來進(jìn)行。重組DIIIE(DIIIE1J)(SEQ ID No.19)的獲得在后面給出，并且其組成為DENV1 1636毒株的病毒多蛋白的殘基289-400(按照序列PIR:A32401的編號)(Chu,M.C.等人,(1989).Journal of General Virology 70(Pt 7),1701-1712)，隨后為具有六個組氨酸的序列。

在低μM至亞μM/nM范圍內(nèi)的肽濃度下，β-發(fā)夾肽PHB5、PHB7、PHB8和PHB9顯示出對于“DIIIE1J-生物素化的”與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合的部分抑制(圖3)，并且觀察到抑制百分比隨肽濃度以單調(diào)方式增加。肽PHB5、PHB8和PHB9是該組中最強(qiáng)有力的抑制劑，并且達(dá)到23％-50％的抑制的值，這與由重組DIIIE所顯示的相似。在所分析的濃度范圍內(nèi)，這三種肽是比肽HDIII3CL更強(qiáng)有力的抑制劑，它們具有高至2-12倍的抑制百分比，取決于所分析的濃度。

在該測定試驗中，肽HDIII3CL達(dá)到僅18％的抑制的最大值，這比最小的β-發(fā)夾肽(肽PHB7)的效力還低。該結(jié)果表明，如果考慮與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用，DIIIE的FGβ-發(fā)夾的鏈間環(huán)的殘基實際上是可以摒棄的，因為在肽PHB7的設(shè)計中，具有6個原始?xì)埢沫h(huán)被替換成IP型β-轉(zhuǎn)角(具有兩個中心殘基)。該轉(zhuǎn)角的序列不與原始的環(huán)序列相關(guān)(因部分相似性和/或同源性)，該肽的β-轉(zhuǎn)角的殘基是由于基本上結(jié)構(gòu)的原因(高的形成連接β-發(fā)夾的IP型轉(zhuǎn)角的傾向)而被引入的。從肽HDIII3CL的原始環(huán)中，在肽PHB7的序列中(和在肽PHB8和9中)僅保留了賴氨酸11(HDIII3CL的序列)(在該情況下，其由肽PHB7的賴氨酸9來代表)的功能性。在結(jié)構(gòu)上，這些賴氨酸占據(jù)相似的(在結(jié)構(gòu)上準(zhǔn)等價的)空間位置，并因此PHB7的賴氨酸9在功能上模擬HDIII3CL的賴氨酸11。

除了賴氨酸9(HDIII3CL的Lys11的模擬物)外，PHB7的其他殘基也在結(jié)構(gòu)上/在功能上模擬HDIII3CL的殘基：a)Asn3、Lys10和Asn12模擬HDIII3CL的殘基Asn3、Lys14和Asn16(這些是在β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)中不通過氫橋連接的殘基)，其相應(yīng)于DIIIE的FG發(fā)夾的暴露面，并因此這些殘基是可能功能性的；b)Trp13相應(yīng)于HDIII3CL的殘基TRP17并且是在黃病毒中嚴(yán)格保守的殘基；c)Cys1和Cys14形成等價于由HDIII3CL的Cys1-Cy18所建立的二硫橋的二硫橋。PHB7相對于HDIII3CL而言的抑制活性的增加有力地暗示了這些共同的殘基在本發(fā)明的肽的功能活性中的推定的作用。

肽PHB8和PHB9是比肽PHB7更強(qiáng)有力的抑制劑。這表明，在PHB8和PHB9中添加四個殘基(兩個/發(fā)夾)對于本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的抑制活性作出了有利貢獻(xiàn)。

如在圖4中所觀察到的，β-發(fā)夾肽PHB5抑制DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合，其中具有與由DIIIE-α2M*所顯示出的相似的肽-α2M*相互作用的表觀親和力，在每一種所檢驗的肽濃度下PHB5的抑制百分比的值僅比由DIIIE1J所顯示的稍低。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的發(fā)夾肽的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行修飾。這對于轉(zhuǎn)角的類型也是有效的，其在PHB5中為IIP型，而在PHB7-9中為IP型β-轉(zhuǎn)角。重要的是在相互作用中的必需殘基的結(jié)構(gòu)等價性，這些必需殘基即使在結(jié)構(gòu)上不同的模型中也類似地進(jìn)行布置。在PHB8和PHB9的折疊中二硫橋的穩(wěn)定化作用被在PHB5的設(shè)計中所引入的Trp“拉鏈”所代替。

本發(fā)明的的一個基本要素是在nM范圍內(nèi)的肽的生物學(xué)活性的分析。肽的高效力可以導(dǎo)致更低的治療劑量，其中具有在下列方面的隨之而來的優(yōu)點：花費，以及和與高劑量相關(guān)聯(lián)的聚集、非特異性相互作用、抗原性和免疫原性問題有關(guān)的可能的不希望效應(yīng)出現(xiàn)的可能性的降低。如在圖5中所顯示的，在nM/亞μM范圍內(nèi)，肽PHB2、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9具有明顯地高于重組DIIIE(DIIIE1J)的抑制“DIIIE1J-生物素化的”與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合的活性，其中所觀察到的抑制百分比典型地高至1.5-3倍。在該濃度范圍內(nèi)，由肽HDIII3CL所顯示的抑制相比于DIIIE1J而言是非常低的。

實施例4.在DIIIE與α2M*的結(jié)合中的必需殘基的作圖

DIIIE(DIIIE1PRS)的丙氨酸突變體文庫的獲得

為了能夠測定DENV1的DIIIE的哪些殘基在與不同配體的相互作用中發(fā)揮重要作用，制備了其突變變體文庫，其中每個暴露殘基系統(tǒng)性地被丙氨酸代替(一種以“丙氨酸掃描”更為人所知的技術(shù))，以便隨后研究所述變體中的每一個與所研究的配體的結(jié)合。在該類型的實驗中，將關(guān)于特定突變體與所研究的配體的結(jié)合的任何改變解釋為該突變殘基參與原始蛋白質(zhì)與所述配體的相互作用的證據(jù)。

為了制備該文庫，從DENV1PRS 288690毒株的包膜蛋白的殘基289至395(該編號按照蛋白質(zhì)序列GenBank:AAN32775.1)出發(fā)(Goncalvez,A.P.等人,(2002),Virology 303(1),110-119)。將相應(yīng)于病毒多蛋白的該片段(其在此被定義為病毒DENV1-PRS 288690毒株的DIIIE(DIIIE1PRS))的序列鑒定為SEQ ID No.15。

