本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及大麗輪枝菌的致病基因、蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)所引起的棉花黃萎病是一種土壤傳播的維管束病害,病原菌變異較快，具有分布廣、危害重、存活時(shí)間長、化學(xué)農(nóng)藥難于防治等特點(diǎn)，是棉花生長過程中最具毀滅性的病害之一，嚴(yán)重威脅著棉花的生產(chǎn)和發(fā)展。棉花黃萎病1914年始見于美國的費(fèi)吉尼亞州，隨后在其它州和世界各植棉國先后發(fā)現(xiàn)(沈其益，1992),1935年隨引進(jìn)美棉品種傳入中國，但危害不重。到二十世紀(jì)50年代以后，黃萎病在我國南北局部棉區(qū)陸續(xù)發(fā)生，擴(kuò)散蔓延速度加快。80年代末，黃萎病已遍及全國478個(gè)植棉縣(市)。進(jìn)入90年代以來，中國棉花黃萎病擴(kuò)展蔓延迅猛，尤其是1993,1995,1996,2002年在全國范圍內(nèi)連續(xù)大發(fā)生，損失嚴(yán)重。據(jù)2012年第11屆國際輪枝菌大會(huì)的報(bào)導(dǎo)，棉花2005-2010年世界平均年產(chǎn)量2352萬噸，因輪枝菌病害造成的損失高達(dá)年產(chǎn)的30％，每1％產(chǎn)量的損失相當(dāng)于損失3.54億美元。中國是棉花生產(chǎn)大國，全國棉花種植面積近億畝，棉產(chǎn)量占全球棉花總產(chǎn)量的四分之一。棉花生產(chǎn)的好壞不但直接影響著棉農(nóng)的收入和生活，對(duì)輕紡、外貿(mào)及國防建設(shè)也有重大的影響。然而棉花黃萎病在世界范圍內(nèi)的盛行，嚴(yán)重威脅著棉花的生產(chǎn)和發(fā)展。在中國的棉花主要生產(chǎn)區(qū)新疆，每年因?yàn)辄S萎病引起的棉花減產(chǎn)問題非常嚴(yán)重，給棉農(nóng)及國家造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。棉花黃萎病已成為棉花生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一，被稱為“棉花的癌癥”(簡桂良等.2003),并已成為當(dāng)前制約我國棉花生產(chǎn)的突出問題。大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)屬半知菌亞門，叢梗抱目，淡色孢科，輪枝菌屬。大麗輪枝菌的寄主范圍很廣，涉及十字花科、薔薇科、 豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已達(dá)660多種植物，并且還在逐年擴(kuò)大。關(guān)于棉花黃萎病的致病機(jī)制有多種解釋，其中以導(dǎo)管堵塞和中毒兩種觀點(diǎn)為主。60年代人們對(duì)該病菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)是由于菌體在導(dǎo)管內(nèi)定殖，并大量繁殖，同時(shí)刺激鄰近的薄壁細(xì)胞產(chǎn)生膠狀物質(zhì)及侵填體而堵塞導(dǎo)管，阻礙水分的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致棉株萎焉(Garber,1966)。馬遠(yuǎn)莉等(1990)對(duì)棉花各部位黃萎病菌在導(dǎo)管中的分布情況研究后認(rèn)為，正常的次生木質(zhì)部導(dǎo)管的潛在輸水能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過植物的總需水量，而且被堵塞的導(dǎo)管數(shù)占整個(gè)維管束的比例不大(最大的有17.7％)，因此導(dǎo)管堵塞不是導(dǎo)致棉花萎焉的主要原因。Keen等(1972)認(rèn)為，黃萎病菌在代謝過程中產(chǎn)生的毒素為有毒的蛋白質(zhì)，是一種酸性蛋白質(zhì)一脂多糖的復(fù)合體。該復(fù)合物對(duì)感病棉花品種的葉片與根組織的細(xì)胞膜具有破壞作用，使細(xì)胞內(nèi)K+和Na+大量滲漏。而抗病品種的細(xì)胞膜不具備毒素作用的受體位點(diǎn)而不受毒素破壞。Wang等(2004)從黃萎病原菌的菌絲中分離到一個(gè)新的具有對(duì)棉花葉片有致萎作用的蛋白VdNEP。