本發(fā)明涉及表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)酪蛋白激酶家族抑制劑及其藥學(xué)上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤包括白血病是導(dǎo)致人類臨床死亡的重大疾病之一，特別是惡性腫瘤，如肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、腸癌和食管癌等死亡率極高。至今為止仍沒有有效的方法與藥物完全治愈癌癥。臨床上急需特異性好、活性高、毒性小、無(wú)耐藥性產(chǎn)生的優(yōu)質(zhì)抗癌藥物。

癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及惡化和許多因素有關(guān)，其中正常細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的異常是導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化與癌化的重要因素之一，特別是跨膜受體介導(dǎo)的多功能信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。酪氨酸蛋白激酶是細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、代謝、老化與凋亡等重要生理功能所必須的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)酶，分為膜受體和胞質(zhì)酪蛋白激酶兩種類型。許多酪氨酸蛋白激酶的異?？芍苯訉?dǎo)致臨床上不同類型的疾病例如癌癥、炎癥、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)以及心腦血管類疾病。人們經(jīng)過(guò)幾十年的不斷努力，許多酪氨酸蛋白激酶例如egfr、her2/3/4、vegfr、pdgfr、met、igf-1r、fgfr、csf-1r、trk受體、ephrin受體、tam受體、tie-2、flt-3、ret、alk、bcr-abl、jaks、src、fak、btk、syk，blk等已被鑒定為臨床不同疾病的靶蛋白分子。其中一些酪氨酸蛋白激酶抑制劑已成功的應(yīng)用于臨床，并且呈現(xiàn)出良好的治療效果。

表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)是一類跨膜受體蛋白，為酪蛋白激酶。該激酶家族由egfr(her1/erbb1)，her2/erbb2，her3/erbb3和her4/erbb4四個(gè)成員組成，此類蛋白激酶介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑，控制與調(diào)節(jié)細(xì)胞的諸多生理功能?；A(chǔ)研究與臨床基因組大數(shù)據(jù)顯示egfr、her2、her3、her4基因的異常例如點(diǎn)突變、缺失、擴(kuò)增、過(guò)表達(dá)等都可直接導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化和癌癥發(fā)生，同時(shí)這些基因的異常又和癌細(xì)胞的增殖、存活、轉(zhuǎn)移、侵潤(rùn)、腫瘤新血管形成以及藥物抗性密切相關(guān)。

在臨床上，egfr基因異常變異(過(guò)表達(dá)、點(diǎn)突變、缺失、插入等)常常出現(xiàn)在不同癌癥病人中，尤其是肺癌。肺癌是致死率極高的惡性腫瘤之一，其中以腺癌、麟狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞肺癌為主的非小細(xì)胞肺癌(nsclc)占整個(gè)肺癌的80％左右，而egfr常常在nsclc中高頻率的發(fā)生變異，導(dǎo)致其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑持續(xù)被激活，引起細(xì)胞癌化。同樣her2/erbb2基因的異常(例如突變、擴(kuò)增、過(guò)表達(dá))以一定的比例(＞5％)發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌病人中，特別是her2/erbb2基因的過(guò)表達(dá)。除了非小細(xì)胞肺癌外，her2/erbb2基因的異常頻繁發(fā)生在許多其它癌癥中，有的高達(dá)30％以上，例如乳腺癌(20％)、胃癌(22-25％)、食道癌(10-25％)、胰腺癌(2-30％)、膀胱癌(5-15％)、唾管癌(15-37％)、宮頸癌(1-21％)、惡性膠質(zhì)瘤(7-15％)，其次為非小細(xì)胞肺癌(5％)、大腸癌(2-3％)、卵巢癌(6-7％)、頭頸癌(3％)、肝癌(2.4％)、黑色素瘤(0-5％)。此外her2過(guò)表達(dá)的強(qiáng)弱不僅和腫瘤的惡性程度成正相關(guān)，也和許多化療藥物耐藥性相關(guān)聯(lián)例如紫杉醇/奧沙利鉑耐藥性。

egfr和her2作為有效的成藥靶點(diǎn)已用于抗癌藥物的開發(fā)。至今為止，已成功開發(fā)出多種抗癌新藥物，例如作用于egfr/her2蛋白分子胞外部分的大分子單抗藥西妥昔單抗(cetuximab)，帕尼單抗(panitumumab)和赫賽汀(herceptin)以及作用于egfr/her2蛋白分子胞內(nèi)激酶活性部位的小分子藥物吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼等都已在臨床上應(yīng)用多年，呈現(xiàn)良好的治療效果。然而和諸多其他抗癌藥物一樣，egfr類藥物也存在獲得性抗性的問題。如吉非替尼、厄洛替尼以及拉帕替尼在臨床上產(chǎn)生的藥物抗性可達(dá)50％以上。獲得性藥物抗性是由多種原因引起，其中靶蛋白分子的結(jié)構(gòu)改變?yōu)橹匾蛑弧ＥR床上使用的第一代egfr抑制劑化合物核心架構(gòu)為4-苯胺喹唑啉，以可逆性方式與egfr蛋白激酶活性區(qū)相結(jié)合，通過(guò)與atp競(jìng)爭(zhēng)，起到抑制蛋白激酶活性的作用?；蛲蛔兂３?dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)的改變，例如egfrexon19缺失和exon21的l858r點(diǎn)突變使egfr蛋白激酶變成激活性突變體，相對(duì)的增加了吉非替尼和厄洛替尼藥物對(duì)egfr的抑制作用，但exon20的蘇氨酸790(egfr蛋白激酶活性區(qū)守門氨基酸)突變成蛋氨酸(t790m)時(shí)，第一代egfr抑制劑失去與atp競(jìng)爭(zhēng)能力，導(dǎo)致藥物失效，產(chǎn)生藥物抗性，而這種獲得性藥物抗性使40-55％的臨床癌癥病人對(duì)第一代egfr抑制劑無(wú)治療效果。盡管在第一代egfr抑制劑結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，已研發(fā)出與egfr蛋白質(zhì)中的半胱氨酸797(cys-797)共價(jià)結(jié)合的第二代不可逆抑制劑如阿法替尼(afatinib)和來(lái)那替尼(neratinib)，雖然體外可抑制egfrt790m但仍對(duì)野生型egfr有較強(qiáng)的抑制作用，其臨床表現(xiàn)出高副作用與毒性，加上單獨(dú)使用并沒有顯示出對(duì)表達(dá)egfrt790m的nsclc病人治療的明顯優(yōu)勢(shì)，使其臨床應(yīng)用受到極大限制。同時(shí)已發(fā)現(xiàn)egfr第二代抑制劑在臨床上應(yīng)用過(guò)程中同樣產(chǎn)生不同程度的獲得性藥物抗性，其部分原因和其它癌基因異常(如met/her3擴(kuò)增，pik3ca/braf突變，nf1缺失，fgfr信號(hào)傳導(dǎo)激活等)有關(guān)。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)以苯胺嘧啶為核心骨架的小分子化合物wz4002能夠高活性的作用于egfrt790m突變株，但對(duì)野生型egfr作用較弱。之后制藥公司相繼開發(fā)的苯胺嘧啶類化合物co-1686、azd9291和hm61713，臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已顯示對(duì)egfrt790m表達(dá)病人有較高的應(yīng)答，相對(duì)副作用小，是新一代有效的egfrt790m突變株抑制劑。