在DENV1的DIII中待突變的殘基的選擇

決定基本上基于下列方面來進(jìn)行待突變的殘基的事先選擇：殘基相對于溶劑而言的可接近性，其通過使用程序包WHAT IF 20050919-1718版(Vriend,G.,(1990),J.Mol.Graph.8,52-6)來估計；和每個可能的變體相對于原始蛋白質(zhì)而言在穩(wěn)定性方面的差異的估計，其表示為通過FoldX 6.0版(Schymkowitz,J.等人,(2005).Nucleic Acids Res.33,W382-W388)而計算出的ΔΔG。這些計算基于DIIIE1PRS(SEQ ID No.15的殘基1-105)的同源性模型，其從DENV3的蛋白E的晶體學(xué)坐標(biāo)(Modis,Y.等人,(2003).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100,6986-6991)開始而獲得，并且經(jīng)歷能量最小化過程。

最終所選用的選擇標(biāo)準(zhǔn)是：高于15％的相對可接近性，和低于4kcal/mol的ΔΔG。按照該標(biāo)準(zhǔn)而被選擇用于突變?yōu)锳la的79個位置以及關(guān)于所提及的參數(shù)的計算結(jié)果顯示在表4中。

表4.被選擇用于包括在DIIIE1PRS的Ala掃描中的殘基

ΔΔG：Ala突變體相對于野生型而言的在穩(wěn)定性方面的差異(1：沒有最小化的模型，2：經(jīng)最小化的模型)；％AAC：對于溶劑的可接近性的％。帶陰影的殘基相應(yīng)于具有高于4kcal/mol的ΔΔG的位置。

用于在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)DIIIE1PRS及其突變變體的重組質(zhì)粒的獲得

在選擇了待被包括在丙氨酸掃描中的DIIIE1PRS的殘基后，制備重組質(zhì)粒以用于其以及文庫的變體中的每一個在大腸桿菌中的異源表達(dá)。這通過下述方式來進(jìn)行：通過Agarwal等人的方法(Agarwal KL等人,(1970),Nature 227,27-34)并且從經(jīng)由亞磷酰胺方法(Beaucage SL&Caruthers MH(1981).Tetrahedron Letters,22,1859)在固相上合成的寡核苷酸開始，合成雙鏈DNA分子，其編碼DENV1PRS 288690毒株的蛋白E的殘基289-400(蛋白質(zhì)序列GenBank:AAN32775.1)(Goncalvez,A.P.等人,(2002).Virology 303(1),110-119)，隨后為具有六個組氨酸的序列。在此，將所編碼的蛋白質(zhì)定義為重組DIIIE1PRS(rDIIIE1PRS，SEQ ID No.17)。所合成的雙鏈DNA分子(SEQ ID No.16)包含對于限制酶Nde I和Xho I的切割位點，其被設(shè)計用于其同相插入到質(zhì)粒pET22b(Novagen Inc.,USA)中。在用限制酶Nde I和Xho I于由制造商所明確說明的條件下消化該多核苷酸后，將其通過使用T4DNA連接酶于由制造商所明確說明的條件下連接至事先以相同方式進(jìn)行消化的質(zhì)粒pET22b(Novagen,Inc.)。將所獲得的反應(yīng)混合物按照Sambrook等人(Sambrook J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual.New York,USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL-1Blue株(Bullock WO等人,(1987).Biotechniques,5:376-8)中，并且對在于選擇培養(yǎng)基上獲得的菌落中所存在的質(zhì)粒進(jìn)行探查、純化和測序，最終選擇其序列相應(yīng)于所期望的序列(給予其名稱pET-DIII DENV1(SEQ ID No.18))的質(zhì)粒，其呈現(xiàn)在圖6中。

用于表達(dá)先前選擇的DIIIE1PRS的79個突變變體的重組質(zhì)粒的構(gòu)建以相同方式來進(jìn)行，但在該情況下合成這樣的雙鏈DNA分子，其中相應(yīng)于待突變的殘基的密碼子序列被序列GCG(其相應(yīng)于丙氨酸的密碼子)代替。在每個變體中被代替的密碼子連同其所編碼的氨基酸一起顯示在表5中。

表5.在DIIIE1PRS的突變體文庫的每個變體中，被丙氨酸代替的殘基以及被GCG代替的相應(yīng)密碼子

將DIIIE1PRS的突變體文庫的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中和將所獲得的克隆冷凍保存

為了獲得包含用于在大腸桿菌宿主中表達(dá)所選擇的DIIIE1PRS變體的質(zhì)粒的大腸桿菌克隆，制備大腸桿菌BL21(DE3)株的感受態(tài)細(xì)胞(Studier,F.W.&Moffatt,B.A.(1986)J.Mol.Biol.189(1),113-130)并將其分成等分試樣，將所述等分試樣中的每一個分開地用20ng的在所述突變體文庫的質(zhì)粒中的僅一種進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中使用常規(guī)方法(Sambrook,J.等人,Molecular cloning:A laboratory manual.1989.New York,USA,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的等分試樣分開地接種在包含100μg/mL氨芐青霉素的LB-瓊脂培養(yǎng)基平板上。在于37℃下12小時的生長期后，從每一個板中選擇良好隔離的菌落，將其接種在處于試管中的5mL的補(bǔ)充有100μg/mL氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中。將所得的培養(yǎng)物在攪拌下(200rpm)于37℃進(jìn)行溫育直至出現(xiàn)可見的混濁，然后分開地在無菌條件下于25℃以3000x g離心20分鐘，將每個重懸浮在250μL新鮮的LB+250μL40％(v/v)甘油中，并又分成100μL的等分試樣，將其貯存于-70℃。