該蛋白可以誘導(dǎo)煙草葉片形成壞死斑，也可以使擬南芥產(chǎn)生抗病反應(yīng)，因此該蛋白可能參與了黃萎病菌對(duì)棉花侵染時(shí)的互作反應(yīng)。但目前尚不清楚該蛋白是否與以前己分離的毒素蛋白是同一物質(zhì)?，F(xiàn)在越來越多的研究表明，黃萎病菌分泌的毒素是導(dǎo)致黃萎病的關(guān)鍵生化因子，同時(shí)組織導(dǎo)管的阻塞影響水分運(yùn)輸可能加劇了病癥的產(chǎn)生。大麗輪枝菌是一種土傳真菌，在干燥惡劣的環(huán)境下能夠產(chǎn)生其休眠結(jié)構(gòu)微菌核，從而在土壤中存活多年。所以微菌核的形成與其致病性息息相關(guān)。2004年，DobinsonKF等(Dobinson,K.F.,etal.,2004)利用改造了的EZ::TN轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，對(duì)來源于番茄的大麗輪枝菌的胰蛋白酶VTP1成功的進(jìn)行了定向敲除。該基因能夠促進(jìn)微菌核的形成，但是敲除以后沒有影響其致病性及生長特性。2005年，DobinsonKF等對(duì)來源于萵苣和番茄的大麗輪枝菌的細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶基因VMK1進(jìn)行了敲除。敲除VMK1后菌株對(duì)各種宿主的致病性嚴(yán)重衰退，說明MAP激酶介導(dǎo)的信號(hào)通路在真菌致病性上起著重要作用。并且基因的敲除減少了孢子的產(chǎn)生和微菌核的形成，說明該基因可能參與多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程。由于棉花黃萎病危害的嚴(yán)重性和寄主的廣泛性，世界上不少國家的科技工作者對(duì)其進(jìn)行了深入研究。植物在與病原物的長期協(xié)同進(jìn)化過程中獲 得了一系列復(fù)雜的防御機(jī)制保護(hù)自己，抗性表現(xiàn)為組成型抗性和誘導(dǎo)型抗性，誘導(dǎo)型抗性又包括組織結(jié)構(gòu)抗性和生理生化抗性。對(duì)黃萎病抗性不同的棉花品種在組織結(jié)構(gòu)方面存在一定差異，己被國內(nèi)外不少研究證實(shí)?？共∑贩N木質(zhì)部的細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞壁較厚，且木質(zhì)部中含有較多的髓射線。另外，抗病品種的導(dǎo)管腔和木質(zhì)部的纖維腔直徑小于感病品種，說明棉花品種對(duì)黃萎病的抗性與其具有堅(jiān)實(shí)的木質(zhì)部有關(guān)。棉花的生理生化抗病性方面己有過較多的研究，研究較多的抗病相關(guān)因子包括:植保素、單寧、可溶性糖、氨基酸及多種酶類。棉株在遭受病菌侵襲后，內(nèi)部產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，主要包括棉酚、植保素、單寧等，另外還與一些酶類、蛋白以及小分子物質(zhì)如H202。它們的作用是非?；?，與植物的基礎(chǔ)抗性相關(guān)。棉花抗黃萎病的機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，涉及的因素眾多，因此不斷深入研究這些抗病反應(yīng)產(chǎn)物在基因表達(dá)水平上的規(guī)律，對(duì)于進(jìn)一步深入了解抗病機(jī)制和利用基因工程手段改造棉花品種抗性具有重要意義?？共』虻墨@得是選育抗病品種的重要基礎(chǔ)，目前通過分子生物學(xué)手段己經(jīng)克隆的植物抗病基因有39個(gè)以上，其中抗病原真菌的大概有20多個(gè)，如擬南芥抗白粉病基因RPW8，番茄抗枯萎病基因泌Ve，高梁抗普通銹病(PucciniaSorghi)基因Rpl-D，且在海島棉上已經(jīng)克隆了NBS-LRR類抗病基因。在常規(guī)育種上，國內(nèi)外棉花育種者一直重視抗源的篩選和創(chuàng)造。1983-1986年李成葆等161對(duì)911份陸地棉資源進(jìn)行了抗黃萎病鑒定，篩選了抗性較好的一批抗(耐)病品種。K.V.Srinvasin鑒定了126個(gè)海島棉品種的抗性，結(jié)果顯示表現(xiàn)耐病和抗病的占85％。無論是通過常規(guī)方法尋找抗源，還是通過分子生物學(xué)手段克隆抗病基因都已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但還沒有找到真正防治棉花黃萎病的有效辦法。