本發(fā)明涉及低聚果糖保存工藝，具體涉及保健食品工藝領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

低聚果糖又稱蔗果低聚糖，是由1～3個果糖基通過β(2—1)糖苷鍵與蔗糖中的果糖基結(jié)合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。100克干重菊芋中約有60—70克菊粉，菊粉是通過線性的β—2，1—糖苷鏈連接的果聚糖，其末端為一蔗糖基。故以菊芋粉為原料用菊糖內(nèi)切酶水解作用，經(jīng)精制最終可得低聚果糖漿。低聚果糖是指2～5個果糖基為鏈節(jié)，以一個葡萄糖基為鏈的端基，以果糖基→果糖連接鍵為主體骨架連結(jié)形成的碳水化合物。即是指1～4個果糖基以β-2，1鍵連接在蔗糖的D-果糖基上而形成的蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）和蔗果六糖（GF5）的混合物。商品低聚果糖一般還含有少量蔗糖、果糖、葡萄糖。（參考目前正在制定中的國家標(biāo)準(zhǔn)中的定義）。低聚果糖是一種天然活性物質(zhì)。甜度為蔗糖的0.3-0.6倍。既保持了蔗糖的純正甜味性質(zhì)，又比蔗糖甜味清爽。是具有調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖雙歧桿菌，促進(jìn)鈣的吸收，調(diào)節(jié)血脂，免疫調(diào)節(jié)，抗齲齒等保健功能的新型甜味劑，被譽(yù)為繼抗生素時代后最具潛力的新一代添加劑——促生物質(zhì)；在法國被稱為原生素（PPE），已在乳制品、乳酸菌飲料、固體飲料、糖果、餅干、面包、果凍、冷飲等多種食品中應(yīng)用。低聚果糖是一種水溶性膳食纖維，長期服用可以降低血清膽固醇，改善脂質(zhì)代謝，經(jīng)動物和人體實(shí)驗證實(shí)。低聚果糖具有如下生理功能：為雙歧桿菌等有益菌所利用，即只增殖10～100倍，時雙歧桿菌（致病菌），具有雙向調(diào)節(jié)之功效。人體攝入低聚果糖后，體內(nèi)有益菌群雙歧桿菌數(shù)量可抑制外源致病菌和腸內(nèi)固有腐敗細(xì)菌如沙門氏菌等生長繁殖，減少腸內(nèi)腐敗物質(zhì)的生長和積累，促進(jìn)腸道蠕動，防止便秘和腹瀉。低聚果糖是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維，能有效降低血清膽固醇、甘油三脂、游離脂肪酸的數(shù)量，對于因血脂高而引起的高血壓、動脈硬化等一系列心血管疾病有較好的改善作用。低聚果糖在大腸內(nèi)被細(xì)菌發(fā)酵生成L－乳酸，可以溶解鈣、鎂、鐵等礦物質(zhì)，促進(jìn) 人體對礦物質(zhì)的吸收。

實(shí)驗證實(shí)，低聚果糖促進(jìn)鈣的吸收率達(dá)70.8%。因此，低聚果糖可以促進(jìn)生長發(fā)育和防止骨質(zhì)疏松癥。同時還可促進(jìn)維生素B1、B2、B3、B6、B12及葉酸的自然形成，從而提高人體新陳代謝水平，提高免疫力和抗病力。預(yù)防及改善由于體內(nèi)毒而引起的皮膚性疾病，可防止面瘡、黑斑、雀斑，青春痘、老人斑，使皮膚亮麗、老化減緩。雙歧桿菌吸收低聚果糖后，迅速增殖，抑制大腸桿菌、沙門氏菌和梭狀芽胞桿菌等腐敗菌發(fā)生作用，減少毒性代謝物（如吲哚、亞硝基氨）的生成，同時迅速將毒性代謝物排出體外，減輕肝臟負(fù)擔(dān)，起到保護(hù)肝臟的作用，預(yù)防各種慢性病、癌癥等作用明顯，低聚果糖極少會被消化道中的胃酸和酶分解，極難被人體吸收。據(jù)測定，低聚果糖的熱值為1.5Kcal/g以下,而蔗糖熱值為4.6Kcal/g,因此攝入低聚果糖后,不會引起肥胖,是理想的,低熱值的功能性甜味劑.低聚果糖不能被突變鏈球菌利用生成不溶性葡聚糖而提供口腔微生物沉積\產(chǎn)酸和腐蝕的場所(牙垢),因此可以防止齲齒。