DIIIE1PRS的突變變體的純化

在獲得了用于表達(dá)DIIIE1PRS的突變體文庫中的每一種變體的經(jīng)冷凍保存的大腸桿菌克隆的集合之后，最后以小規(guī)模純化所述變體中的每一種。在每種情況下，這通過下述方式來進(jìn)行：在具有50mL的補(bǔ)充有100μg/mL氨芐青霉素的ZYM5052培養(yǎng)基(Studier,F.W.(2005).Protein Expr.Purif.41(1),207-234)的1L的錐形瓶中接種包含相應(yīng)質(zhì)粒的大腸桿菌克隆的一個經(jīng)冷凍保存的等分試樣，將所得的培養(yǎng)物在37℃和300r.p.m.下溫育12小時。在所述時間段結(jié)束時，將培養(yǎng)物于25℃以3000x g離心20分鐘并棄去上清液，將所得的生物質(zhì)重懸浮在19mL的包含6M GuHCl的AG緩沖液(1X PBS，0.3mol/L NaCl，20mM咪唑)中，并且通過在配備有U200-14探頭的超聲發(fā)生器中以最大振幅和70％的功率進(jìn)行超聲處理30秒鐘來消除勻漿物的粘性。接著，將勻漿物通過于25℃以3000x g離心45分鐘來進(jìn)行澄清，并將上清液與0.3mL的Ni²⁺-氨三乙酸-瓊脂糖(Ni-NTA瓊脂糖,Qiagen,Germany)一起在25℃下在擺動的搖動器上溫育1小時。在該時間段后，將樹脂通過重力裝入空的NAP-10柱(GE Healthcare,USA)中，并通過重力順次地用一系列具有在6M和1.2M之間的逐漸降低的濃度的GuHCl的AG緩沖溶液和最后用A緩沖液(1X PBS，0.3M NaCl，20mM咪唑)進(jìn)行洗滌。接著，將柱在0.3mL的E緩沖液(1X PBS，0.3M NaCl，300mM咪唑)中進(jìn)行平衡，并且用E緩沖液來洗脫蛋白質(zhì)。通過凝膠過濾(Sephadex G-25)，將洗出物緩沖液立即變換成1X PBS。所得的制備物的總蛋白質(zhì)濃度通過雙金雞寧酸方法(Smith,P.K.(1985).Anal.Biochem.150(1),76-85)來進(jìn)行測定，在這之后將10μL的每種制備物通過在還原條件下的SDS-PAGE(Laemmli,U.K.(1970).Nature 227(259),680-685)來進(jìn)行分析以保證不存在降解。將經(jīng)純化的DIIIE1PRS的變體的集合貯存于-20℃直至其使用。

競爭性測定試驗

DIIIE1PRS的丙氨酸突變體抑制重組DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用的能力通過競爭性ELISA測定試驗來進(jìn)行分析。將平板用經(jīng)純化的α2M*級分進(jìn)行包被，并且在數(shù)種濃度的屬于上面所描述的單突變體文庫的每個DIIIE1PRS的丙氨酸突變體存在下與“DIIIE1PRS-生物素化的”一起進(jìn)行溫育。與α2M*結(jié)合的“DIIIE1PRS-生物素化的”的檢測通過使用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶綴合物來進(jìn)行。將光密度值擬合成劑量-應(yīng)答曲線，并計算相應(yīng)于每個突變體和重組蛋白質(zhì)DIIIE1PRS(天然序列)的IC50值。

如在圖7中所觀察到的，結(jié)構(gòu)域III的五個殘基(Lys361、Glu262、Pro264、Val365和Lys385)通過丙氨酸來進(jìn)行的突變引起超過一個數(shù)量級的IC50值的增加(親和力的降低)?？紤]到在IC50值降低方面的兩倍的閾值，全部13個殘基以該量值影響相互作用。除了已經(jīng)提及的五個殘基外，在該組中還包括殘基Glu342、Thr34、Arg350、Lys363、Asn366、Pro372、Gly374和Glu375。

DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合牽涉該結(jié)構(gòu)域的表面的兩個獨立的斑片(圖7和8)，其中一個位于上表面(N-末端所位于之處)和另一個位于下表面(該結(jié)構(gòu)域的C-末端)。上表面的斑片包含對相互作用貢獻(xiàn)最大的殘基，包括其通過丙氨酸進(jìn)行的突變引起在親和力方面的超過10倍降低的五個殘基。因此，可以認(rèn)為所述斑片為在病毒的DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*之間的相互作用的初級位點。該斑片通過線性區(qū)段Lys361-Asn366和通過殘基Lys385(作為必需殘基)來成形。

位于該結(jié)構(gòu)域的下表面的第二個斑片(圖7和8)由殘基Glu342、Thr346、Arg350、Pro372、Gly374和Glu375來限定。由于這些殘基被丙氨酸置換而引起的親和力的降低相比于上部斑片而言是較低的，因此其可以被認(rèn)為是次級相互作用位點。

在DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用位點的作圖中所獲得的結(jié)果有力地支持了本發(fā)明的β-發(fā)夾肽的設(shè)計的基礎(chǔ)。所述肽具有在結(jié)構(gòu)上/在功能上模擬DIIIE的殘基Lys385(其是單個地對相互作用貢獻(xiàn)最大的氨基酸)的賴氨酸殘基(超過22倍的在親和力方面的降低，當(dāng)突變?yōu)楸彼釙r)。所述肽的模擬該殘基的殘基為：PHB2的Lys8和PHB5的d-Lys8，PHB1、PHB6和PHB7的Lys9，PHB4的Lys10，以及PHB3、PHB8和PHB9的Lys11。

當(dāng)考慮與蛋白質(zhì)α2M*的相互作用時最強(qiáng)有力的五種發(fā)夾肽(圖5，實施例3)中的四種(PHB4、PHB5、PHB8和PHB9)具有在結(jié)構(gòu)上/在功能上模擬DIIIE的殘基Glu375的殘基。該殘基是在該實施例4中所確定的次級結(jié)合位點的最重要的殘基。所述β-發(fā)夾肽的模擬所述殘基Glu375的殘基為：PHB3、PHB4、PHB8和PHB9的Glu3；以及PHB5和PHB6的Glu16。因此，本發(fā)明的抑制與α2M*的結(jié)合的最強(qiáng)有力的肽同時具有模擬在該實施例中所描述的初級和次級斑片的最重要殘基的殘基。

實施例5.超分子結(jié)構(gòu)的形成

肽PHB4的聚集動力學(xué)

使用光散射來監(jiān)測肽PHB4的聚集。光散射的測量在分光熒光計Shimadzu^TM RF-5301 PC(Shimadzu,Japan)中進(jìn)行。通過使用由該儀器的制造公司所提供的程序來獲取數(shù)據(jù)。將入射(激發(fā))和散射(發(fā)射)光束的波長調(diào)整至320nm，其中具有5nm的激發(fā)和發(fā)射孔徑。肽的散射通過從由肽溶液所散射的光的強(qiáng)度中減去由沒有肽的溶液(空白)所散射的光的強(qiáng)度值來計算。由于其溶解在PBS中而產(chǎn)生的肽的散射的變化通過以時間過程方式(采用一次或兩次測量/秒這樣的頻率)實施測量來進(jìn)行研究。肽在PBS中的溶液從肽在水中的溶液開始通過在2X PBS中進(jìn)行1:2稀釋來制備。

一旦溶解在PBS中且在少于2分鐘的潛伏時間后，由肽所散射的光的強(qiáng)度在最初30-40分鐘期間迅速增長，然后繼續(xù)以線性動力學(xué)緩慢地增加直至300分鐘(最大研究時間)。圖9顯示了對于10μΜ和5μΜ的肽濃度所獲得的相對于在零時間處的分散值而言的散射光強(qiáng)度的變化圖。肽的行為在兩種濃度下是相似的，盡管在5μΜ下所觀察到的的最大值大于在10μΜ下所觀察到的(11對7)，這暗示在較低的肽濃度下發(fā)生的聚集最終導(dǎo)致形成具有相對于原始平均大小而言更大的平均大小的聚集體。所述圖用SigmaPlot 10.0(Systat Software Inc.)來繪制。