根本原因在于棉花等作物遺傳背景復(fù)雜，很難在分子水平進(jìn)行更深入的研究，另外大麗輪枝菌小種分化變異性強(qiáng)等原因也為抗病遺傳育種帶來重重困難。因此，研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機(jī)理至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種大麗輪枝菌的致病基因、蛋白及其應(yīng)用，該致病基因、蛋白與大麗輪枝菌導(dǎo)致棉花黃萎病的機(jī)理具有緊密聯(lián)系，通過敲除該 致病基因可以降低大麗輪枝菌的致病性。本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種大麗輪枝菌的致病蛋白，命名為CLP-1(calpainclp-1)，來自大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)，所述蛋白具有導(dǎo)致棉花黃萎病的作用，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)：1)氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的蛋白質(zhì)；2)將SEQIDNO：2的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與大麗輪枝菌致病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另一方面，提供一種大麗輪枝菌的致病基因(命名為CLP-1)，該基因編碼的蛋白具有導(dǎo)致棉花黃萎病的作用，是如下1)至4)中任一所述的基因：1)核苷酸序列如SEQIDNO：1中自5′末端第1-347位、第438-746位、第808-1311位和第1368-2901位所示的基因；2)核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的基因；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)限定的基因具有90％以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。SEQIDNO：1由2901個(gè)脫氧核苷酸組成，序列表中SEQIDNO：1的自5’端第1-347位；第438-746位；第808-1311位；第1368-2901位為ORF區(qū)，編碼SEQIDNO：2中所述氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，將SEQIDNO：2所示的蛋白命名為CLP-1，將CLP-1蛋白的編碼基因命名為CLP-1。所述“嚴(yán)格條件”為足以使核苷酸序列與SEQIDNO：1所示的基因序列雜交的條件，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，例如：在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。本發(fā)明還提供了以上所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌?！氨磉_(dá)盒”意指能指導(dǎo)適合宿主細(xì)胞中特定核苷酸序列表達(dá)的核酸序列，包含與目的核苷酸序列可操作地連接的調(diào)控元件。所述調(diào)控元件可以是啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、靜默子、終止子和/或其它控制所述核苷酸序列表達(dá)的元件， 如聚腺苷酸化序列等。本發(fā)明的再一個(gè)方面，提供以上所述基因的用途，在大麗輪枝菌中敲除以上所述的基因使大麗輪枝菌的致病性降低。本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供一種降低大麗輪枝菌致病性的方法，敲除權(quán)利要求2所述的基因，具體包括如下步驟：(1)使用兩對(duì)引物分別擴(kuò)增SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列，將擴(kuò)增后獲得的片段導(dǎo)入表達(dá)載體；(2)通過步驟(1)中獲得的含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列的片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；(3)選取轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌；(4)通過步驟(3)中所述的轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染大麗輪枝菌，選取具有抗性的菌株，即為致病性降低的菌株。