盡管抑制egfr的活性能夠有效的抑制非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。但其它一些基因的異常表達(dá)如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(met)擴(kuò)增，間變性淋巴瘤激酶(alk)擴(kuò)增與重排，her2/erbb2擴(kuò)增與過(guò)表達(dá)，同樣與非小細(xì)胞肺癌的惡性生長(zhǎng)和藥物抗性密切相關(guān)。而在眾多的其它惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、食管癌和唾管癌中，met，her2/erbb2和alk同樣是重要的癌癥生物標(biāo)記。

已上市的抗her2單抗藥赫賽汀和唯一小分子化合物拉帕替尼，雖然在臨床上已呈現(xiàn)良好的治療效果，但獲得性藥物抗性以及血腦屏障等問題使它們的臨床應(yīng)用受到一定程度的限制。多年來(lái)我們一直致力于研發(fā)特異性好、活性高、毒性低的egfr酪蛋白激酶家族小分子化合物抑制劑。目標(biāo)是開發(fā)一類即可有效抑制異常高表達(dá)egfr或her2/erbb2，同時(shí)又能夠抑制獲得性藥物抗性突變株特別是egfrt790m，her2t798i而副作用小的新一代化合物。我們以丙烯酰胺苯胺為核心構(gòu)架，設(shè)計(jì)合成一系列新的化合物及其衍生物，通過(guò)用高表達(dá)egfr或her2以及其不同突變株的細(xì)胞系，進(jìn)行體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，研究與開發(fā)新的egfr和her2靶向藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及到一系列新的丙烯酰苯胺衍生物及其藥學(xué)上可接受的鹽，能夠以不逆的結(jié)合方式作用并抑制egfr突變株(例如egfrexon19缺失dele746-a750激活突變體，l858r/t790m和dele746-a750/t790m雙突變抗性突變體)和her2過(guò)表達(dá)的多種腫瘤細(xì)胞系的體內(nèi)和體外生長(zhǎng)，具有應(yīng)用于多種臨床疾病治療的價(jià)值。

egfr酪蛋白激酶家族是當(dāng)今臨床上成功應(yīng)用的靶向抗癌治療的理想靶標(biāo)。盡管已上市的抗egfr/her2蛋白激酶抑制劑能夠有效的改進(jìn)癌癥病人的臨床治療效果，但獲得性藥物抗性或藥物引起的嚴(yán)重副作用極大的影響到這些藥物的臨床治療效果，滿足不了臨床需求。我們發(fā)明的新化合物無(wú)論在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，均表現(xiàn)出強(qiáng)的抗癌活性。gi50在納摩爾濃度可有效的抑制表達(dá)不同egfr突變體的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，特別是t790m抗性突變細(xì)胞株。對(duì)egfr野生型過(guò)表達(dá)細(xì)胞株的抑制活性較弱，而對(duì)正?；驘o(wú)egfr表達(dá)癌細(xì)胞相對(duì)無(wú)抑制作用，這將在臨床應(yīng)用上大大的降低由于野生型egfr活性被抑制而產(chǎn)生的皮膚和胃腸道副作用的風(fēng)險(xiǎn)例如皮疹、腹瀉。

her2/erbb2是egfr家族中另一個(gè)酪蛋白激酶，其異常表達(dá)和許多惡性腫瘤相關(guān)。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對(duì)her2/erbb2高表達(dá)的不同腫瘤細(xì)胞系(如nci-n87，calu-3，au565，sk-rb-30，nci-h2170，zr-75-30)的生長(zhǎng)有強(qiáng)抑制作用，gi50濃度為納摩爾，而且對(duì)拉帕替尼(唯一臨床上應(yīng)用的her2/erb2選擇性可逆抑制劑)抗性細(xì)胞系hcc1954也呈現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)抑制作用，這在臨床上不但可應(yīng)用于nsclc，同樣可以用于her2/erbb2高表達(dá)的胃癌、乳腺癌、食管癌和唾管癌。

本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

[1]通式(i)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥：

其中：

x、y和r1選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r1為-nr5r6時(shí)；x和y彼此相同或不同，并且各自獨(dú)立地選自n、cr4；

b)r1選自-or5和-sr5時(shí)；x和y彼此相同或不同，并且各自獨(dú)立地選自n、cr4；

c)r1為-cr5r6，且r5和r6和與它們所連接的碳原子成環(huán)時(shí)；x為cr4，y為n；

r2選自烷氧基、烷硫基或者nr6r6；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、-or^un(r^y)(r^z)、-sr6、-sr^un(r^y)(r^z)；

r4選自氫、鹵素、烷基、烷氧基、鹵代烷基、氰基；

r5和r6選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r5為任選取代的芳基、任選取代的雜芳基或者任選取代的雜環(huán)基；存在取代基時(shí)該取代基選自1-5個(gè)r7基團(tuán)，其中每個(gè)r7基團(tuán)獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中烷基、烯基、炔基、烷氧基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜芳基或雜芳基烷基羥基任選地用以下的1-5個(gè)基團(tuán)取代：鹵素、烷基、烯基、炔基、芳基、羥基、烷氧基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、酯基、氰基；

r6選自氫、烷基；

b)r5和r6和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基、雜芳基或者稠環(huán)芳環(huán)，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時(shí)任選用1-5個(gè)取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

c)r5和r6和與它們所連接的碳原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且芳環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時(shí)任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

每個(gè)r^u獨(dú)立地選自亞烷基、亞烯基或者亞炔基；

r^v選自氫或烷基；

每個(gè)r^y和r^z獨(dú)立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨(dú)立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、烷氧基烷基、羥基烷基、吡咯烷基、烷基氨基、或者鹵代烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基或者雜芳基，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自r5或者r7。

[2]上述[1]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于，所述通式(i)所示化合物為式iia、iib或iic的化合物，

其中r1選擇如下a)或b)的方式：

a)通式(i)所示化合物為式iia、iib時(shí)，r1為-nr5r6

b)通式(i)所示化合物為式iic時(shí)，r1為-nr5r6；或者r1為-cr5r6(且r5和r6和與它們所連接的碳原子成環(huán))

r2為烷氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r'4各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、鹵代烷基；

r5和r6選擇如下a)、b)或c)的任一種方式：

a)r5為任選取代的芳基；存在取代基時(shí)該取代基選自1-5個(gè)r7基團(tuán)，其中每個(gè)r7基團(tuán)獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、羥基烷基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基、雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個(gè)基團(tuán)取代：鹵素、烷基、烯基、炔基、羥基、烷氧基；

r6選自氫、烷基；

b)r5和r6和與它們所連接的氮原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時(shí)任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

c)r5和r6和與它們所連接的碳原子一起形成稠環(huán)芳環(huán)，且芳環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子；環(huán)上有取代基時(shí)任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烯基或者氰基；

