本發(fā)明涉及藥物合成領(lǐng)域，具體涉及對(duì)硝基苯胺修飾的多肽的合成方法。

背景技術(shù)：

含有對(duì)硝基苯胺修飾的多肽是一類具有藥物活性的多肽類分子，是多種氨肽酶家族成員活性測(cè)試的一個(gè)重要的合成底物。氨肽酶(aminopeptidases)作為一種蛋白質(zhì)水解酶，能從多肽鏈的游離n端(氨基末端)由外向內(nèi)逐個(gè)水解氨基酸。這些氨肽酶不僅在調(diào)節(jié)人體正常的生理功能方面起重要作用，而且已成為疾病診斷和治療的靶標(biāo)，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。在藥物研究領(lǐng)域，對(duì)硝基苯胺修飾的多肽對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲以及血管生成過(guò)程中起重要作用，是研究抗腫瘤藥物的一個(gè)重要靶標(biāo)。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，發(fā)展合成c端被對(duì)硝基苯胺修飾的多肽方法具有十分重要的意義。目前較少有文獻(xiàn)和專利報(bào)道合成對(duì)硝基苯胺修飾多肽c端的方法。

對(duì)硝基苯胺分子中硝基具有很強(qiáng)的吸電子能力，且硝基和氨基處于苯環(huán)的對(duì)位，在形成酰胺鍵的過(guò)程十分緩慢，導(dǎo)致反應(yīng)收率降低。很少有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于l-天冬氨pna、l-谷氨酸pna等的合成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)多肽分子直接與對(duì)硝基苯胺反應(yīng)的收率一般都比較低。在多肽修飾過(guò)程中，隨著多肽分子的增大，修飾的困難程度也隨著加大，發(fā)展高效合成pna修飾多肽的方法具有重要的意義。

文獻(xiàn)(化學(xué)試劑，2012，34(3)，269—271)報(bào)道合成pna氨基酸常采用光氣法合成，該方法首先將光氣與氨基酸作用得到相應(yīng)的nca中間體，然后將nca中間體與pna反應(yīng)得到pna修飾的氨基酸；由于光氣的毒性大，該工藝經(jīng)過(guò)改進(jìn)，采用毒性較小的三光氣進(jìn)行反應(yīng)也可以得到相應(yīng)的pna修飾氨基酸。盡管工藝對(duì)收率有所提高，但無(wú)論三光氣還是光氣都具有較大的的毒性，且對(duì)設(shè)備、環(huán)境、操作人員都有劇烈的傷害。對(duì)于多肽分子直接用三光氣進(jìn)行pna修飾的文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。采用常規(guī)的全保護(hù)多肽片段進(jìn)行pna修飾收率十分低下不易于純化，最后導(dǎo)致成本急劇上升，給醫(yī)學(xué)的進(jìn)一步研究帶來(lái)了困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述問(wèn)題，本發(fā)明采用固相合成法、以便宜的fmoc保護(hù)氨基酸為原料，首先選用液相反應(yīng)制備得到相應(yīng)的fmoc-glu(oh)-pna、fmoc-asp(oh)-pna、fmoc-ser(oh)-pna、fmoc-thr(oh)-pna，經(jīng)重結(jié)晶的方 法得到純度在95％以上的pna氨基酸原料，然后采用固相合成的方法進(jìn)行氨基酸縮合，最后經(jīng)裂解得到目標(biāo)粗肽。采用該方法得到的粗肽純度較高，便于液相純化，該方法大大的降低了生產(chǎn)成本。

本發(fā)明包括以下步驟：

1)pna氨基酸單體的制備

2)氨基酸側(cè)鏈與樹脂的偶聯(lián)；

3)固相合成方法逐一偶聯(lián)；

4)肽樹脂的裂解；

5)反相高效液相色譜純化；

所述步驟1)pna修飾的氨基酸采用fmoc保護(hù)的氨基酸經(jīng)縮合反應(yīng)、去保護(hù)反應(yīng)兩個(gè)步驟合成；

所述步驟a)縮合反應(yīng)步驟得到的全保護(hù)pna氨基酸無(wú)需采用重結(jié)晶純化，只需要簡(jiǎn)單的酸洗、堿洗即可直接進(jìn)行去保護(hù)反應(yīng)；