目前對于重組人成纖維細(xì)胞生長因子低聚果糖的研究主要集中在其生物功能特性上，而對于重組人成纖維細(xì)胞生長因子21(低聚果糖)在不同保存條件下的穩(wěn)定性，特別是溫度、pH值、緩沖溶液及反復(fù)凍融因素對21（低聚果糖）穩(wěn)定性的影響作用方面鮮有人涉及，需要針對不同理化因素對于重組人成纖維細(xì)胞生長因子的保存工藝作進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供低聚果糖保存工藝，其方法簡單可行，便于人為控制，高效低成本。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

低聚果糖保存工藝，其步驟是：（1）確定低聚果糖所處的不同溫度為-20℃、4℃、25℃，確定低聚果糖所處的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉，其酸堿度為pH4.0和pH5.0、檸檬酸-檸檬酸鈉，其酸堿度為pH5.0和pH6.0、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，其酸堿度為pH6.0、pH6.5和pH7.0、Tris-HCl緩沖液，其酸堿度為pH7.5和pH8.0。

（2）將待提純的低聚果糖放于緩沖液中反復(fù)凍融條件下進(jìn)行分別保存，檢測低聚果糖純度，同時觀察外觀性狀。

本發(fā)明所取得的有益效果：

低聚果糖于低溫和pH 6.5～pH 8.0接近中性條件下呈現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，而高溫、偏酸性及偏堿性條件對低聚果糖的穩(wěn)定性不利，磷酸鹽緩沖液對低聚果糖穩(wěn)定性呈現(xiàn)出較好的作用，反復(fù)凍融處理對低聚果糖穩(wěn)定性具有明顯的影響，上述實(shí)驗結(jié)果將對低聚果糖保存工藝的研究、對低聚果糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及蛋白質(zhì)藥物制劑的開發(fā)提供依據(jù)。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

附圖說明

圖1為低聚果糖原液HPLC色譜圖。

色譜柱為C18柱(250×4.6 mm)；流動相：A相為0.1%三氟乙酸-注射用水；B相為A甲醇，C相和D相均為水；流速0.5mL/min；檢測波長280nm；平衡用100%A泵液體至基線穩(wěn)定，洗脫采用不同濃度梯度A泵逐級洗脫，進(jìn)樣量10μL。

圖2為溫度對低聚果糖純度影響趨勢圖。

25℃時，低聚果糖存放14d純度較0h(100.00%)下降至(15.20±0.14)%，差異顯著（P﹤0.05）；4℃時，低聚果糖存放35d純度下降至(89.30±0.39)%，與對照組比較差異顯著（P﹤0.05）；-20℃時，存放6個月純度下降至（99.1±0.39）%，與對照組比較差異不顯著（P> 0.05）；低聚果糖存放12個月純度下降至(95.30±0.39)%，與對照組比較差異有顯著性（P﹤0.05）。

圖3為緩沖體系及pH值對低聚果糖純度影響分布圖。

A：25℃時，低聚果糖存放14天純度變化；B：℃時，低聚果糖存放35天純度變化；C：20℃時，低聚果糖存放6個月純度變化；D：20℃時，低聚果糖存放12個月純度變化。25℃條件下低聚果糖在各不同pH值的緩沖體系中保存7天后，pH為4.0和pH5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液出現(xiàn)渾濁，低聚果糖純度分別下降至(30.6±0.12) %、(45.6± 0.30) %；pH為5.0和pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液出現(xiàn)渾濁，純度降至(55.9±0.90) %、(65.9±0.82) %；pH為6.0、pH6.5和pH7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液中pH為6.0緩沖液渾濁純度為(71.1±0.65)%，pH 6.5和pH7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液澄清透明純度(75.1±0.45)%、(80.5± 0.02)% ；pH 7.5和pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中pH7.5緩沖液澄清透明，純度(81.5± 0.22) %,(78.4± 0.37) %。