通過透射電子顯微鏡術(shù)來研究肽PHB4的超分子結(jié)構(gòu)的形態(tài)

為了鑒定由肽PHB4所形成的聚集體的形態(tài)，使其經(jīng)歷不同的與聚集過程相關(guān)聯(lián)的實驗條件：溫度、溫育時間和電解質(zhì)的存在(圖10)。為了該研究，制備以2mg/ml(0.73mM)的濃度的該肽在水和PBS中的樣品。將這些中的一個部分直接固定在方格網(wǎng)中并在顯微鏡下進(jìn)行觀察(樣品T0)。將每個樣品的第二個部分在50℃下溫育1小時并隨后立即固定(樣品T1)，而將第三個部分在熱處理后在環(huán)境溫度下維持額外兩個小時的時間(樣品T2)。

如在圖10A中所觀察到的，在水中的肽在環(huán)境溫度下形成直徑為5-20nm的顆粒。在這些顆粒的基礎(chǔ)之上，在50℃下的處理誘導(dǎo)了5-10nm的初原纖維/原纖維類型的絲狀結(jié)構(gòu)的形成(圖10E)。在水中原纖維的形成需要潛伏時間，因為在熱處理后僅在樣品T2中檢測到它們。纖維的形成機(jī)制在離子強(qiáng)度存在下(PBS)是非常有利的，其中緊接在將肽重懸浮在PBS中后觀察到存在有直徑為5-20nm的絲狀結(jié)構(gòu)(圖10B)。在將樣品于50℃加熱一小時后纖維變得更多(圖10D和10F)。上面的結(jié)果證明，肽PHB4的聚集是一個由溫度和由離子強(qiáng)度(PBS)的存在促進(jìn)的過程。

該研究清楚地表明，肽PHB4形成超分子聚集體，其形態(tài)取決于環(huán)境條件和溫度。纖維狀結(jié)構(gòu)的尺寸與淀粉狀蛋白類型的結(jié)構(gòu)的形成相一致，其特征在于通過延伸的β-片層的形成而伸長的纖維的增長。

蛋白質(zhì)的聚集過程由蛋白質(zhì)分子之間的排斥相互作用和吸引相互作用之間的平衡來控制(Juárez,J.等人,(2009)Biophysical Journal96[6],2353-2370)。已知向蛋白質(zhì)溶液中添加電解質(zhì)使得原纖維形成速度的增加成為可能，這是屏蔽了蛋白質(zhì)分子之間靜電排斥的結(jié)果，其中促進(jìn)使得聚集體的形成成為可能的分子間相互作用(Juárez,J.等人,(2009)Biophysical Journal 96[6],2353-2370；Sagis,L.M.等人,(2004).Langmuir 20,924-927)。同時，分子間相互作用過程的動力學(xué)隨溫度的增長而得到促進(jìn)，其是在蛋白質(zhì)聚集體的誘導(dǎo)中的基本因素。實施例6.β-發(fā)夾肽與受體LRP1的片段的相互作用的研究

已知使用干擾DENV與稱為LRP1的受體的相互作用的分子阻斷對于細(xì)胞的感染(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。

LRP1是一種膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(圖11A)，其由非共價地締合的大約500kDa的α鏈和85kDa的β鏈形成(Anna P.Lillis等人,(2008)Physiol Rev 88:887-918)。胞外區(qū)由α鏈和β鏈的片段構(gòu)成。β鏈還包含一個跨膜區(qū)段和兩個NPxY序列，所述NPxY序列用作與牽涉信號傳導(dǎo)和胞吞作用的蛋白質(zhì)偶聯(lián)的位點。LRP1是可以內(nèi)化多于30種不同配體的組成性胞吞受體，并且與許多具有至關(guān)重要的重要性的功能(例如，脂質(zhì)代謝、止血、溶酶體酶的激活和神經(jīng)傳遞)相關(guān)。

LRP1的α鏈介導(dǎo)與LRP1的胞外配體的相互作用。該鏈具有LRP1所劃歸的低密度脂蛋白受體家族的成員蛋白質(zhì)的典型的結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域構(gòu)造。特別地，LRP1包含四個集群，其分別具有2個(簇I)、8個(簇II)、10個(簇III)和11個(簇IV)與補(bǔ)體蛋白質(zhì)的富含半胱氨酸的區(qū)域這樣類型的配體結(jié)合的位點。在每一個配體結(jié)合位點集群之后接著的是與表皮生長因子具有相似性的結(jié)構(gòu)域(其由富含半胱氨酸的區(qū)域來成形)和YWTD結(jié)構(gòu)域。

為了評價LRP1的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與DENV的DIIIE的直接相互作用，使用包含與6His尾巴相融合的下列殘基的重組蛋白質(zhì)(SEQ ID No.19-22)：相應(yīng)于病毒毒株“牙買加/CV1636/1977”的DENV1的殘基289-399(DIIIE1J)；DENV2“牙買加1409”毒株的殘基289-399(DIIIE2)；DENV3H-87毒株的殘基287-397(DIIIE3)；和DENV4“多米尼加814669”毒株的殘基289-399(DIIIE4)，如在圖11C中所呈現(xiàn)的。蛋白質(zhì)DIIIE1J和DIIIE2-DIIIE4通過在大腸桿菌中的異源表達(dá)來獲得，并且通過具有金屬螯合物的親和層析來進(jìn)行純化，從而獲得具有大于90％純度的制備物，如在SDS-PAGE分析中所證明的那樣(圖11D)。還使用三種重組蛋白質(zhì)，其包含與IgG1類型人免疫球蛋白的恒定區(qū)(R&D Systems,USA)相融合的LRP1的簇II、III和IV(分別命名為sLRP1-CII(SEQ ID No.23)、sLRP1-CIII(SEQ ID No.24)和sLRP1-CIV(SEQ ID No.25))(圖11B)。

相互作用的評價通過ELISA類型的測定試驗來進(jìn)行，其中將96-孔平板用10μg/ml的蛋白質(zhì)DIIIE1J和DIIIE2-DIIIE4進(jìn)行包被，用牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉，并在37℃下與在20mM Hepes緩沖液(pH 7.0)、150mM NaCl、1mM CaCl₂、0.05％Tween 20中的濃度為10μg/ml的sLRP1CII、sLRP1CIII和sLRP1CIV一起溫育1小時。在洗滌之后，將平板在37℃下與抗人IgG-過氧化物酶綴合物的1:1000稀釋物一起溫育1小時，并使用底物鄰苯二胺/H₂O₂來進(jìn)行揭示。所獲得的結(jié)果顯示了所述四種血清型的DIIIE的相似的相互作用模式，其中用蛋白質(zhì)sLRP1-CIV和sLRP1-CII獲得了較大的反應(yīng)性(sLRP1-CIV>sLRP1-CII)，而用蛋白質(zhì)sLRP1-CIII則未檢測到反應(yīng)性(圖12)。