每個(gè)r^u獨(dú)立地選自亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個(gè)r^y和r^z獨(dú)立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z每一個(gè)獨(dú)立地選自氫、烷基、或者鹵代烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自鹵素、鹵代烷基、烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[3]上述[2]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于：

r1選擇以下的a)或b)：

通式(i)所示化合物為式iia和iib時(shí)，r1選自：

通式(i)所示化合物為式iic時(shí)，r1選自：

r2為烷氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r4’、r4”各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、或烷基；

r7^a、r7^b、r7^c、r7^d和r7^e彼此相同或不同，并且各自獨(dú)立地為r7；

r7選自氫、鹵素、烷基、烯基、炔基、烷氧基、氰基、羥基、氨基、鹵代烷氧基、鹵代烷基、芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基羥基；其中芳基、芳基烷基羥基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基和雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個(gè)基團(tuán)取代：鹵素、烷基、烷氧基；

每個(gè)r^u獨(dú)立地選自亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個(gè)r^y和r^z獨(dú)立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨(dú)立地選自氫或烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[4]上述[3]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其特征在于：

r1選擇a)、b)或c)的任一種方式：

通式(i)所示化合物為式iia時(shí)，r1選自：

b)通式(i)所示化合物為式iib時(shí)，r1為：

c)通式(i)所示化合物為式iic時(shí)，r1選自：

r2選自甲氧基或丙氧基；

r3選自氫、n(r^y)(r^z)、-n(r^v)r^un(r^y)(r^z)、-or^uor6、或-or^un(r^y)(r^z)；

r4、r4’、r4”各自獨(dú)立地選自氫、鹵素或烷基；

r7^a、r7^b、r7^c、r7^d和r7^e彼此相同或不同，并且各自獨(dú)立地為r7；

r7選自氫、鹵素、烷基、炔基、烷氧基、氰基、鹵代烷基、或芳基烷基羥基雜芳基烷基羥基；其中芳基烷基羥基和雜芳基烷基羥基任選地用以下的0-4個(gè)基團(tuán)取代：鹵素、烷基；

每個(gè)r^u獨(dú)立地為亞烷基；

r^v選自氫或烷基；

每個(gè)r^y和r^z獨(dú)立地選自以下的a)或b)：

a)r^y和r^z各自獨(dú)立地選自氫或烷基；

b)r^y和r^z和與它們所連接的氮原子一起形成雜環(huán)基，且環(huán)中含有0-4個(gè)獨(dú)立地選自o、s、n的雜原子，且環(huán)上任選用1-4個(gè)取代基取代，所述取代基選自烷基、烷氧基烷基，烷基羥基、nr6r6、或雜環(huán)基。

[5]上述[1]所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或前藥，其中，所述化合物選自：

n-(5-(4-(3-溴苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氟苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-乙炔基苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-氟苯氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-2-氟苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(5-氯-4-(3-氯-4-(吡啶-2-甲氧基)苯胺基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯基氨基)嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(二甲氨基)哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(2-((2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-5-(4-(吲哚啉-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-{2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-5-[4-(6-甲氧基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-丙烯酰胺

n-{2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-5-[4-(6-甲基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-苯基}-丙烯酰胺

n-{5-[4-(6-氰基-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基]-2-[(2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-氯-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-溴-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(6-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

2-((2-丙烯酰胺基-5-甲氧基-4-(4-(5-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基)-氨基)-苯基)-甲基-n，n-二甲基-n-氧化乙胺

n-(5-(4-(5-氯-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-溴-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-三氟甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(二甲胺甲基)-哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5-氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(4-(4-甲基-哌嗪-1-基)-哌啶-1-基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(4-甲基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(4-甲氧基-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(5，6-二氟-1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(1h-苯基[d]咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺

n-(5-(4-苯并三氮唑-1-基-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-4-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氯-2-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-三氟甲基-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-氟-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(4-(3-溴-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-[5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-4-甲氧基-2-(4-(吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-苯基-丙烯酰胺

n-{2-[1，4′]哌啶基-1′-基-5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-{5-[4-(3-溴-苯胺基)-[1，3，5]三嗪-2-氨基]-2-[4-(2-羥基-乙基)-哌嗪-1-基]-4-甲氧基-苯基}-丙烯酰胺

n-[5-[4-(3-溴-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基]-4-甲氧基-2-(4-甲基-[1，4]二氮雜環(huán)庚烷-1-基)-苯基]-丙烯酰胺

n-(5-(6-(3-溴-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺

n-(2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-5-(6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-丙烯酰胺

n-(5-(6-(3-炔基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺。

[6]egfr和/或her2/erbb2酪蛋白激酶抑制劑，其含有上述[1]～[5]中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。

[7]上述[1]～[5]中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備egfr和/或her2/erbb2酪蛋白激酶抑制劑中的用途。

[8]上述[1]～[5]中任一項(xiàng)所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備預(yù)防和/或治療癌癥的藥物中的用途。

根據(jù)本發(fā)明的化合物，對(duì)egfr突變株和her2/erbb2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均具有高活性的抑制作用。

具體實(shí)施方式

在本說(shuō)明書中，除非另有規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同含義。所有專利、申請(qǐng)、公開的申請(qǐng)和其他出版物均以全部?jī)?nèi)容并入作為參考。倘若對(duì)于本文使用的術(shù)語(yǔ)有多個(gè)定義，除非另有說(shuō)明，以本說(shuō)明書中的為準(zhǔn)。

“鹵素”包括氟、氯、溴、碘。

“烷基”包括碳數(shù)1～18、優(yōu)選碳數(shù)1～10、更優(yōu)選碳數(shù)1～6、還更優(yōu)選碳數(shù)1～4的直鏈或支鏈烷基，可例舉例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、正庚基、異庚基、正辛基、異辛基、正壬基、正癸基等。本說(shuō)明書中，“烷基”還包括碳數(shù)3～10、優(yōu)選碳數(shù)3～8、更優(yōu)選碳數(shù)4～6的環(huán)狀烷基，可例舉例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)癸基、十氫萘基、降冰片烷、金剛烷基等。

“烯基”指由碳和氫原子組成的含有至少一個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈的烴鏈基團(tuán)，具有2-10個(gè)碳原子、優(yōu)選2-6個(gè)碳原子，并通過(guò)單鍵或雙鍵與分子的其余部分連接，例如，乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、戊二烯基、己烯基等。

“烷氧基”指具有式-or的基團(tuán)，其中r是如上述定義的烷基?？衫e例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、環(huán)丙氧基、環(huán)丁氧基等。

“炔基”指由碳原子和氫原子組成的含有至少一個(gè)三鍵的直鏈或支鏈的烴鏈基團(tuán)，具有2-10個(gè)碳原子、優(yōu)選2-6個(gè)碳原子，并通過(guò)單鍵或三鍵與分子的其余部分連接，例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。