以上所述的方法，其中，步驟(1)中所述兩對(duì)引物序列如下：上游引物1：5’→3’方向：GGGTTTAAUGATGAATACTTCGCACCACG(SEQIDNO:5)；上游引物2：5’→3’方向：GGACTTAAUGTCAGTGGTGCTGCCATCAA(SEQIDNO:6)；下游引物1：5’→3’方向：GGCATTAAUACGCAAACCCAGGGCAAAAC(SEQIDNO:7)；下游引物2：5’→3’方向：GGTCTTAAUAACTCACGCGGCGGGATACT(SEQIDNO:8)。以上所述的方法，其中，步驟(1)中還具體包括如下步驟：通過所述上游引物1及所述上游引物2以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增SEQIDNO:3所示序列的基因，所述下游引物1及所述下游引物2以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增SEQIDNO:4所示序列的基因，將擴(kuò)增后的兩種PCR產(chǎn)物都連接到表達(dá)載體。以上所述的方法，其中，步驟(2)中通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將所述含有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示序列的片段的表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。以上所述的方法，其中，步驟(3)中通過將所述農(nóng)桿菌涂布于含有抗 生素的平板上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株。以上所述的方法，其中，步驟(4)中通過將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的真菌菌株涂布于含有抗生素的平板上培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株。本發(fā)明提供的致病基因、蛋白經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明與大麗輪枝菌導(dǎo)致棉花黃萎病的機(jī)理具有緊密聯(lián)系，通過在大麗輪枝菌中敲除本發(fā)明的致病基因可以使大麗輪枝菌的致病性降低，將敲除了本發(fā)明致病基因的大麗輪枝菌突變體與野生型大麗輪枝菌同時(shí)侵染植株，被大麗輪枝菌突變株侵染的棉花相比野生型大麗輪枝菌侵染的棉花黃萎病發(fā)病率降低了50％以上，病情指數(shù)和病級(jí)數(shù)也有較大降低。因此本發(fā)明為研究大麗輪枝菌致病機(jī)理提供了新的啟示，為治療和預(yù)防棉花黃萎病提供了新的途徑。附圖說明圖1是實(shí)施例2中通過PCR檢測DNA水平CLP-1敲除突變體的對(duì)比電泳圖；泳道1為marker，泳道2,3,4為野生型大麗輪枝菌V592；泳道5,6,7為CLP-1敲除突變體VdaΔclp-1-1；泳道8,9,10為CLP-1敲除突變體VdaΔclp-1-2。野生型大麗輪枝菌V592用F1-HptR及HptF-R1這兩對(duì)引物擴(kuò)增不出條帶，而Fg-Rg是可以擴(kuò)增出條帶；相反，CLP-1敲除突變體VdaΔclp-1-1和VdaΔclp-1-2用F1-HptR及HptF-R1這兩對(duì)引物能夠擴(kuò)增出條帶，而Fg-Rg是不能擴(kuò)增出條帶的，說明CLP-1被敲除掉了；圖2是實(shí)施例2中通過Northern雜交檢測RNA水平CLP-1敲除突變體中CLP-1表達(dá)情況的印跡圖；圖中所示為Northern檢測敲除突變體中CLP-1被敲除掉，不表達(dá)。泳道1,2為野生型大麗輪枝菌V592能夠表達(dá)CLP-1；泳道3,4為敲除突變體VdaΔclp-1-1和VdaΔclp-1-2，不能表達(dá)CLP-1。