為了研究所述肽與所述受體的可溶性片段的相互作用，使用Biacore X設(shè)備，其采用稱為表面等離子體共振的光學(xué)原理用于檢測。為了使用該技術(shù)，將待研究的分子之一固定化在構(gòu)成測量室的面之一的芯片表面上。另一分子以溶液形式進(jìn)行使用，并在受控流條件下流過測量室。相互作用物的締合和解離以RU來進(jìn)行測量，并且按照時間在稱為傳感圖的圖中可視化。以該方式還可能的是，無需對分子進(jìn)行標(biāo)記就能獲得關(guān)于相互作用的詳細(xì)信息。

為了進(jìn)行測量，將蛋白質(zhì)sLRP1-CIV以高密度條件(參見表6)固定化在CM5芯片(General Electric Healthcare,USA)的溝道中。在同一芯片的另一溝道中固定化重組HSA(HSArec)(Sigma-Aldrich,USA)。從對于所述蛋白質(zhì)之一所達(dá)到的RU密度出發(fā)，并考慮到每一個sLRP1-CIV分子中11個潛在的相互作用位點和每一個HSA分子中一個位點的存在，獲得了關(guān)于這兩種蛋白質(zhì)的相似的每單位表面的結(jié)合位點密度(pmol/mm²)。

表6.用于評價與sLRP1-CIV的相互作用的CM5芯片的表面的特征的概括

為了評價經(jīng)固定化的蛋白質(zhì)的反應(yīng)性，使用兩種已知的LRP1的配體：α2M，和稱為受體相關(guān)蛋白(RAP，Receptor associated protein)的蛋白質(zhì)。以前已證明，這兩種蛋白質(zhì)與受體LRP1的簇IV相互作用(Jaap G.Neels等人,(1999).Journal of Biological Chemistry,274,44:31305-31311)。在圖13中，正如可以看出的，α2M和RAP的施加僅在相應(yīng)于sLRP1-CIV的溝道中引起信號(RU)的增加，而在相應(yīng)于HSArec的溝道中未觀察到任何信號增加。該結(jié)果證明，經(jīng)固定化的蛋白質(zhì)sLRP1-CIV能夠建立與這兩種配體的特異性相互作用。

以高密度進(jìn)行的固定化應(yīng)當(dāng)有助于具有比蛋白質(zhì)小的大小的分子(例如可以是肽)的特異性相互作用的檢測。然而，在該條件下，質(zhì)量傳遞限制現(xiàn)象和建立與多于一個的配體分子的多價結(jié)合的可能性使得測定相互作用的動力學(xué)常數(shù)變得困難。為了更詳細(xì)地表征sLRP1-CIV的表面的反應(yīng)性，施加不同稀釋度(0.6-20μΜ)的蛋白質(zhì)RAP，并在相互作用平衡條件下記錄RU(250秒，參見圖13B)。通過將對于不同稀釋度而達(dá)到的最大RU針對濃度進(jìn)行繪圖而獲得曲線顯示了與雙位點相互作用模型擬合的行為，其表明存在KD為4.2nM的高親和力相互作用和KD為1.1μΜ的低親和力相互作用。該行為與在關(guān)于RAP與受體LRP1的相互作用的不同研究中所獲得的結(jié)果(其表明RAP可以以在6-18nM范圍內(nèi)的親和力建立與LRP1的簇II和IV的多點相互作用)相一致。然而，還從某些在多價結(jié)合中發(fā)生的相互作用的喪失開始而獲得了在μM范圍內(nèi)的親和力值。因此，在該工作中所使用的sLRP1-CIV表面上的親和力處于μM級別的相互作用的獲得可以從在芯片表面上的高蛋白質(zhì)密度(其有助于在較大的RAP濃度下影響多價結(jié)合)來進(jìn)行解釋。這些結(jié)果還指明，經(jīng)固定化的蛋白質(zhì)sLRP1-CIV復(fù)制了對于LRP1與RAP已經(jīng)描述了的相互作用的特征。

對于sLRP1-CIV的同一表面，以20μΜ的濃度施加在運行緩沖液中進(jìn)行稀釋的肽的不同變體。在所獲得的結(jié)果中，對于不同的肽變體看出不同的相互作用水平。在所述肽的情況下，所獲得的信號的量值與其聚集形式的結(jié)合相一致。因此，所獲得的信號可以是在肽與受體中的相互作用位點之間的相互作用的內(nèi)在親和力或者單一相互作用的強(qiáng)度方面的增加的結(jié)果，以及是由于被摻入到聚集結(jié)構(gòu)中并具有與受體的不同相互作用位點建立相互作用的能力的肽單元的數(shù)量的增加而引起的親和力提高的結(jié)果。

在HDIII3CL家族的肽(表1的肽10-14)的情況下，對于變體HDIII3CL2獲得了最高的結(jié)合水平。在變體HDIII3CLW和HDIII3CLK的情況下，還獲得了證明這些肽具有一定水平的與經(jīng)固定化的蛋白質(zhì)結(jié)合的曲線。然而，這兩種變體的信號比對于肽HDIII3CL所獲得的信號小，這表明殘基W17和K14的獨個置換導(dǎo)致更小的與sLRP1-CIV的結(jié)合。對于變體HDIII3CLC所獲得的信號表明，通過殘基C1和C18的置換(和二硫橋的隨后消除)對于相互作用所產(chǎn)生的影響僅允許該肽與sLRP1-CIV的邊緣相互作用。該結(jié)果與由所述肽所顯示的抗病毒活性效力相一致；相對于HDIII3CL而言顯示出與受體的結(jié)合降低的HDIII3CLC、HDIII3CLW和HDIII3CLK在Vero細(xì)胞中不具有針對DENV2的抗病毒活性(參見表2)。相反，對于HDIII3CL2所觀察到的與受體的結(jié)合的增加未表現(xiàn)在相對于HDIII3CL而言的抗病毒活性的增加中(參見表2)。該結(jié)果表明，與受體的結(jié)合本身是必需的，但對于抗病毒活性來說不是足夠的。一種可能的解釋是，肽HDIII3CL2的一部分與在病毒-受體相互作用中不重要的和/或以非常低的親和力進(jìn)行結(jié)合的該受體的位點相結(jié)合。考慮到受體LRP1和/或其簇是多結(jié)構(gòu)域的，這樣的情形是合理的。肽HDIII3CL2和HDIII3CL之間的差異是：前者具有一個額外的C-末端賴氨酸。因此，所述肽是更加陽離子的，并且可能具有額外的與陰離子性質(zhì)的受體LRP1的靜電類型的相互作用。此外，所述賴氨酸21不構(gòu)成發(fā)夾的一部分，所述發(fā)夾是模擬在本發(fā)明中和以前(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)所描述的DIIIE的功能性斑片的拓?fù)鋵W(xué)區(qū)域。

