本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋生物提取物抗腫瘤活性的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康，是當(dāng)今人類社會(huì)的第一殺手，隨著人類生活水平的提高和人類平均壽命的增長(zhǎng)，現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的不斷加快、生活方式的改變、環(huán)境的污染，惡性腫瘤的發(fā)病率和致死率不斷升高，世界衛(wèi)生組織在2008年國(guó)際腫瘤學(xué)年會(huì)上提出，到2010年癌癥將取代心血管疾病而成為導(dǎo)致人類死亡的第一殺手。腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是：無限制、無止境地快速增殖，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處迅速生長(zhǎng)增殖，導(dǎo)致人體消瘦、無力、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，患者最終因?yàn)槠鞴俟δ芩ソ叨劳?。WHO報(bào)道，2004年，約有740萬人死于癌癥，占世界所有死亡人口總數(shù)的13%。并且癌癥引起的死亡率在不斷上升，預(yù)計(jì)2030年，將有1200萬人死于惡性腫瘤。每年引起較高死亡率的癌癥有:肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。
海洋是世界上萬物的生命之源，約占地球表面積的71%，存在著地球上最豐富的生物資源，其生物多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過陸地生物。據(jù)估計(jì)，海洋中蘊(yùn)藏著地球上80%的生物資源，約有30門50多萬種。在漫長(zhǎng)的生命進(jìn)化過程中，為了適應(yīng)高鹽、高壓、低溫、低光照且變化多端的海洋生態(tài)環(huán)境，海洋生物的代謝系統(tǒng)和機(jī)體防御系統(tǒng)慢慢演化，進(jìn)化成與陸地生物截然不同，并產(chǎn)生了許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特且藥理作用顯著的海洋生物次生代謝產(chǎn)物，包括脂類、酸類、苷類、多糖類、萜類、胡蘿卜素類、甾類、生物堿、有機(jī)酸和蛋白多肽類等。這些生物活性物質(zhì)的主要作用是預(yù)防潛在天敵的進(jìn)攻,避免海洋微生物及浮游雜物的附著,以及在物種之間傳遞信息。這些新型的活性物質(zhì)已被證明具有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，比如具有抗菌、抗腫瘤、抗艾滋病、抗病毒、防治心血管疾病、延緩衰老及免疫調(diào)節(jié)等功能。在海洋活性物質(zhì)的研究中，海洋來源的抗腫瘤藥物研究一直占據(jù)著主導(dǎo)作用?？茖W(xué)家們預(yù)言，海洋將是最有前途的抗腫瘤藥物來源地。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
根據(jù)現(xiàn)在的研究進(jìn)展，本發(fā)明旨在提供一種海洋生物提取物抗腫瘤活性的測(cè)定方法。
一種海洋生物提取物抗腫瘤活性的測(cè)定方法，包括如下步驟：
（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁的腫瘤細(xì)胞，倒掉殘留的舊培養(yǎng)液；加入胰酶消化3-5min；在消化后的細(xì)胞中加入含1% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液反復(fù)吹打至形成單細(xì)胞懸液；用1000r/min的低速離心5min；棄去上清，再加入6mL RPMI 1640培養(yǎng)液再次吹打沉淀中的細(xì)胞，使之形成單細(xì)胞懸液；
（2）用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度稀釋至5×104ml-1左右；
（3）將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入100μl；置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（4）加入海洋生物提取物樣品，樣品溶液先經(jīng)過微孔濾膜過濾除菌，用RPMI 1640培養(yǎng)液將樣品稀釋成5個(gè)濃度梯度，每孔加入180μL，4個(gè)平行孔；
（5）在37℃，48h培養(yǎng)后，用移液槍將96孔板中液體洗凈后每孔加入1mg/ml MTT 100μl，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4h；
（6）棄去MTT用RPMI 1640洗板一次后，每孔加入DMSO 200μl，置搖床搖勻30min；最后用酶標(biāo)儀在570nm下檢測(cè)；
（7）實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±SD表示，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)上方差分析的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。
采用四氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]法測(cè)定海洋生物提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。四氮唑鹽是一種能接受氫原子的染料。活細(xì)胞的線粒體中與NADH有關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臜（formazan），而死細(xì)胞則沒有此功能。因此用二甲亞砜（DMSO）溶解甲臜后，搖勻30分鐘。用可調(diào)波長(zhǎng)式微孔板酶標(biāo)儀以570nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm作為參比波長(zhǎng)測(cè)定OD值，結(jié)果以細(xì)胞毒百分率表示：
細(xì)胞毒百分率（％）＝（OD值對(duì)照孔-OD值給藥孔）/OD值對(duì)照孔×100%；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±SD表示。
本發(fā)明的測(cè)定方法簡(jiǎn)單快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
一種海洋生物提取物抗腫瘤活性的測(cè)定方法，包括如下步驟：
（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁的腫瘤細(xì)胞，倒掉殘留的舊培養(yǎng)液；加入胰酶消化3-5min；在消化后的細(xì)胞中加入含1% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液反復(fù)吹打至形成單細(xì)胞懸液；用1000r/min的低速離心5min；棄去上清，再加入6mL RPMI 1640培養(yǎng)液再次吹打沉淀中的細(xì)胞，使之形成單細(xì)胞懸液；
（2）用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度稀釋至5×104ml-1左右；
（3）將細(xì)胞加入96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入100μl；置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；
（4）加入海洋生物提取物樣品，樣品溶液先經(jīng)過微孔濾膜過濾除菌，用RPMI 1640培養(yǎng)液將樣品稀釋成5個(gè)濃度梯度，每孔加入180μL，4個(gè)平行孔；
（5）在37℃，48h培養(yǎng)后，用移液槍將96孔板中液體洗凈后每孔加入1mg/ml MTT 100μl，置CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)4h；
（6）棄去MTT用RPMI 1640洗板一次后，每孔加入DMSO 200μl，置搖床搖勻30min；最后用酶標(biāo)儀在570nm下檢測(cè)；
（7）實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±SD表示，并用統(tǒng)計(jì)學(xué)上方差分析的方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算。
采用四氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]法測(cè)定海洋生物提取物對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。四氮唑鹽是一種能接受氫原子的染料?；罴?xì)胞的線粒體中與NADH有關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲臜（formazan），而死細(xì)胞則沒有此功能。因此用二甲亞砜（DMSO）溶解甲臜后，搖勻30分鐘。用可調(diào)波長(zhǎng)式微孔板酶標(biāo)儀以570nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm作為參比波長(zhǎng)測(cè)定OD值，結(jié)果以細(xì)胞毒百分率表示：
細(xì)胞毒百分率（％）＝（OD值對(duì)照孔-OD值給藥孔）/OD值對(duì)照孔×100%；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均值±SD表示。