圖3是實(shí)施例3中未被侵染的對(duì)照棉花植株；圖4是實(shí)施例3中被大麗輪枝菌V592侵染后的棉花植株；圖5是實(shí)施例3中被大麗輪枝菌V592的敲除突變體VdaΔclp-1侵染后的棉花植株；圖6是實(shí)施例3中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體VdaΔclp-1侵染20天后的發(fā)病率對(duì)比圖；圖7是實(shí)施例3中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體 VdaΔclp-1侵染20天后的病情指數(shù)對(duì)比圖；圖8是實(shí)施例3中棉花植株被野生型大麗輪枝菌V592和敲除突變體VdaΔclp-1侵染20天后的病級(jí)數(shù)對(duì)比圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌EHA105(ElizabethE.Hood.NewAgrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.TransgenicResearch,July1993,Volume2,Issue4,pp208-218)自申請(qǐng)日起二十年公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的大麗輪枝菌V592(Feng-Gao,Bang-JunZhou,AGlutamicAcid-RichProteinIdentifiedinVerticilliumdahliaefromanInsertionalMutagenesisAffectsMicrosclerotialFormationandPathogenicity.PLoSONE5(12):e15319.)自申請(qǐng)日起二十年公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中“野生型”意指不含有異源核酸分子的生物體，為非轉(zhuǎn)化的或非轉(zhuǎn)基因的生物體。實(shí)施例1、CLP-1敲除載體的構(gòu)建利用CTAB法提取大麗輪枝菌V592基因組DNA,利用以下引物以該基因組DNA為模板，利用CxHotstartDNA聚合酶(Agilent)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：上游引物1：5’→3’方向：GGGTTTAAUGATGAATACTTCGCACCACG(SEQIDNO:5)；上游引物2：5’→3’方向：GGACTTAAUGTCAGTGGTGCTGCCATCAA(SEQIDNO:6)；下游引物1：5’→3’方向：GGCATTAAUACGCAAACCCAGGGCAAAAC(SEQIDNO:7)；下游引物2：5’ →3’方向：GGTCTTAAUAACTCACGCGGCGGGATACT(SEQIDNO:8)。用USERenzymemix(NewEnglandBiolabs)將兩種PCR產(chǎn)物同時(shí)連接到pGKO-HPT載體(Tian,L.,Chen,J.,Wang,J.,Wang,J.,andDai,X.2011,自申請(qǐng)日起二十年公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用)上，測序結(jié)果表明含有SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的DNA分子的重組載體確定為最終敲除載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)野生型大麗輪枝菌V592中得到CLP-1敲除突變體。實(shí)施例2、CLP-1敲除突變體的獲得1)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)真菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)培養(yǎng)基：(a)查式培養(yǎng)基(30g/L蔗糖,3g/LNaNO3,0.5g/LMgSO4-7H2O,0.5g/LKCl,100mg/LFeSO4-7H2O,1g/LK2HPO4,pH7.2)。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，水1000ml，用NaOH調(diào)pH至7,121℃，高壓蒸汽滅菌20min。(b)LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl5g，加水至1L，121℃，蒸汽滅菌20min。固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂。(c)MM基本培養(yǎng)基：10mLK-bufer(200g/LK2HPO4,145g/LKH2PO4，H3PO3調(diào)節(jié)pH至7.0)，20mLM-Nbuffer(30g/LMgSO4·7H2O,15g/LNaCl)，1mL1％的CaCl2·2H2O(w/v)，10mL20％的蔗糖(w/v)，1mL0.1％的FeSO4(w/v)，0.5gNH4NO3，加蒸餾水至1L。113℃，蒸汽滅菌20min。(d)IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基：10mLK-bufer(pH7.0)，20mLM-Nbuffer，1mL1％CaC12·2H2O(w/v)，2.5mL20％的NH4NO3(w/v)，1mL0.1％的FeSO4(w/v)，5mL甘油，5mL2mol/L的蔗糖，2mL100mmol/L乙酰丁香酮，40mLlmol/L的MES(pH5.3)，加蒸餾水至1L。113℃，蒸汽滅菌20min。(e)CM共培養(yǎng)培養(yǎng)基：IM培養(yǎng)基中加入1.5％瓊脂粉，113℃，蒸汽滅菌20min。具體操作步驟(1)挑取農(nóng)桿菌單菌落放入到5ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素， 50ug/ml利福平)的LB液體培養(yǎng)基，置于28℃搖床上，200rpm培養(yǎng)24小時(shí)，與此同時(shí)用牙簽挑取3個(gè)PDA固體培養(yǎng)基上的V592菌餅放入含有80ml查式培養(yǎng)基的三角瓶中，置于26℃搖床上，200rpm培養(yǎng)。(2)取1ml培養(yǎng)了24小時(shí)的農(nóng)桿菌菌液加入到20ml含有抗生素(50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)的MM液體培養(yǎng)基中，置于28℃搖床上，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，離心機(jī)上4000rpm離心10min，收集菌體，菌體用IM培養(yǎng)基洗兩次，再用IM培養(yǎng)基重懸，調(diào)OD600≈0.25，將培養(yǎng)了48小時(shí)之后的野生型大麗輪枝菌V592用四層滅過菌的紗布過濾，將過濾好的菌液置于離心機(jī)上4000rpm，離心10min，用IM+AS重懸孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)孢子濃度為1.0×106-7個(gè)孢子/ml。(3)將農(nóng)桿菌菌液和真菌孢子懸浮液按1：1體積比例混勻(各取1ml)，按照每培養(yǎng)皿200μl涂布于CM培養(yǎng)基平板上的玻璃紙，26℃培養(yǎng)36個(gè)小時(shí)。(4)用3ml無菌水對(duì)共培養(yǎng)物進(jìn)行沖洗，按照500ul/板涂布于含有抗生素(潮霉素50ug/ml,羧芐青霉素200ug/ml,頭孢霉素200ug/ml，20ug/ml五氟尿嘧啶)的PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天。2)PCR鑒定CLP-1敲除突變體(圖1)A、CTAB法提取CLP-1敲除突變體基因組DNA。B、利用三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。第一對(duì)：在目的基因CLP-1的上游片段SEQIDNO:3的上游設(shè)計(jì)一個(gè)引物F1:5’-GGCTGACCTTGTCGGTGTCT-3’(SEQIDNO:9),HPTBOX上的一個(gè)引物HptR：5’-AAATTTTGTGCTCACCGCCTGGAC-3’(SEQIDNO:10)進(jìn)行上游片段PCR擴(kuò)增。第二對(duì)：在目的基因下游片段SEQIDNO:4的下游再設(shè)計(jì)的一個(gè)引物，命名為R1:5’-CCGTTGGTGGGTAGGTATCA-3’(SEQIDNO:11)，在HPTBOX上的另一個(gè)引物HptF:5’-TCTCCTTGCATGCACCATTCCTTG-3’(SEQIDNO:12)進(jìn)行下游片段的擴(kuò)增。如果引物對(duì)1和引物對(duì)2都能夠擴(kuò)增出與預(yù)期大小相等的片段，說明重組是發(fā)生在目的基因的位置。