以相同的方式評價了β-發(fā)夾肽PHB1、PHB2、PHB3、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9與sLRP1-CIV的表面的相互作用。如在圖14B和14D中所顯示的，對于肽PHB4獲得了顯著更高的結(jié)合水平，所述肽PHB4還是在抗病毒活性測定試驗中最有活性的。肽PHB2、PHB4和PHB9也顯示了比對于肽HDIII3CL所觀察到的更高的最大結(jié)合(圖14A和14C)，這與它們的更高的抗病毒活性相符。此外，在具有相同大小和β-轉(zhuǎn)角類型的肽PHB1-2、PHB3-4和PHB8-9之間所觀察到的最大結(jié)合的比較顯示，肽PHB2、PHB4和PHB9是比其對應(yīng)物PHB1、PHB3和PHB8更好的結(jié)合劑，與對于抗病毒活性(在實施例2中所研究的)所觀察到的相似地。

實施例7.β-發(fā)夾肽的抗病毒活性與其結(jié)合受體LRP1和蛋白質(zhì)α2M*的能力之間的相關(guān)性

以前已提出了作為DENV的推定的胞吞受體的受體LRP1，和在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中具有可能的載體蛋白作用的蛋白質(zhì)α2M*(Huerta G.V.等人,WO 2007/124698)。

在實施例6中證明了，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽能夠與受體LRP1的片段相結(jié)合。在本實施例中，探察在實施例2中所觀察到的抗病毒活性是否與所述肽與受體LRP1結(jié)合的能力定量地相關(guān)。如在圖15中所觀察到的，在Vero細(xì)胞中的抗病毒活性的IC50值的對數(shù)(-pIC50)顯示出與在運行400s時所觀察到的Biacore信號(RUrem)的線性關(guān)系。在該情況下，顯示了共有相同的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的PHB肽(按照表1)。肽PHB4顯示出比其余肽高得多的在抗病毒活性方面的效力，但還觀察到超越了其余肽的行為的該肽與受體的結(jié)合。即使抽出相應(yīng)于PHB4的數(shù)據(jù)，線性也得到保留(圖15中的插入圖)，線性回歸系數(shù)R²為0.99(在考慮PHB4的情況下)，和0.97(如果沒有PHB4)。插入圖的數(shù)據(jù)的分析預(yù)測，如果保持關(guān)于PHB4的線性行為，那么在Biacore中所觀察到的與受體結(jié)合的值與在nM范圍內(nèi)的高的抗病毒活性效力相符。這樣的所期望的效力與在實施例2中通過實驗而觀察到的相一致。

該系列的具有相似拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的肽的抗病毒活性的pIC50數(shù)據(jù)顯示出與RUrem值的在統(tǒng)計學(xué)上顯著的相關(guān)性，r(皮爾遜)＝-0.9957和P<0.0001。在從數(shù)據(jù)中排除肽PHB4的情況下，相似地獲得r(皮爾遜)＝-0.9868，P＝0.0018。用程序GraphPad Prism v5.03來實現(xiàn)相關(guān)性分析、線性回歸和圖。

這些結(jié)果與通過影響在病毒與受體LRP1之間的相互作用(其導(dǎo)致病毒向細(xì)胞中的生產(chǎn)性進(jìn)入的抑制)而介導(dǎo)的PHB肽的抗病毒作用機(jī)制相一致。

在考慮到PHB肽在亞μM/nM范圍內(nèi)抑制DIIIE與蛋白質(zhì)α2M*結(jié)合的能力的情況下，進(jìn)行相似的分析。如在實施例3中所顯示的，在所述濃度范圍內(nèi)，所述肽部分地抑制“DIIIE1J-生物素化的”與蛋白質(zhì)α2M*的結(jié)合，其中肽PHB2、PHB4、PHB5、PHB8和PHB9明顯地優(yōu)于重組DIIIE(DIIIE1J)，并且所述肽顯示出典型地高至該結(jié)構(gòu)域的1.5至3倍的抑制百分比。PHB肽的抑制能力(相對于重組DIIIE的抑制能力而言)與在Vero細(xì)胞中抑制DENV2感染的能力相關(guān)，正如在圖16中所觀察到的。在IC50值和與α2M*的結(jié)合的抑制百分比(相對于重組DIIIE的抑制而言來表示)之間的斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)系數(shù)為Rs＝-0.9762，P＝0.0004。該結(jié)果暗示，本發(fā)明的β-發(fā)夾肽可能在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中干擾蛋白質(zhì)α2M*的作用。

實施例8.改變聚集作用的試劑對于肽PHB4的抗病毒活性的影響

在不同的改變聚集作用的因素存在下，在有助于形成聚集體的條件下進(jìn)行處理后評價肽PHB4的抗病毒活性，以便評價其對于由DENV2(S16803毒株)引起的Huh 7.5細(xì)胞感染的抑制活性的影響。Huh 7.5細(xì)胞系源自人肝細(xì)胞瘤。選擇該細(xì)胞系是鑒于這些細(xì)胞對于DENV2感染是高度敏感的，并且是從在人中感染的發(fā)病機(jī)制的觀點來看重要的系統(tǒng)(Lin YL等人,(2000)J Med Virol.,60(4):425-31)。

從在實施例5中所獲得的結(jié)果(其證明了肽PHB4在水至具有更大離子強(qiáng)度的介質(zhì)中溶解的步驟改變聚集結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài))開始，采用一般性的實驗設(shè)計，其中以肽在水中的溶液為出發(fā)點，并進(jìn)行在(i)MEM培養(yǎng)基或(ii)PBS中的稀釋，在待評價的不同條件下。這兩種溶液分別包含6.8g/L和8.0g/L的NaCl，并且調(diào)整至pH 7.4。

在病毒產(chǎn)量測定試驗中評價抗病毒活性。為此，將Huh 7.5細(xì)胞的單層(80-90％匯合)用沒有補(bǔ)充物的DMEM培養(yǎng)基(DMEM s/FBS)洗滌兩次，并且在不同的肽PHB4制備物存在或不存在下在37℃和5％CO₂下以0.01的m.o.i感染2小時。通過用DMEM s/FBS進(jìn)行洗滌來除去病毒接種物，并添加200μL/孔的補(bǔ)充有2％FBS的DMEM培養(yǎng)基。在感染后24小時收集被感染的細(xì)胞的上清液，并且通過經(jīng)由裂解斑形成測定試驗(Morens D.M.等人,(1985).N.J.Clin.Microbiology,22:250-254)對上清液進(jìn)行滴度測定來測定病毒產(chǎn)量。