所述步驟a)去保護(hù)反應(yīng)步驟中，得到的粗品進(jìn)行重結(jié)晶即可得到純度在95％以上的側(cè)鏈裸露的pna修飾氨基酸；

所述步驟b)中采用氨基酸側(cè)鏈接樹脂的方法進(jìn)行偶聯(lián)；

所述步驟b)中針對(duì)fmoc-glu(oh)-pna、fmoc-asp(oh)-pna接樹脂可以選擇wang樹脂和2-ctc氯樹脂；

所述步驟b)中針對(duì)fmoc-ser(oh)-pna、fmoc-thr(oh)-pna接樹脂選擇2-ctc氯樹脂；

所述步驟b)中fmoc-ser(oh)-pna、fmoc-thr(oh)-pna連接樹脂選擇2-ctc氯樹脂采用dipea+csco3的方法，氮?dú)夥諊臈l件反應(yīng)24小時(shí)；

所述步驟2)中fmoc-glu(oh)-pna、fmoc-asp(cooh)-pna接樹脂采用常規(guī)的偶聯(lián)方法；連接wang樹脂采用dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp；連接2-ctc氯樹脂采用dipea法；

所述步驟3)中偶聯(lián)采用dic+a或b+a+c的方法縮合，反應(yīng)至茚三酮檢測(cè)樹脂透明；其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp；

所述步驟4)中裂解采用不同配比的tfa：phsme：edt：phome：h2o溶液。

具體工藝流程如下：

本發(fā)首先采用液相合成的方法制備對(duì)硝基苯胺修飾的fmoc氨基酸，通過(guò)重結(jié)晶的方法可以很好的控制然后將氨基酸的側(cè)鏈連接至樹脂上，順序偶聯(lián)，最后裂解、純化得到對(duì)硝基苯胺修飾的長(zhǎng)肽分子。采用該方法解決了對(duì)硝基苯胺修飾長(zhǎng)肽的技術(shù)問(wèn)題，fmoc固相法合成對(duì)硝基苯胺修飾的長(zhǎng)肽具有成本低、便于純化，其中pna修飾的短肽產(chǎn)品純度可以達(dá)到99％以上。

合成工藝路線：以fmoc-asp(otbu)-oh為例：

本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種對(duì)硝基苯胺修飾α羧基的氨基酸的制備方法，

1)將氨基酸的α氨基和側(cè)鏈活性基團(tuán)進(jìn)行保護(hù)，

2)將步驟1)所得保護(hù)的氨基酸與對(duì)硝基苯胺在縮合劑的作用下進(jìn)行縮合，得到粗產(chǎn)品，所得粗產(chǎn)品以酸性和/或堿性水溶液以及中性水溶液進(jìn)行洗滌，而不進(jìn)行其他純化步驟即進(jìn)入步驟3)，

3)將步驟2)所得的粗產(chǎn)品脫去側(cè)鏈保護(hù)，

4)將步驟3)所得的脫去側(cè)鏈保護(hù)的粗產(chǎn)品溶解，調(diào)節(jié)ph值為酸性，并進(jìn)行重結(jié)晶純化。

進(jìn)一步地，所述側(cè)鏈活性基團(tuán)為羥基或羧基，側(cè)鏈保護(hù)選自-tbu。

進(jìn)一步地，步驟2)中的縮合方法選用dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp的方法。其中dic+a組合摩爾比1-1.5:1-1.5、b+a+c組合摩爾比1-1.5:1-1.5:1.5-2、；優(yōu)選地dic+hoat、dipea+hoat+hatu體系，所述保護(hù)的氨基酸與對(duì)硝基苯胺的摩爾比為1:1-1.5(1:1.1)，更優(yōu)選地，先以縮合劑催化氨基酸，然后再加入對(duì)硝基苯胺；后處理過(guò)程中采用酸性溶液為鹽酸水溶液、堿性溶液為飽和碳酸氫鈉或碳酸鈉溶液、中性溶液為飽和食鹽水溶液。

進(jìn)一步地，其中步驟3)是以tfa/ch2cl2溶液進(jìn)行脫去側(cè)鏈保護(hù)的反應(yīng)，反應(yīng)停止后去除有機(jī)溶劑，將剩余溶液倒入冰水中進(jìn)行過(guò)濾得到脫去側(cè)鏈保護(hù)的粗產(chǎn)品；優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為20-30℃(室溫)，反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)(2小時(shí))。

進(jìn)一步地，其中步驟4)中的ph值調(diào)節(jié)至5-6，并以乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、丙酮、二氯甲烷、甲醇、乙醇等溶劑或其混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種對(duì)硝基苯胺修飾多肽c端的固相合成方法，其包括如下步驟：

a)根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法制備對(duì)硝基苯胺修飾α羧基的氨基酸；

b)將氨基酸側(cè)鏈與樹脂的偶聯(lián)；

c)固相合成方法逐一偶聯(lián)氨基酸，形成肽樹脂；

d)肽樹脂的裂解；

e)反相高效液相色譜純化。

進(jìn)一步地，根據(jù)權(quán)利要求6所述的對(duì)硝基苯胺修飾多肽c端的固相合成方法，其中，

步驟b)中針對(duì)fmoc-glu(oh)-pna、fmoc-asp(oh)-pna接樹脂選擇wang樹脂或2-ctc氯樹脂；優(yōu)選地，連接wang樹脂采用dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp；連接2-ctc氯樹脂采用dipea法；