第三對(duì)引物：Fg：5’-CGAAATCGATGGATCCCAGGATCAAAAGCCCTCTAC-3’(SEQIDNO:13)，Rg：5’-AGGCTACGTAGGATCCTTACCACTGCGGTGCTTACA-3’ (SEQIDNO:14)用來擴(kuò)增敲除的目的基因，不能擴(kuò)增出片段表面目的基因確實(shí)被敲除成功。實(shí)施例3、Northern雜交檢測CLP-1敲除突變體中CLP-1表達(dá)情況A、Trizol試劑法提取真菌組織RNA(1)將真菌材料在研缽中用液氮研磨成粉末，每50～100mg組織加入1mlRNAVzol，于離心管中勻漿至完全裂解；室溫放置5min。(2)在裝有裂解物的離心管中加入0.2倍體積的氯仿(1mlRNAVzol加入0.2ml氯仿)，用振蕩器充分振蕩混勻30秒，室溫放置2～3min。(3)4℃，14000rpm，離心10min，吸取上層水相至一新的離心管中，每毫升RNAVzol可吸取約0.5～0.55ml。(4)按每毫升最初的RNAVzol加入0.5ml異丙醇，顛倒數(shù)次，混勻，室溫沉淀10min。(5)4℃，1,4000rpm，離心10min，在管底可見RNA沉淀。棄上清，每毫升最初的RNAVzol加入1ml75％乙醇，輕輕顛倒混勻，以清洗RNA沉淀。棄去液體，小心勿丟棄RNA沉淀。室溫倒置晾干(5～10min)。(6)加入適量的50％去離子甲酰胺溶解RNA沉淀，存放于－80℃?zhèn)溆?。B、RNA電泳(1)相關(guān)試劑20×SSC(175.3gNaCl，88.2g檸檬酸三鈉，用HCl調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1L，高壓滅菌)，10×MOPS(41.8gMOPS,6.56gNaAc,20ml0.5MEDTA,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，定容至1L，裝在棕色瓶中，高壓滅菌或過濾除菌。高壓滅菌后呈現(xiàn)淡黃色可用，黃色不可用)，37％甲醛(Formaldehyde)，去離子甲酰胺(Formamidedeionized)，亞甲基藍(lán)染色液(0.03％亞甲基藍(lán)，0.3MNaAc，pH5.2)。(2)RNA電泳(a)1.2％瓊脂糖甲醛變性膠的配制：(b)上樣前RNA樣品的處理：Samplebuffermix體積:25.5μl10×MOPS5μl37％甲醇8μl去離子甲酰胺12.5μl將Samplebuffermix與RNA樣品等體積混勻，65℃，變性5min，置于冰上5min，加入上樣緩沖液，混勻后即可上樣。(c)RNA電泳。所用緩沖液為1×MOPS，120V約3h。(3)轉(zhuǎn)膜(上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法)(a)用長和寬均大于凝膠的膠板作為平臺(tái)，放在塑料盤中，倒入20×SSC，剪一條與平臺(tái)等寬，長度大于平臺(tái)的濾紙，先將濾紙一端浸濕在塑料盤中，慢慢放在平臺(tái)上，直到另一端也浸濕在20×SSC中，趕出濾紙和平臺(tái)間的氣泡；(b)剪一張長和寬均略大于凝膠的尼龍膜，剪去左上角，完全浸濕在無菌水中，取出膜，再浸入20×SSC中，至少5分鐘；(c)電泳結(jié)束后，切掉凝膠的無用部分，并在左上角切去一角，以作為方位標(biāo)記。將凝膠放在20×SSC中漂洗片刻；(d)將凝膠倒放在平臺(tái)上濾紙的中央，趕出膠和濾紙間的氣泡，用Parafilm圍繞凝膠周圍，不要碰到凝膠上的樣品；(e)用20×SSC浸濕凝膠，將濕潤的尼龍膜放在凝膠上面，使二者切角重合，趕出尼龍膜和凝膠間的氣泡；(f)用20×SSC浸濕5張與尼龍膜同樣大小的濾紙，放在尼龍膜上面，趕出濾紙和尼龍膜間的氣泡；(g)剪一疊10cm厚，略小于濾紙的紙巾，放在濾紙上面，紙巾上放一塊玻璃板，再壓上500g的重物，轉(zhuǎn)移過夜；(h)揭去凝膠上方的紙巾、濾紙和Parafilm，翻轉(zhuǎn)凝膠和尼龍膜，以凝膠一面在上放在一個(gè)塑料盤中，用鉛筆在尼龍膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置；(i)從尼龍膜上剝離凝膠棄之，將尼龍膜浸泡在20×SSC中5min，取出尼龍膜，放在濕潤的濾紙上，紫外交聯(lián)固定RNA；(j)用亞甲基藍(lán)染色，直到看見清晰的RNA條帶，蒸餾水沖洗脫色，用保鮮膜包好，放在4℃保存待用。(4)探針標(biāo)記(Amersham公司隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，RediprimeTMIIRandomPrimerLabellingSystem)。