“烷基?；敝妇哂惺絩(c＝o)的基團(tuán)，其中r是如上述定義的烷基?？衫e例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己?；?。

“芳基”指碳環(huán)系的基團(tuán)，包括單環(huán)、二環(huán)、三環(huán)、四環(huán)c6-c18環(huán)系，其中至少一個(gè)環(huán)是芳香環(huán)。芳基可以是完全芳香族的基團(tuán)，例如苯基、萘基、蒽基、菲基等。芳基也可以含有芳香環(huán)與非芳香環(huán)的組合，例如，茚、芴和苊等。其中，芳基優(yōu)選苯基、萘基等。

“鹵代烷基”指烷基的一個(gè)或多個(gè)氫原子被鹵素取代的烷基，其中烷基可以是如上述定義的烷基。這種基團(tuán)包括但不儀限于氯甲基、三氟甲基、1-氯-2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2-氟丙基、2-氟丙-2-基、2，2，2-三氟乙基、1，1-二氟乙基、1，3-二氟-2-甲基丙基、2，2-二氟環(huán)丙基、(三氟甲基)環(huán)丙基、4，4-二氟環(huán)己基和2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基等。

“雜環(huán)基”，包括環(huán)內(nèi)具有一個(gè)以上、優(yōu)選1-5個(gè)的任意選自o、s和n的雜原子的3-15元(例如3-12元、3-9元等)雜環(huán)基。雜環(huán)基可以是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或四環(huán)環(huán)系，其可以包括稠合或橋接環(huán)系；雜環(huán)基中的氮或硫原子可以任選被氧化；氮原子可以任選被季銨化；雜環(huán)基可以是部分或完全飽和的。雜環(huán)環(huán)系可以在任何雜原子或碳原子處與主結(jié)構(gòu)連接，生成穩(wěn)定的化合物。具體而言包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、三嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、異唑基、唑基、二唑基、異噻唑基、噻唑基、噻二唑基等五元～六元雜芳基；吡喃基、噻唑烷基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、嗎啉代、硫代嗎啉基、硫代嗎啉代、二氫吡啶基、四氫吡啶基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、二氮雜基、四氫二氮雜基等非芳族雜環(huán)基；吲哚基、異吲哚基、吲唑基、二氫吲哚基、異二氫吲哚基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、萘啶基、喹喔啉基、嘌呤基、蝶啶基、苯并吡喃基、苯并咪唑基、苯并三唑基、苯并異唑基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并異噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、異苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三氮唑基、噻吩并吡啶基、咪唑并噻唑基、苯并咪唑并噻唑基、吡嗪并噠嗪基、喹唑啉基、喹啉基、異喹啉基等二環(huán)或三環(huán)稠合雜環(huán)基等。其中，優(yōu)選吡咯基、呋喃基、咪唑基、異唑基、唑基、嘧啶基、吡啶基、噻唑基、噻吩基、嗎啉基、哌啶基、哌嗪基、吡喃基、吡咯烷基、吲哚基、二氮雜基、苯并噻吩基、苯并三氮唑基、苯并咪唑基等。

“芳烷基”、“芳烷基氧基”、“鹵代芳烷基氧基”、“烷基氨基”、“烷基?；薄ⅰ胞u代烷基”中的烷基部分也與上述“烷基”定義相同。

“芳氧基”、“芳基氨基”、“芳基硫基”、“芳基氧基”、“芳烷基”、“芳烷基氧基”、“鹵代芳烷基氧基”、“鹵代芳基”中的芳基部分也與上述“芳基”定義相同。

“雜環(huán)基烷氧基”中的雜環(huán)部分也與上述“雜環(huán)基”定義相同，其中的烷氧基部分也與上述“烷氧基”定義相同。

本說(shuō)明書中的“任選取代”是指未取代或被一個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4個(gè))取代基取代。其中取代基選自下組：鹵素原子、烷基、烯基、炔基、鹵代烷基、烷氧基、芳基、鹵代芳基、芳氧基、芳烷基、芳烷基氧基、雜環(huán)基烷氧基、鹵代芳基烷基氧基、烷基氨基、烷基酰基、氰基、或雜環(huán)基等。這些取代基還可以進(jìn)一步被取代。例如，作為取代基的烷基還任選被選自鹵素原子、羥基、烷氧基、烷基氨基、吡咯烷基、苯基、吡啶基、或鹵代苯基中的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代。作為取代基的雜環(huán)基還任選被選自鹵素原子、烷基、烷氧基中的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代。

r1可以為任選取代的雜環(huán)基、任選取代的芳基氨基、任選取代的芳基硫基、或任選取代的芳基氧基等。

r1優(yōu)選為任選取代的吲哚基、吲哚啉基、噻吩基、吲唑基、吡咯并吡啶基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、或苯并三氮唑基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、環(huán)烷基、芳烷基、氰基。r1例如可列舉吲哚-1-基、吲哚-3-基、1-甲基-1h-吲哚-3-基、1-乙基-1h-吲哚-3-基、1-丙基-1h-吲哚-3-基、1-異丙基-1h-吲哚-3-基、1-芐基-1h-吲哚-3-基、6-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基、5-氟-1-甲基-1h-吲哚-3-基、5-氟-1-環(huán)戊基-1h-吲哚-3-基、苯并咪唑-1-基、或苯并三氮唑-1-基等。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基氨基、或萘基氨基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、鹵代烷基、烷氧基、炔基、芳氧基、雜環(huán)基烷氧基、芳烷基氧基、鹵代芳基烷基氧基。r1例如可列舉苯氧基苯基氨基、甲基苯基氨基、鹵代苯基氨基、甲氧基苯基氨基、乙炔基苯基氨基、三氟甲基苯基氨基、氟芐氧基苯基氨基、或吡啶基甲氧基苯基氨基等，優(yōu)選為鹵代苯基氨基。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基硫基、或萘基硫基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、或烷氧基。r1例如可列舉萘基硫基、甲基苯基硫基、或甲氧基苯基硫基等。

r1優(yōu)選為任選取代的苯基氧基、或萘基氧基等。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、或烷氧基。r1例如可列舉萘基氧基、甲基苯基氧基、或甲氧基苯基氧基等。