針對(duì)fmoc-ser(oh)-pna、fmoc-thr(oh)-pna接樹脂選擇2-ctc氯樹脂；優(yōu)選采用dipea+csco3的方法，氮?dú)夥諊臈l件反應(yīng)24小時(shí)；

進(jìn)一步地，步驟3)中偶聯(lián)采用dic+a或b+a+c的方法縮合，反應(yīng)至茚三酮檢測(cè)樹脂透明；其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp。

進(jìn)一步地，步驟4)中裂解采用不同配比的tfa：phsme：edt：phome：h2o溶液。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2所得產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖2為實(shí)施例5所得產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖3為實(shí)施例8所得產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

圖4為實(shí)施例11所得產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。

具體實(shí)施方式

下面給出實(shí)施例以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員根據(jù)本發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：側(cè)鏈保護(hù)，主鏈被pna修飾的asp的合成

于1l反應(yīng)瓶中加入400ml二氯甲烷、fmoc-asp(otbu)42.2g(102mmol)，攪拌使原料全部溶解；溶液澄清后向反應(yīng)瓶中加入hoat16.7g(122mmol)和dic19ml(123mmol)繼續(xù)攪拌30min，然后向溶液中加入對(duì)硝基苯胺(pna)15.5g(115mmol)室溫反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)停止后向反應(yīng)瓶中加水淬滅反應(yīng)，依次用2mol/l鹽酸溶液洗滌兩遍、飽和碳酸鈉溶液洗滌兩遍和飽和食鹽水洗滌一遍；有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到fmoc-asp(otbu)-pna粗產(chǎn)物。

實(shí)施例2：側(cè)鏈裸露，主鏈被pna修飾的asp的合成

實(shí)施例1中得到的fmoc-asp(otbu)-pna粗產(chǎn)物用400ml濃度為80％tfa/ch2cl2(體積比)溶液進(jìn)行脫去tbu反應(yīng)。室溫反應(yīng)兩小時(shí)，反應(yīng)停止后減壓除去大部分二氯甲烷溶液，將剩余溶液倒入500ml冰水中，過(guò)濾得到fmoc-asp(oh)-pna粗品；用二氯甲烷溶解粗品，飽和碳酸氫鈉洗滌粗品溶液直到無(wú)明顯氣泡產(chǎn)生，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)水相ph至5-6，分出有機(jī)相采用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得fmoc-asp(oh)-pna，乙酸乙酯對(duì)粗品進(jìn)行重結(jié)晶得產(chǎn)品30.1g，反應(yīng)收率62％。產(chǎn)物結(jié)果通過(guò)質(zhì)譜和核磁確認(rèn)重結(jié)晶后產(chǎn)物為fmoc-asp(oh)-pna；ms：[m+h]＝476.17:；1h-nmr(dmso-d6,400m)ppm，δ7.69(d,j＝3.9hz,2h),7.56(d,j＝8.8hz,4h),7.40(d,j＝8.8hz,4h),7.18(d,j＝4.0hz,2h),4.84(d,j＝5.6hz,2h),3.85(d,j＝6.3hz,2h),3.70(t,j＝5.6hz,1h),3.61(t,j＝6.3hz,1h)

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ165.94,160.79,154.07,138.43,137.05,136.47(2c),133.25(2c),128.42(2c),128.10(4c),125.90(4c),118.32(2c), 71.30,67.71,63.45,48.99.

實(shí)施例3：fmoc-asp(oh)-pna與樹脂的反應(yīng)

稱取41.2g替代度為0.485mmol/g的2-ctc氯樹脂，適量dmf洗滌3遍、溶脹30min待用；加入實(shí)施例2中得到的28.5g(60mmol)fmoc-asp(oh)-pna、dipea15.5g(120mmol)，適量dmf反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加入甲醇15ml、dipea7.8g(60mmol)繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后dmf洗滌3遍，即得到fmoc-asp(-2-ctcresin)-pna。