(a)取待標(biāo)記的DNA25ng，加無菌水，使體積擴(kuò)增至45μl。(b)98℃，保溫5分鐘，變性DNA。(c)離心，使DNA聚集在離心管管底，放在冰上。(d)將變性的DNA加到標(biāo)記混合物中，輕輕混勻，直到pellet完全融解(不能用槍吹打)。(e)加1μlKlenow(防止標(biāo)記混合物中的Klenow失活)，離心。(f)加5μlα-32P-dCTP，用槍輕輕吹打均勻，離心。(g)37℃，反應(yīng)30分鐘；98℃，5分鐘，變性已標(biāo)記好的DNA探針，離心，放在冰上。(h)取適量探針用于雜交，剩余的探針保存在4℃冰箱中。C、雜交雜交緩沖液的配制雜交緩沖液:20.4ml所需體積終濃度1MNaHPO4(pH7.2)8.6ml43mM20％SDS7ml7％5％BSA4ml1％0.5MEDTA0.8ml20mM(a)預(yù)雜交：將雜交緩沖液倒入雜交管中65℃預(yù)熱15min后放入交聯(lián)固定的膜65℃預(yù)雜1～2h；(b)雜交：將標(biāo)記好的探針放入雜交管中，65℃雜交過夜；(c)洗膜：用洗膜緩沖液2×SSC/0.2％SDS，在65℃/15min條件下洗膜2～3次；(d)壓片：將洗好的膜從雜交管中拿出，轉(zhuǎn)移至兩層塑膜中，檢測雜交信號(hào)強(qiáng)弱，將膜放入磷屏中，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱壓數(shù)小時(shí)或過夜；(e)檢測雜交信號(hào)：掃描磷屏。結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例3敲除突變體的致病性檢測通過菌株侵染水培棉花來鑒定其致病性。挑選飽滿的棉種用15％的次氯酸鈉浸泡30min后，無菌水沖洗2-3遍，再用無菌水浸泡催芽過夜后平鋪在培養(yǎng)盒中保濕，待芽長至3cm，種于發(fā)芽盒中。將長出子葉的苗轉(zhuǎn)移到盛滿清水的塑料盒(高8-10cm)中，于25℃，光照16h，黑暗8h培養(yǎng)。待真葉長出時(shí)將清水換成1/3的MS培養(yǎng)液，每周更換一次培養(yǎng)液，1片真葉展平時(shí)接種。將-80℃保存的大麗輪枝菌V592菌株和CLP-1敲除突變體VdaΔclp-1經(jīng)PDA平板活化3-4d，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養(yǎng)液，25℃，220rpm搖培5d，過濾，濾液5000rpm離心5min，清水稀釋孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將濃度調(diào)至1×107個(gè)孢子/ml。將調(diào)好濃度的孢子懸浮液加入空塑料盒中，棉苗浸根40min。之后用1/3的MS培養(yǎng)液25℃光照16h，黑暗下繼續(xù)培養(yǎng)棉苗8h。每盒中種12株苗，每個(gè)品種3個(gè)重復(fù),對(duì)照棉苗用清水浸泡40min。20后觀察發(fā)病情況。通過上述方法，我們驗(yàn)證了CLP-1敲除突變體對(duì)棉花的致病性明顯減弱計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)：發(fā)病率＝發(fā)病數(shù)/調(diào)查總數(shù)×100％(見圖6)病情指數(shù)＝∑[病級(jí)數(shù)×該級(jí)病葉(穗、株)數(shù)]/(調(diào)查總數(shù)×最高病級(jí)數(shù))×100(見圖7)發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)植物健康沒有癥狀；1級(jí)0.1％-25％的葉片萎蔫；2級(jí)25％-50％的葉片萎蔫；3級(jí)50％-75％的葉片萎蔫；4級(jí)75％-100％的葉片萎蔫或者死亡；野生型大麗輪枝菌V592侵染的棉花與敲除突變體VdaΔclp-1侵染的棉花 的發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)圖(見圖8)。通過上述方法的結(jié)果圖，我們可以看出敲除突變體VdaΔclp-1侵染棉花相比于野生型大麗輪枝菌V592侵染棉花發(fā)病率、病情指數(shù)及發(fā)病分級(jí)都明顯降低，說明CLP-1基因與大麗輪枝菌的致病性相關(guān)。最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁1 2 3