已知溫度是影響自裝配成超分子結(jié)構(gòu)的肽的聚集過程的動力學(xué)的一個因素(SabatéR.等人,(2012).Biomacromolecules,13(2):474-83)。在第一系列的測定試驗中，以20μΜ的肽在水中的溶液為出發(fā)點，并制備在MEM中的在10-0.01μΜ范圍內(nèi)的稀釋物，將其在10℃下和在37℃下平行地溫育2小時。作為對照，使用肽在MEM培養(yǎng)基中的相同的稀釋物，其在用于該測定試驗中之前不進(jìn)行溫育。

結(jié)果顯示，溶解在MEM培養(yǎng)基中的肽能夠以依賴于濃度的行為和0.16μΜ的IC50值抑制病毒感染，其中在10μΜ的濃度下達(dá)到感染的完全抑制(圖17，表7)。然而，在10℃下在DMEM培養(yǎng)基中肽的預(yù)溫育引起效力的增加，達(dá)到0.037μΜ的IC50值；而在37℃下，具有直至0.89μΜ的值的IC50的增加。這些結(jié)果表明，在這兩種溫度下進(jìn)行的肽的溫育正改變肽的聚合，其中使得其作為抗病毒試劑的效力變化了總共24倍。

表7.在10℃和37℃下進(jìn)行溫育的肽PHB4的IC50值

通過使用統(tǒng)計學(xué)程序GraphPad Prism v5.3，經(jīng)由非線性擬合來測定在每種實驗條件下IC50的調(diào)整。*在括號中指明了所述擬合的回歸系數(shù)(R2)的值。

為了調(diào)查聚集體的生長時間對于抗病毒活性效力的影響，設(shè)計了一個實驗(圖18)，其中以不同的時間區(qū)間將肽在PBS中進(jìn)行溫育，隨后在相同體積的在DMEM中的80mg/ml HSA之中進(jìn)行稀釋，以便檢測聚集。HSA是強(qiáng)有力的改變聚集作用的試劑。證明了，HSA可以抑制淀粉狀蛋白的β-肽的原纖維的初始形成和生長(Reyes A.等人,(2009)Journal of Biological Engineering,3:5)。在10℃下和在37℃下平行地進(jìn)行與HSA的溫育(圖18)。為了評價抗病毒活性，制備在DMEM中的HSA(以40mg/ml)之中的肽的稀釋物。

如在圖19中所觀察到的，在該測定試驗中所使用的條件下，獲得了倒U形的劑量-應(yīng)答行為，這表明在抑制活性中存在最佳的肽濃度范圍。已在大量的生物系統(tǒng)的活性中獲得了該類型的應(yīng)答。解釋該類型行為的機(jī)制在每個系統(tǒng)中是不同的，雖然共同要素是在所牽涉的分子之間存在多價相互作用。

所述結(jié)果證明，肽的抑制活性對于在PBS中的溫育時間(用于形成具有更大效力的聚集體)敏感，在該情況下效力是指達(dá)到將該測定試驗的感染對照的病毒產(chǎn)量減少50％的最小肽濃度。另外，在10℃下與HSA的溫育導(dǎo)致形成具有較小效力的變體，相比于通過在37℃下進(jìn)行溫育所獲得的結(jié)果而言。該事實確證，應(yīng)當(dāng)存在肽(或肽的在生長中的聚集體形式)與HSA之間的相互作用，其改變聚集現(xiàn)象的演化并允許形成具有高效力的變體，從而以1nM-10pM的肽濃度達(dá)到感染的完全抑制，如通過在PBS中溫育45-60分鐘以及在37℃下與HSA溫育而獲得的那樣。

肽的初始濃度是另一個參數(shù)，已觀察到其可以顯著地影響聚集過程的動力學(xué)和結(jié)果。為了獲得關(guān)于該參數(shù)對于肽PHB4的抗病毒活性的影響的證據(jù)，進(jìn)行在圖20中示意性地描繪的測定試驗，其中以在水中的在100μΜ-2μΜ范圍內(nèi)的不同稀釋物為起點，將其在2X MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行1:1v/v稀釋，并在25℃下溫育2小時。在該溫育結(jié)束時，制備肽在DMEM s/FBS培養(yǎng)基中的稀釋物，其立即被用于抗病毒活性的測定試驗中。

在該實驗的結(jié)果中，觀察到肽PHB4的抗病毒活性對于該肽在水中溶解的初始濃度的依賴性，在將其添加至具有更大離子強(qiáng)度的溶液中以引發(fā)聚集體生長之前(圖21)。結(jié)果還顯示了在劑量-應(yīng)答行為方面的變化，其確證了向著不同聚集結(jié)構(gòu)的演化，這取決于肽在水中溶解的初始條件。最強(qiáng)有力的形式再次顯示出以倒U形式的劑量-應(yīng)答曲線，并且是對于肽處于在該測定試驗中所評價的在水中的最大初始稀釋度這樣的條件而獲得的。

總之，所獲得的結(jié)果證明，肽PHB4可以實現(xiàn)具有在nM-亞nM濃度范圍內(nèi)的效力的聚集形式，這取決于所采用的聚集體形成條件。重要的是強(qiáng)調(diào)，在這些實驗中所使用的抗病毒活性測定試驗代表了用于所評價的分子的最嚴(yán)苛測定試驗的變化形式之一，因為所述分子僅在感染的初始階段中存在，然后通過對細(xì)胞的洗滌而被撤去。在該實驗方案中所獲得的對感染的抑制與病毒感染細(xì)胞的早期階段(例如，與細(xì)胞表面的結(jié)合、內(nèi)化和膜融合)的抑制相一致。

實施例9.在病毒感染動物模型中的保護(hù)作用

為了評價肽PHB4的體內(nèi)抗病毒活性并將其與肽HDIII3CL進(jìn)行比較，將具有12只成年Balb/C小鼠(20g的平均體重)的組通過吸入乙醚來進(jìn)行麻醉，并通過用相應(yīng)于10倍半數(shù)致死劑量的病毒制備物實施顱內(nèi)注射來進(jìn)行接種。經(jīng)麻醉的動物迅速恢復(fù)，并在處理后5分鐘就看起來是警醒的。觀察動物21天。將肽與病毒一起共接種。接種物的最終體積在所有情況下均為20μL。通過使用Kaplan-Meier對數(shù)秩檢驗來評價結(jié)果。