r3可以為任選取代的雜環(huán)基、任選取代的烷氧基、任選取代的氨基等。

r3優(yōu)選為任選取代的哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、二氮雜基、或吡啶基。其中的取代基優(yōu)選為鹵素原子、烷基、氰基、嗎啉基、哌啶基、烷基哌嗪基、烷基氨基、烷基哌啶基、羥烷基、烷氧基烷基、羥基烷氧基烷基、吡咯烷基烷基、烷基氨基烷基、烷基?；?、芳烷基、芳基、吡啶基烷基、或鹵代芳基烷基等。r3例如可列舉甲基哌嗪基、嗎啉基哌啶基、甲基哌嗪基哌啶基、二甲氨基哌啶基、叔丁基哌嗪基、二甲氨基吡咯烷基、乙基哌嗪基、環(huán)己基甲基哌嗪基、雙哌啶基、甲基二氮雜基、甲基哌啶基哌嗪基、羥乙基哌嗪基、甲氧基乙基哌嗪基、羥基乙氧基乙基哌嗪基、二氟吡咯烷基、吡咯烷基哌嗪基、羥丙基哌啶基、吡啶基乙基哌嗪基、苯并二氧甲基哌嗪基、吡咯烷基乙基哌嗪基、氰基乙基哌嗪基、二甲氨基乙基哌嗪基、乙?；哙夯?、芐基哌嗪基、苯基哌嗪基、吡啶基甲基哌嗪基、4-甲基2-苯基哌嗪基、雙(氟苯基)甲基哌嗪基等。

r3優(yōu)選為任選取代的乙氧基、丙氧基或丁氧基等。其中的取代基優(yōu)選為烷基、烷氧基、烷基氨基、嗎啉基、吡咯烷基、烯基酰基、或哌嗪基等。r3例如可列舉甲氧基乙氧基、甲基哌嗪基乙氧基、嗎啉基乙氧基、吡咯烷基乙氧基、丙烯?；哙夯已趸⒒蚨装被已趸?。

r3中的r^y和r^z各自獨(dú)立地優(yōu)選為烷基、鹵代烷基、羥基烷基、吡咯烷基、或烷基氨基等，其中的n原子可以被氧化。r3例如可列舉二甲氨基、甲基(2-吡咯烷基乙基)氨基、(2-二甲氨基乙基)甲基氨基、[2-(1-氧化吡咯烷-1-基)乙基]甲基氨基、或甲基-n，n-二甲基-n-氧化乙基氨基等。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物在藥學(xué)上可接受的鹽，可由加酸成鹽或加堿成鹽。酸可選擇無(wú)機(jī)酸包括但不限于鹽酸、硫酸、磷酸、氫溴酸；有機(jī)酸可選用但不限于檸檬酸、馬來(lái)酸、草酸，甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、苯甲酸、富馬酸、三氟乙酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、谷氨酸、天門冬氨酸、水楊酸、丙酮酸、甲磺酸、苯磺酸、對(duì)苯磺酸。堿可選擇無(wú)機(jī)堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鎂、氫氧化鈣；有機(jī)堿包括但不限于氫氧化銨、三乙胺、精氨酸或賴氨酸。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物及藥學(xué)上可接受的鹽可以溶劑化形式或未溶劑化形式存在例如水合式等。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物，其前藥應(yīng)遵照前藥設(shè)計(jì)原則，在生物體內(nèi)正常生理狀況下，能夠通過(guò)酶解、水解、酸解或代謝降解，釋放出原活性通式(i)所示的化合物。這里包括但不限于化合物上羥基基團(tuán)的脂化(如形成磷酸脂和碳酸脂)，氨基基團(tuán)和羧基基團(tuán)的保護(hù)。前藥設(shè)計(jì)參照(1)karamanr，prodrugsdesignbasedoninter-andintramolecularchemicalprocesses.chembioldrugdes.82(6)：643-68，2013；(2)rautioj等，prodrugs：designandclinicalapplications.natrevdrugdiscov.7(3)：255-702008；(3)jampilekj.prodrugs：pharmaceuticaldesignandcurrentperspectives.currpharmdes.17(32)：3480-1，2011；(4)bundgaardh.designofprogrugs.elservier，1985。

本發(fā)明另一方面將通式(i)所示的化合物或藥學(xué)上可接受的鹽或前藥制備成臨床上可使用的藥物組合物。根據(jù)臨床適應(yīng)癥，給藥途徑與方式，其藥用制劑包括但不限于口服制劑如片劑、凝膠劑、軟/硬膠囊、乳劑、分散性粉劑、顆粒劑、水/油懸乳劑；注射劑包括靜脈注射劑、肌肉注射劑、腹腔注射劑、直腸給藥栓劑、顱內(nèi)注射劑，這些劑型可為水溶液也可為油類溶液；局部制劑包括霜?jiǎng)?、軟膏劑、凝膠劑、水/油溶液以及包合物制劑；吸入劑型包括細(xì)粉、液體氣溶膠以及適合于體內(nèi)植入的各種劑型。

本發(fā)明的藥物組合物根據(jù)需要加入常規(guī)藥用輔料。這些輔料應(yīng)符合藥物制劑制備工藝規(guī)則，與活性成分相兼容。固體口服制劑輔料選用但不限于甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、葡萄糖、蔗糖、環(huán)糊精以及促進(jìn)腸吸收分子載體維生素e-peg1000?？诜苿┛杉尤脒m當(dāng)?shù)闹珓?、甜味劑、矯味劑及防腐劑。

本發(fā)明通式(i)所示的化合物按0.1-100mg/kg單位劑量給予溫血?jiǎng)游铩?/p>

包含本發(fā)明通式(i)所示的化合物或藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分的藥物組合物，主要治療與egfr和/或her2相關(guān)的臨床疾病。其中包括但不限于癌癥、糖尿病炎癥、免疫系統(tǒng)疾病、心血管內(nèi)疾病、神經(jīng)類疾病以及呼吸類疾病。

上述臨床疾病中，癌癥包括但不限于肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌、卵巢癌、宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、前列腺癌、腎癌、食道癌、間皮瘤、頭頸癌、膀胱癌、唾腺癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤。

本發(fā)明藥物組合物在上述癌癥治療中，可單獨(dú)使用，或與臨床上常規(guī)使用的手術(shù)、放射療法、化學(xué)療法、免疫療法、融瘤病毒、rnai、癌癥輔助治療的一種或多種方法聯(lián)合治療，其中包括但不限于以下抗腫瘤類藥物和治療方法：

1)烷化劑如順鉑、順鉑、奧沙利鉑、苯丁酸氮芥、卡環(huán)磷酰胺，氮芥、美法侖、替莫唑胺、白消安、亞硝基脲類。

2)抗腫瘤抗生素類如阿霉素、博來(lái)霉素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素c、放線菌素、光神霉素；抗有絲分裂藥如長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春地辛，長(zhǎng)春瑞濱，紫杉醇、泰索帝、polo激酶抑制劑。

3)抗代謝和抗葉酸劑如氟嘧啶、雷甲氨蝶呤、阿糖胞苷、替曲塞、羥基脲。

4)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑如表鬼臼毒素、喜樹堿。

5)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑如抗雌激素/抗雄激素類藥物如他莫昔芬、氟維司群、托瑞米芬、雷諾昔芬、屈諾昔芬、碘昔芬；如比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、醋酸環(huán)丙孕酮。

lhrh拮抗劑或lhrh激動(dòng)劑如戈舍瑞林、亮丙瑞林、和布舍瑞林、孕激素類如醋酸甲地孕酮。

芳香酶抑制劑如阿那曲唑、來(lái)曲唑、伏羅唑、伊西美坦、5a-還原酶抑制劑如非那雄胺。

6)抗侵襲劑如c-src激酶家族抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，尿激酶纖溶酶原激活物受體功能的抑制劑或者類肝素酶的抗體。