實(shí)施例4：肽樹脂的合成

將實(shí)施例3中得到的fmoc-asp(-2-ctcresin)-pna樹脂繼續(xù)用于合成pna修飾的多肽。在后續(xù)氨基酸的偶聯(lián)中均可按照下列方法進(jìn)行偶聯(lián)，直至樹脂采用茚三酮檢測(cè)透明即可。后續(xù)氨基酸的活化劑為dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp。按照該方法一次偶聯(lián)fmoc-val-oh、fmoc-glu(otbu)-oh和fmoc-asp(otbu)-oh，偶聯(lián)完成后采用20％哌啶dmf溶液脫除fmoc，dmf洗滌6遍以上，甲醇收縮，真空干燥得到肽樹脂53g，待裂解。

實(shí)施例5：肽樹脂的裂解

pna修飾肽樹脂的裂解可以采用的裂解試劑為tfa：phsme：phome：edt：h2o：tis＝80～90:0～5:0～3:0～5:0～5：0～2(v:v)，實(shí)驗(yàn)中選擇tfa：phsme：phome：edt：h2o＝85:5:3:5:2。向?qū)嵤├?中的得到的53g肽樹脂中加入現(xiàn)配的裂解液530ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2.5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去樹脂，濾液采用5l冰凍乙醚沉降、離心、減壓干燥得到pna粗肽12.1g，粗肽純度接近90％，產(chǎn)物結(jié)果通過(guò)質(zhì)譜ms：[m-h]＝595.44。

實(shí)施例6：含pna粗肽的hplc純化

取實(shí)施例5中氧化得到的pna修飾粗肽，減壓過(guò)濾除去不溶物，采用waters2545rp-hplc系統(tǒng)，波長(zhǎng)210nm，色譜柱為50×250mm反相c18柱，柱溫為38℃，常規(guī)0.1％tfa/水/乙腈流動(dòng)相純化，收集目的峰組分、減壓濃縮、冷凍干燥得到純度大于98.5％精肽9.8g。

實(shí)施例7：側(cè)鏈保護(hù)，主鏈被pna修飾的asp合成

于1l反應(yīng)瓶中加入380ml二氯甲烷、fmoc-asp(otbu)37.3g(90mmol)，攪拌使原料全部溶解；溶液澄清后向反應(yīng)瓶中加入hoat14.7g(108mmol)、hatu40.3g(106mmol)，保持溶液溫度在0-5℃，然后慢慢向溶液中慢慢加入die29.2ml(180mmol)，30min后向溶液中加入對(duì)硝基苯胺(pna)13.7g(100mmol) 室溫反應(yīng)24小時(shí)；反應(yīng)停止后向反應(yīng)瓶中加水淬滅反應(yīng)，依次用2mol/l鹽酸溶液洗滌兩遍、飽和碳酸鈉溶液洗滌兩遍和飽和食鹽水洗滌一遍；有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得到fmoc-asp(otbu)-pna粗產(chǎn)物。

實(shí)施例8：側(cè)鏈裸露，主鏈被pna修飾的asp合成

實(shí)施例7中得到的fmoc-asp(otbu)-pna粗產(chǎn)物用400ml濃度為80％tfa/ch2cl2(體積比v/v)溶液進(jìn)行脫去tbu反應(yīng)。室溫反應(yīng)兩小時(shí)，反應(yīng)停止后減壓除去大部分二氯甲烷溶液，將剩余溶液倒入500ml冰水中，過(guò)濾得到fmoc-asp(oh)-pna粗品；用二氯甲烷溶解粗品，飽和碳酸氫鈉洗滌粗品溶液直到無(wú)明顯氣泡產(chǎn)生，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)水相ph至5-6，分出有機(jī)相采用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得fmoc-asp(oh)-pna，乙酸乙酯對(duì)粗品進(jìn)行重結(jié)晶得產(chǎn)品27.5g，反應(yīng)收率64％。產(chǎn)物結(jié)果通過(guò)質(zhì)譜和核磁確認(rèn)重結(jié)晶后產(chǎn)物為fmoc-asp(oh)-pna；ms：[m-h]＝474.42:；1h-nmr(dmso-d6,400m)ppm，δ7.72(d,j＝3.9hz,2h),7.61(d,j＝8.8hz,4h),7.43(d,j＝8.8hz,4h),7.22(d,j＝4.0hz,2h),4.89(d,j＝8.1,5.6hz,2h),3.89(d,j＝6.3hz,2h),3.75(t,j＝6.0hz,1h),3.65(t,j＝5.3hz,1h)

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ166.04,160.89,154.27,138.49,137.16,136.66(2c),133.32(2c),128.49(2c),128.18(4c),125.99(4c),118.39(2c),71.39,67.81,63.55,48.97.