圖4為反復(fù)凍融對低聚果糖純度影響趨勢圖。

A：pH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖液；B：pH5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液；C：pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；D：pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；E、F和G：分別為pH 6.0、pH6.5和pH 7.0磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液；H：pH7.5的Tris-HCl緩沖液；I：pH8.0的Tris-HCl緩沖液。

2.4反復(fù)凍融對低聚果糖純度的影響

低聚果糖原液反復(fù)凍融后，因時間關(guān)系肉眼觀察的結(jié)果也一樣，0-3天瓶內(nèi)液體仍澄清，沒有不溶物出現(xiàn)，其純度變化無差異顯著性（P>0.05）；到6-12天時，發(fā)現(xiàn)肉眼可見的不溶物，其純度變化差異有顯著性（P﹤0.05），低聚果糖反復(fù)凍融0、6、9和12天后純度分別為(100± 0.02)%、(90.8± 0.01)%、(82.5± 0.02)%和(70.6± 0.02)%，其純度變化與對照組（0h）比較差異有顯著性(P﹤0.05)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，在此發(fā)明的示意性實(shí)施例以及說明用來解釋本發(fā)明，但并不作為對本發(fā)明的限定。

1 材料與方法

1.1主要儀器和試劑

高效液相色譜儀；三氟乙酸，乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；低聚果糖原液，由吉林醫(yī)藥學(xué)院王會巖博士提供，純度>99%。

1.2溫度對低聚果糖純度的影響

將一定數(shù)量的樣品放置25℃、4℃、-20℃下保存，對4℃和25℃樣品每周提取樣品若干支進(jìn)行外觀形狀觀察和HPLC法檢測低聚果糖純度，-20℃樣品保存12個月，每6個月取樣品3支進(jìn)行檢測，同時觀察外觀性狀。

1.3不同緩沖體系及pH值對低聚果糖純度的影響

緩沖體系終濃度為20 mmol/L，蛋白含量為0.5 mg/mL，醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 4.0和pH 5.0、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH 5.0和pH 6.0、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉緩沖液pH 6.0、pH 6.5和pH 7.0及Tris-HCl緩沖液pH 7.5和pH 8.0，分別于每 7 d 取3支觀察低聚果糖原液的外觀性狀變化并對其純度進(jìn)行測定。

1.4反復(fù)凍融處理對低聚果糖純度的影響

將一定數(shù)量低聚果糖原液于- 20°C下凍存，每日固定時間將其融化，然后置于-20°C下凍存，如此重復(fù)持續(xù) 12 d，每3d觀察低聚果糖原液外觀性狀的變化并對其純度進(jìn)行測定。

低聚果糖保存工藝，其步驟是：（1）確定低聚果糖所處的不同溫度為-20℃、4℃、25℃，確定低聚果糖所處的緩沖溶液為醋酸-醋酸鈉，其酸堿度為pH4.0和pH5.0、檸檬酸-檸檬酸鈉，其酸堿度為pH5.0和pH6.0、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉，其酸堿度為pH6.0、pH6.5和pH7.0，Tris-HCl緩沖液，其酸堿度為pH7.5和pH8.0。

（2）將待提純的低聚果糖放于緩沖液中反復(fù)凍融條件下進(jìn)行分別保存，檢測低聚果糖純度，同時觀察外觀性狀。

結(jié)果：20℃、4℃分別保存時，低聚果糖的各項性質(zhì)在觀察期內(nèi)都無明顯變化；25℃時，低聚果糖存放14d純度較0h100%下降至(15.20±0.14)%（P﹤0.01）；在pH為4.0～5.0緩沖液中25℃條件下保存7天，溶液出現(xiàn)渾濁；在pH5.0～pH6.0緩沖液中25℃條件下保存7天，溶液出現(xiàn)渾濁；在pH6.5～pH8.0磷酸鹽和Tris-HCl緩沖液中，溶液澄清透明；低聚果糖原液反復(fù)凍融后其純度變化差異有顯著性（P﹤0.05）。結(jié)論：低聚果糖在低溫和pH6.5 0-8.0磷酸鹽和Tris-HCl緩沖液中溶液較穩(wěn)定，同時反復(fù)凍融處理對低聚果糖穩(wěn)定性也具有明顯的影響。