7)生長(zhǎng)功能的抑制劑如生長(zhǎng)因子抗體和生長(zhǎng)因子受體抗體如抗her2抗體曲妥珠單抗、抗egfr抗體帕尼單抗、抗egfr抗體西妥昔單抗等；這種抑制劑還包括其它酪氨酸激酶抑制劑以及絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制劑如ras/raf信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，mek和/或akt激酶的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、c-kit抑制劑、abl激酶抑制劑、pi3激酶抑制劑、flt3激酶抑制劑、csf-1r激酶抑制劑、igf受體激酶抑制劑，極光激酶抑制劑，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑如cdk2和/或cdk4，cdk6抑制劑。

8)抗血管生成劑如抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作用的藥劑貝伐珠單抗以及vegf受體酪氨酸激酶抑制劑。

9)腫瘤免疫治療法包括任何提高患者腫瘤細(xì)胞的免疫原性的體外和體內(nèi)方法。如細(xì)胞因子il-2、il-4或者gm-csf進(jìn)行轉(zhuǎn)染；降低t細(xì)胞無(wú)效能的方法如抗pd-1/pd-l單抗；使用轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞如細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞的方法；使用細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系的方法；降低免疫抑制性細(xì)胞如調(diào)節(jié)性t細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、或表達(dá)吲哚胺2，3-脫氧酶的樹突狀細(xì)胞的功能方法；以及腫瘤相關(guān)抗原蛋白類或肽類組成的癌癥疫苗的方法。

10)嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療(cart)。

11)腫瘤基因治療如crispr-cas9，rnai，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

應(yīng)予說(shuō)明，如果任何給定取代基的數(shù)量沒有規(guī)定(例如，鹵代烷基)，則可以存在一個(gè)或多個(gè)取代基。例如，“鹵代烷基”可以含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同的鹵素。

在本文的描述中，如果化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)名稱彼此矛盾時(shí)，則是以其化學(xué)結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。

當(dāng)在本文使用時(shí)，對(duì)于任何保護(hù)基團(tuán)和其他化合物的縮寫，除非另有說(shuō)明，以其常用的公認(rèn)縮寫表示，或根據(jù)iupac-iubcommissiononbiochemicalnomenclature表示(參見，biochem.1972，77：942-944)。

實(shí)施例

以下列舉實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的任何限制。

實(shí)施例1

n-(5-(4-(3-溴苯基氨基)-嘧啶-2-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物1)的制備

3-溴苯胺(2.7g，15mmol)、2，4-二氯嘧啶(2.7g，18mmol)、碳酸氫鈉(2.5g，30mmol)加到30ml異丙醇中，85℃加熱反應(yīng)10小時(shí)，減壓蒸去異丙醇，再加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3g)。m/z：esimh⁺286.0

中間體1(1.4g，5mmol)、2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(0.9g，5mmol)、對(duì)甲苯磺酸(1.03g，6mmol)加到15ml2-戊醇中，115℃加熱3小時(shí)，冷至室溫過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗兩次，干燥得中間體2(1.6g)。m/z：esimh⁺434.0。

中間體2(43g，1mmol)、n，n，n′-三甲基乙二胺(0.15g，1.5mmol)、無(wú)水碳酸鉀(0.28g，2mmol)加到2mldmf中，90℃加熱3小時(shí)，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時(shí)，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體4(0.24g)，m/z：esimh⁺486.1。

中間體4(0.24g，0.5mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.05g，0.55mmol)，加完攪拌1小時(shí)，升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標(biāo)化合物70mg。

采用與實(shí)施例1同樣的方式制備表1中的化合物。

表1

實(shí)施例2

n-(5-(4-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物32)的制備

吲哚(8.7，74mmol)、2，4-二氯嘧啶(16g，107mmol)、hobt(2g，14.8mmol)、無(wú)水碳酸鉀(20g，145mmol)加到dmf中，85℃反應(yīng)15小時(shí)，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(8g)。msm/z：es⁺mh⁺230.1

按照實(shí)施例1的方法，可制備目標(biāo)化合物。

采用與實(shí)施例2同樣的方式制備表2中的化合物。

表2

實(shí)施例3

n-(5-(4-(1h-苯基[d]咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物106)的制備

苯并咪唑(2.4g，20mmol)、碳酸鉀(5.6g，40mmol)、2，4-二氯嘧啶(4.5g，30mmol)加到5mldmf中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(2.1g)。m/z：esimh⁺231.0。

按照實(shí)施例1的方法，可制備目標(biāo)化合物。

采用與實(shí)施例3同樣的方式制備表3中的化合物。

表3

實(shí)施例4

n-(5-(4-(3-氯-苯基氨基)-[1，3，5]三嗪-2-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物108)的制備

3-氯苯胺(2.56g，20mmol)、diea(3.08g，24mmol)加到20mldmf中，冰鹽浴冷卻，滴加2，4-二氯-1，3，5-三嗪(3.29g，22mmol)的dmf溶液，冰鹽浴攪拌2.5小時(shí)，反應(yīng)液倒入水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3.65g)。m/z：esimh⁺241.0。

按照實(shí)施例1的方法，可制備目標(biāo)化合物。

采用與實(shí)施例4同樣的方式制備表4中的化合物。

表4

實(shí)施例5

n-(5-(6-(3-溴-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-2-((2-二甲基氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物133)的制備

3-溴苯胺(2.7g，15mmol)、4，6-二氯嘧啶(2.7g，18mmol)、碳酸氫鈉(2.5g，30mmol)加到30ml異丙醇中，85℃加熱反應(yīng)10小時(shí)，減壓蒸去異丙醇，再加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(4g)。m/z：esimh⁺286.0

按照實(shí)施例1的方法，可制備目標(biāo)化合物。

采用與實(shí)施例5同樣的方式制備表5中的化合物。

表5

實(shí)施例6

n-(5-(6-(1h-吲哚-1-基)-嘧啶-4-基氨基)-2-(2-(二甲氨基-乙基)-甲基-氨基)-4-甲氧基-苯基)-丙烯酰胺(化合物155)的制備

按照實(shí)施例2、3的方法用4，6-二氯嘧啶代替2，4-二氯嘧啶，可制備目標(biāo)化合物。

采用與實(shí)施例6同樣的方式制備表6中的化合物。

表6

實(shí)施例7

n-(4-甲氧基-5-(6-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)嘧啶-4-基氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯基)-丙烯酰胺(158)的制備

1-甲基吲哚(2.5ml，23mmol)、4，6-二氯嘧啶(3g，23mmol)、無(wú)水三氯化鋁(3g，23mmol)加到30ml1，2-二氯乙烷中，45℃加熱反應(yīng)4小時(shí)，冷至室溫，加入1m稀鹽酸、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體1(3.5g)。m/z：esimh⁺244.1