表8顯示了在用DENV的四種血清型進(jìn)行的實驗中所獲得的結(jié)果。在所檢驗的劑量下，肽PHB4實現(xiàn)了小鼠的完全保護(hù)，其比肽HDIII3CL更強(qiáng)有力。在DENV2的情況下，保護(hù)試驗進(jìn)行三次。

表8.在體內(nèi)測定試驗中獲得的結(jié)果的概括

統(tǒng)計學(xué)顯著性：***，P<0.005；**，P<0.01；*，P<0.05。ND，未測定。a：未發(fā)現(xiàn)對于所使用的DENV3的毒株來說致死的劑量，因此該評價通過發(fā)病率來進(jìn)行，考慮了下列征候的存在：毛發(fā)豎起、駝背、身體衰弱和下身癱瘓，以及這些癥狀的以天表示的持續(xù)時間。

實施例10.用于形成金屬納米顆粒的與“組氨酸尾巴”序列相融合的肽PHB4

如前面所指出的，通過使用合成方法或通過重組DNA技術(shù)，可以單獨地或者與蛋白質(zhì)/肽相融合地來獲得本發(fā)明的β-發(fā)夾肽。如在實施例5中所證明的，所述β-發(fā)夾肽可以聚集，采用不同類型的四級結(jié)構(gòu)，這取決于肽的濃度，溶劑的性質(zhì)，以及實驗條件，例如溫度、pH、離子強(qiáng)度、超聲處理、添加物的存在、與蛋白質(zhì)(例如HSA)的非共價結(jié)合等。超分子結(jié)構(gòu)也影響肽的抗病毒活性(實施例8)。納米顆粒的形成可以導(dǎo)致肽的效力的相當(dāng)大的增加，其由更大的肽與受體的結(jié)合親和力來介導(dǎo)。所述肽納米顆?？梢酝ㄟ^數(shù)個肽單體與受體的數(shù)個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合而實現(xiàn)與受體的多點結(jié)合。納米顆粒還可以同時結(jié)合多于一個的存在于細(xì)胞膜上的受體鏈。類似地，納米顆粒的形成可以對藥物代謝動力學(xué)特性作出有利貢獻(xiàn)，其中增加在血液中的半壽期、對于蛋白水解的抗性等。

由本發(fā)明的PHB肽形成的納米顆粒可以通過下述方式而額外地穩(wěn)定化：將所述肽融合至能夠支持以兩個或更多個基團(tuán)“A”/一個基團(tuán)“E”的化學(xué)計量的與“間隔物”分子或原子(E)的非共價相互作用的“受者”基團(tuán)(A)。這種類型的設(shè)計允許通過間隔物“E”來進(jìn)行的兩個或更多個PHB肽的締合。在本發(fā)明的一個實施方案中，已通過合成方式將具有五個組氨酸的“尾巴”的序列與肽PHB4相融合(圖22)。組氨酸尾巴可以作為用于多價金屬離子(Zn(II)、Cu(II)、Cu(II)、Cs，等等)的基團(tuán)“A”發(fā)揮作用。在該情況下，氨基酸組氨酸的側(cè)鏈的咪唑基團(tuán)與金屬離子建立配位鍵，以直至“3-4個咪唑基團(tuán)/1個金屬離子”的化學(xué)計量比。這表明，在足夠的金屬濃度下，結(jié)合至尾巴的離子可以作為基團(tuán)E起作用并使肽的二聚化穩(wěn)定化。

在圖23中，示意性地顯示了，金屬離子可以直接地但也能通過與輔助螯合劑基團(tuán)的配位而間接地介導(dǎo)具有可用的咪唑基團(tuán)的肽的交織，所述輔助螯合劑基團(tuán)例如為四陰離子化合物EGTA即乙二醇-雙(2-氨基乙基醚)-N,N,N’,N’-四乙酸和EDTA即2-({2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}(羧甲基)氨基)乙酸。在這些情況下，金屬離子形成具有“2個金屬原子/1個二氨基四羧酸”的化學(xué)計量的EGTA(Me)2和EDTA(Me)2類型的絡(luò)合物。在這些絡(luò)合物中存在的金屬離子仍然可以與額外的咪唑基團(tuán)進(jìn)行配位，從而所述絡(luò)合物可以用作使肽和其聚合體的交織穩(wěn)定化的基團(tuán)“E”(圖23)。

圖22顯示了本發(fā)明的兩種類型的融合分子：在一種類型中組氨酸尾巴通過酰胺鍵而與肽PHB4的C-末端相結(jié)合(PHB4H5)，和在另一種類型中所述尾巴位于N-末端(H5PHB4)。按照先前在實施例1中所描述的過程來合成和純化這兩種融合肽。

接著，在10mM MES緩沖液(pH 6.8-7.5)中在2mM ZnCl₂(其提供金屬離子)或2mM絡(luò)合物EGTA(Zn2)存在下制備200μM的這兩種肽的儲液。絡(luò)合物EGTA(Zn2)事先通過在8mM ZnCl₂存在下制備4mM EGTA的溶液來獲得。

單獨的以及以與Zn和與EGTA(Zn2)的絡(luò)合物形式的肽PHB4H5和H5PHB4的制備物通過在Vero細(xì)胞中的針對DEN2病毒(M2C毒株)的抗病毒活性測定試驗來進(jìn)行評價。將細(xì)胞在每種肽制備物存在下于37℃溫育1小時，然后，以0.001的moi添加病毒。在兩個小時后，添加一層高密度培養(yǎng)基，并且于37℃在5％CO₂的氣氛中溫育3天。作為陰性對照，取在具有相應(yīng)濃度的ZnCl₂和EGTA(Zn2)溶液存在下進(jìn)行溫育的細(xì)胞。通過使用針對病毒包膜的單克隆抗體，采用免疫焦點(inmunofocus)技術(shù)來檢測病毒蝕斑。按照下述表達(dá)式來計算抑制百分比：

I＝100-100×NP_肽/NP_陰性對照

其中I為抑制百分比，和NP為考慮了重復(fù)的病毒蝕斑數(shù)目的平均值。

如在圖24中所觀察到的，在20μΜ下，融合肽(單獨的，沒有金屬添加物)以高的百分比(將近100％)抑制病毒感染；然而，在4和0.16μΜ下，抗病毒活性消失。相反，肽與間隔物EGTA(Zn2)的絡(luò)合物保持了在50-70％的抑制范圍內(nèi)的抗病毒活性。肽H5PHB4的絡(luò)合物在0.16μΜ下顯示出33％的抑制。

所獲得的結(jié)果顯示，從將肽PHB4與組氨酸尾巴相融合而得到的肽是更強(qiáng)有力的，當(dāng)與間隔物試劑(特別是與間隔物EGTA(Zn2))形成絡(luò)合物時。