實(shí)施例9：fmoc-asp(oh)-pna與樹脂的反應(yīng)

稱取35.2g替代度為0.512mmol/g的wang脂，適量dmf洗滌3遍、溶脹30min待用；用適量的dmf溶解fmoc-asp(oh)-pna25.7g(54mmol)、hobt7.3g(54mmol)，冰浴冷卻反應(yīng)體系，保持溶液溫度在0-5℃，然后慢慢加入dic8.5g(65mmol)，活化3min后倒入反應(yīng)柱中繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)停止后用適量dmf洗滌3遍，加入適量的乙酸酐和吡啶混合溶液(體積比7:6)繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后dmf洗滌6遍，即得到fmoc-asp(-wangresin)-pna。

實(shí)施例10：肽樹脂的合成

將實(shí)施例9中得到的fmoc-asp(-wangresin)-pna樹脂繼續(xù)用于合成pna 修飾的多肽。在后續(xù)氨基酸的偶聯(lián)中均可按照下列方法進(jìn)行偶聯(lián)，直至樹脂采用茚三酮檢測(cè)透明即可。后續(xù)氨基酸的活化劑為dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp。按照該方法一次偶聯(lián)fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh和fmoc-ile-oh，偶聯(lián)完成后采用20％哌啶dmf溶液脫除fmoc，dmf洗滌6遍以上，甲醇收縮，真空干燥得到肽樹脂48g，待裂解。

實(shí)施例11：肽樹脂的裂解

pna修飾肽樹脂的裂解可以采用的裂解試劑為tfa：phsme：phome：edt：h2o：tis＝80～90:0～5:0～3:0～5:0～5:0～2(v:v)，實(shí)驗(yàn)中選擇tfa：phsme：phome：edt：h2o＝85:5:3:5:2。向?qū)嵤├?中的得到的53g肽樹脂中加入現(xiàn)配的裂解液530ml，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2.5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾除去樹脂，濾液采用5l冰凍乙醚沉降、離心、減壓干燥得到pna粗肽9.5g，粗肽純度接近90％；產(chǎn)物結(jié)果通過(guò)質(zhì)譜ms：[m-h]＝595.54。

實(shí)施例12：含pna粗肽的hplc純化

取實(shí)施例5中氧化得到的pna修飾粗肽，減壓過(guò)濾除去不溶物，采用waters2545rp-hplc系統(tǒng)，波長(zhǎng)210nm，色譜柱為50×250mm反相c18柱，柱溫為38℃，常規(guī)0.1％tfa/水/乙腈流動(dòng)相純化，收集目的峰組分、減壓濃縮、冷凍干燥得到純度大于98.5％精肽7.4g。

實(shí)施例13：boc-asp(otbu)-glu(otbu)-val-asp(otbu)-oh的合成

稱取57.5g替代度為0.525mmol/g的2-ctc氯樹脂，適量dmf洗滌3遍、溶脹30min待用；加入37.1g(90mmol)fmoc-asp(otbu)-oh、dipea23.5g(180mmol)，適量dmf反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后加入甲醇20ml、dipea12.4g繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后dmf洗滌3遍，即得到fmoc-asp(otbu)-2-ctcresin。

后續(xù)氨基酸的活化劑為dic+a或b+a+c，其中a為hobt或hoat，b為hbtu、hatu、tbtu、pyaop或pybop，c為dipea或tmp。按照該方法一次偶聯(lián)fmoc-val-oh、fmoc-glu(otbu)-oh和boc-asp(otbu)-oh，偶聯(lián)完成后dmf洗滌3遍，甲醇收縮，真空干燥得到肽樹脂81g，采用1％tfa/ch2cl2(v/v)裂解樹脂得全保護(hù)肽23.7g。

實(shí)施例14：boc-asp(otbu)-glu(otbu)-val-asp(otbu)-oh與pna的偶聯(lián)

將實(shí)施例13中得到的全保護(hù)肽用230ml二氯甲烷溶解，加入hoat4.12g(30mmol)室溫?cái)嚢枞芙夂?，慢慢加入dic3.88g(30mmol)，攪拌30min后 再加入pna4.26g(30mmol)室溫反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后減壓除去溶劑，適量乙酸乙酯溶解，依次用1mol/lhcl溶液、飽和nahco3溶液和氯化鈉溶液洗滌、無(wú)水硫酸鈉干燥，檢驗(yàn)濃縮得到粗肽24.9g。質(zhì)譜可以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰，hplc檢測(cè)粗肽中主要為全保護(hù)肽和pna。

將粗肽采用hplc純化得到asp-glu-val-asp-pna精肽0.585g，收率約3.3％。

說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫的含義列于下表中：