中間體1(1.2g，5mmol)、2-甲氧基-4-氟-5-硝基苯胺(0.9g，5mmol)、對(duì)甲苯磺酸(1.03g，6mmol)加到15ml2-戊醇中，115℃加熱3小時(shí)，冷至室溫過(guò)濾，濾餅用甲基叔丁基醚洗兩次，干燥得中間體2(1.4g)。m/z：esimh⁺394.1。

中間體2(0.4g，1mmol)、n-甲基哌嗪(0.15g，1.5mmol)、無(wú)水碳酸鉀(0.28g，2mmol)加到2mldmf中，90℃加熱3小時(shí)，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時(shí)，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體4(0.23g)。m/z：esimh⁺444.3。

中間體4(0.22g，0.5mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.05g，0.55mmol)，加完攪拌1小時(shí)，升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標(biāo)化合物70mg。m/z：esimh⁺498.4

實(shí)施例8

n-(4-甲氧基-2-(2-甲氧基-乙氧基)-5-(6-(1-甲基-1h-吲哚-3-基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-丙烯酰胺(化合物196)的制備

實(shí)施例7中的中間體2(0.4g，1mmol)、乙二醇單甲醚(0.15g，2mmol)、氫氧化鈉(0.16g，4mmol)加到2mldmf中，60℃加熱5小時(shí)，冷至室溫，加入水、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層濃縮后加入鐵粉(0.28g，5mmol)、氯化銨(0.27g，5mmol)、水(5ml)、乙醇(15ml)，80℃加熱反應(yīng)5小時(shí)，趁熱濾除鐵泥，濾液濃縮后加水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層干燥、濃縮、柱層析得中間體70.18g。m/z：esimh⁺420.

中間體7(0.18g，0.43mmol)、n，n-二異丙基乙基胺(0.2g，1.5mmol)加到四氫呋喃中，冰水浴冷卻，滴加丙烯酰氯(0.045g，0.5mmol)，加完攪拌1小時(shí)，升至室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入水、二氯甲烷萃取，二氯甲烷層無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析得目標(biāo)化合物45mg。

采用與實(shí)施例7、8同樣的方式制備表7中的化合物。

表7

試驗(yàn)例化合物活性測(cè)定

以下對(duì)上述實(shí)施例中合成的丙烯酰胺苯胺組合衍生物的代表例，進(jìn)行表達(dá)不同癌基因的腫瘤細(xì)胞體外與體內(nèi)生長(zhǎng)抑制活性的測(cè)定。測(cè)定方法和結(jié)果如下。

試驗(yàn)例1

化合物對(duì)egfr野生型和突變型以及her2/erbb2表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)

50％抑制(gi50)濃度范圍的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.腫瘤細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

腫瘤細(xì)胞系是研究腫瘤體外生長(zhǎng)抑制的有效細(xì)胞模型。我們選擇具有代表性的腫瘤細(xì)胞系應(yīng)用于化合物活性測(cè)定。所有使用的細(xì)胞系分別購(gòu)于atcc和中科院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)條件與方法按每種細(xì)胞系要求進(jìn)行。每次體外培養(yǎng)不超過(guò)3次傳代。根據(jù)需要，可對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行單克隆純化與鑒定。

細(xì)胞培養(yǎng)基分別選用rpmi1640(gibco)，mem(gibco)，mccoy′s5a(gibco)，imdm(gibco)，加入5-20％胎牛血清(gibco)，1％雙抗，2mm谷氨酰胺或者1mm丙酮酸鈉。

(1)表達(dá)egfr酪蛋白激酶野生型和突變型的腫瘤細(xì)胞系

egfr野生型細(xì)胞系：a431人表皮癌細(xì)胞(egfr野生型/高表達(dá)，中科院上海細(xì)胞庫(kù))，nci-h460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞(egfr為野生型，krasg61h，atcc)，h1299非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(egfr為野生型，atcc)，a375黑色素瘤細(xì)胞系(egfr野生型性，brafv600e，中科院上海細(xì)胞庫(kù))，nci-h292人肺癌(egfr野生型性，來(lái)自人肺粘液表皮樣癌/淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，中科院上海細(xì)胞庫(kù))，用1×rpmi1640，加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)以上。用1×ham'sf12k，加10％fbs，1％雙抗，2mm谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)a549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(egfr野生型，krasg12s突變型，中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

egfr突變型細(xì)胞系：非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞pc-9(atcc)和hcc827細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))是egfrexon19(e746-a750)缺失型突變細(xì)胞系，第一代egfr抑制劑敏感。人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞nci-h1975，表達(dá)egfrl858r/t790m雙突變(atcc)，第一代egfr抑制劑抗性；pc-9er由本公司建立的pc-9細(xì)胞株厄洛替尼(erlotinib)獲得性抗性細(xì)胞系，egfr為dele746-a750/t790m突變型，第一代egfr抑制劑抗性。

(2)her2基因擴(kuò)增或高表達(dá)的細(xì)胞系

人胃癌細(xì)胞系nci-n87(atcc)，人乳腺癌細(xì)胞株hcc1954((her2/erb2選擇性可逆抑制劑拉帕替尼lapatinib耐藥性細(xì)胞株，gi50＞1000nm)和zr-75-30(atcc)，au565(atcc)腺癌細(xì)胞系，nci-h2170人肺鱗狀細(xì)胞癌(atcc)，分別用1×rpmi1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(10％fbs)培養(yǎng)；人肺腺癌細(xì)胞calu-3(atcc)培養(yǎng)基為1×mem，10％fbs，1％雙抗，1％neaa(gibco)，2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸鈉。人乳腺癌細(xì)胞sk-br-3用mccoy′s5a完全培養(yǎng)基(10％fbs)培養(yǎng)。

(3)過(guò)表達(dá)met酪蛋白激酶的腫瘤細(xì)胞系

mkn-45人胃癌細(xì)胞(atcc)和非小細(xì)胞肺癌nci-h1993(atcc)分別用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(4)表達(dá)alk融合蛋白及突變株的腫瘤細(xì)胞系

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株nci-h2228(atcc)表達(dá)eml4-alk融合基因，人間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株karpas-299(atcc)表達(dá)npm-alk融合基因，用1xrpmi1640(10％fbs)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞sh-sy5y(中科院上海細(xì)胞庫(kù))表達(dá)alkf1174l突變蛋白，用mem完全培養(yǎng)基(1xmem，10％fbs，1％neaa，1mm丙酮酸鈉)培養(yǎng)。

(5)表達(dá)bcr-abl酪蛋白激酶細(xì)胞系

人白血病細(xì)胞株k562(atcc)表達(dá)bcr-abl融合蛋白。用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(6)表達(dá)flt3-itd酪蛋白激酶突變株的細(xì)胞系

flt3屬于酪蛋白激酶，其中臨床上約20-30％急性髓細(xì)胞白血病(aml)病人表達(dá)flt3-itd突變蛋白。mv4-11表達(dá)flt3-itd酪蛋白激酶，用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(7)表達(dá)jak2v617f酪蛋白激酶突變株細(xì)胞系

jak2是一種非受體酪蛋白激酶(januskinase2)。在細(xì)胞生長(zhǎng)，分化與轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。jak2基因突變往往導(dǎo)致骨髓增生及轉(zhuǎn)化，特別是jak2v167f突變常見于臨床病人。人紅白血病細(xì)胞系hel表達(dá)jak2v167f，用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(8)表達(dá)brutons酪蛋白激酶(btk)突變株細(xì)胞系

ramos是btk酪蛋白激酶表達(dá)陽(yáng)性的人b淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

(9)表達(dá)kit酪蛋白激酶突變株細(xì)胞系

kasumi-1是kit酪蛋白激酶n822k突變株表達(dá)陽(yáng)性白血病細(xì)胞系。kit酪蛋白激酶異常變異常常出現(xiàn)在一些癌癥病人中。kasumi-1細(xì)胞用1×rpmi1640加10％fbs的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.藥物處理

貼壁細(xì)胞用0.25％胰酶-edta(gibco)消化，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞直接離心收集(1700rpm，3分鐘)，棄上清，計(jì)數(shù)細(xì)胞。根據(jù)每種細(xì)胞生長(zhǎng)周期，配制不同的細(xì)胞濃度(每毫升5-10×10⁴細(xì)胞)，接種到96孔板(coming)，每孔100微升，37℃，5％co2培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，加入待測(cè)化合物到培養(yǎng)細(xì)胞中，平行2孔。有機(jī)溶劑終濃度不超過(guò)千分之一，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，mtt測(cè)定。

待測(cè)化合物與參比化合物用dmso(sigma)溶解，化合物純度達(dá)98％以上?；衔镔A存濃度為10mm，-20℃保存，使用前對(duì)倍或者10倍系列稀釋。

3.mtt檢測(cè)及gi50計(jì)算

mtt檢測(cè)試劑為dojindocck8試劑盒，酶標(biāo)測(cè)定儀為thermomultiskanfc儀。

將貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，立即加入新配制的含10％cck8的完全培養(yǎng)基(5％fbs)，每孔100ul。懸浮細(xì)胞可直接加入cck8試劑，終濃度為10％，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時(shí)，當(dāng)溶劑對(duì)照孔呈現(xiàn)暗黃色時(shí)，測(cè)od450nm光吸收值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)率。細(xì)胞生長(zhǎng)率％＝100*(t-t0)/(c-t0)，t＝藥物處理細(xì)胞孔光密度值-空白對(duì)照孔光密度值；t0＝藥物處理前細(xì)胞孔光密度值-空白對(duì)照孔光密度值；c＝溶劑對(duì)照組細(xì)胞孔光密度。通過(guò)藥物濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)率曲線，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)50％抑制的藥物濃度即gi50。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表8總結(jié)本發(fā)明化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制gi50濃度范圍的結(jié)果，gi50值越小，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性越強(qiáng)，而化合物對(duì)egfr野生型細(xì)胞生長(zhǎng)抑制(gi50)濃度越高，即egfr野生型gi50/egfr突變型gi50比值越大，化合物選擇性越好。

表8

試驗(yàn)例2

化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制gi50值的測(cè)定

選擇10個(gè)本發(fā)明化合物2，18，19，32，106，114，118，140，147，183，采用第三代egfr抑制劑azd9291作參比，對(duì)表達(dá)臨床常見癌基因的一些腫瘤細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)?；衔镆?000nm為起始濃度，對(duì)倍稀釋到0.03nm，按照gi50計(jì)算方法計(jì)算每種化合物的gi50值(表9)。結(jié)果顯示測(cè)試化合物對(duì)表達(dá)egfr突變型細(xì)胞(h1975，pc-9，hcc827)具有較高的抑制活性，gi50小于20nm，對(duì)egfr野生型高表達(dá)細(xì)胞a431需要相對(duì)高的濃度才呈現(xiàn)明顯的抑制作用，而對(duì)多數(shù)egfr野生型正常表達(dá)細(xì)胞株相對(duì)無(wú)抑制效果。同時(shí)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對(duì)her2基因擴(kuò)增或高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系(n87，au565，sk-rb-3，h2170，zr-75-30和calu-3)具有選擇性的強(qiáng)抑制作用，活性遠(yuǎn)強(qiáng)于參比化合物。除化合物114，118，140，147和183對(duì)表達(dá)flt3-itd及btk基因的mv4-11和ramos細(xì)胞有中等程度的抑制作用外，測(cè)試化合物對(duì)其它癌基因表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)無(wú)抑制作用。

表9

試驗(yàn)例3

腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

免疫缺陷小鼠的異種移植是測(cè)試化合物動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤活性的有效模型。一般來(lái)講，人腫瘤細(xì)胞異種移植試驗(yàn)的有效性和人體腫瘤臨床治療呈一定的正相關(guān)。bab/c免疫缺陷小鼠是最常用的腫瘤細(xì)胞異種移植動(dòng)物之一。為了測(cè)試本發(fā)明化合物是否能夠同樣抑制egfr突變株細(xì)胞和her2/erbb2過(guò)表達(dá)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)生長(zhǎng)，首先選用h1975，pc-9和nci-n87細(xì)胞bab/c裸鼠腫瘤模型進(jìn)行試驗(yàn)。將生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的h1975，pc-9，nci-n87腫瘤細(xì)胞用胰酶消化，加適量1xrpmi1640培養(yǎng)基(無(wú)血清)終止消化，收集細(xì)胞于50ml離心管(coming)，1700rm離心3分鐘。棄上清，用1xrpmi1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，配制成5-10x10⁷細(xì)胞/毫升，置冰上，皮下接種5-10x10⁶(0.2ml)細(xì)胞于6-8周齡(重20克左右)雌性bab/c裸鼠右側(cè)背部。當(dāng)腫瘤塊生長(zhǎng)到大小在100-200mm³體積時(shí)，隨機(jī)分組(每組3-6只)，耳扎標(biāo)記，稱重。待測(cè)化合物純度達(dá)為99％以上，單雜不高于0.2％，用cm(30％聚乙二醇400，0.5％tween-80，2.5％丙二醇)將藥物配制成乳狀混懸液，以0.1ml/每10克的體積每日一次，連續(xù)灌胃給藥，藥量為25mg/kg。每周測(cè)量腫瘤3次。當(dāng)cm對(duì)照組腫瘤平均體積達(dá)到1500mm³時(shí)，或給藥到30天時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

腫瘤體積按v＝1/2axb²計(jì)算，a為長(zhǎng)，b為寬。抑瘤率＝(對(duì)照組平均體積-治療組平均體積)/對(duì)照組平均體積×100％。

測(cè)試化合物藥量為25mg/kg灌胃給藥19天時(shí)，三種腫瘤細(xì)胞動(dòng)物模型的腫瘤生長(zhǎng)均能夠有效的被抑制而動(dòng)物體重不受影響。

表10本發(fā)明化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)(第19天)的結(jié)果