本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的方法。

背景技術(shù)：

桿菌肽是一種由12種氨基酸組成的噻唑肽類窄譜抗生素，主要由特雷斯氏枯草桿菌和地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性球菌和桿菌有效，對(duì)少數(shù)革蘭氏陰性菌、螺旋體及放線菌也有一定的抑制作用。桿菌肽具有高效、低毒、殘留量少等優(yōu)點(diǎn)。因此，桿菌肽不僅是一種重要的抗生素藥物，也是安全性良好的畜禽抗生素飼料添加劑。

桿菌肽是幾種相似多肽組分的混合物，含有桿菌肽A、B1、B2、B3、C1、C2、C3、E、F等化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的異構(gòu)體，其主要活性成分為桿菌肽A，分子式為C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S。桿菌肽F是桿菌肽A的降解產(chǎn)物，有腎毒性，需嚴(yán)格控制其含量。

桿菌肽是類白色至淡黃色的粉末，無嗅、味苦，有吸濕性，易被氧化劑破壞，在溶液中能被多種重金屬鹽類沉淀，桿菌肽在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮、三氯甲烷或乙醚中不溶。

在現(xiàn)有技術(shù)中，桿菌肽發(fā)酵具有其自身的特點(diǎn)，在大規(guī)模生產(chǎn)中也面臨著一些需要解決的難題。

1）桿菌肽最終效價(jià)、雜質(zhì)F的含量受發(fā)酵過程中溫度影響很大。隨著發(fā)酵溫度的升高，桿菌肽效價(jià)增加，但同時(shí)雜質(zhì)F的比例大幅度的增加。例如常規(guī)的桿菌肽發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵溫度是37℃時(shí)雜質(zhì)F的比例高達(dá)10%。

2）桿菌肽為微生物發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物，存在于發(fā)酵液中。桿菌肽不僅對(duì)其他生物有殺死或抑制作用，對(duì)產(chǎn)生菌自身也有殺死或抑制作用。隨著桿菌肽在發(fā)酵液中濃度不斷增高，其產(chǎn)生菌受到高濃度產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)作用，使產(chǎn)生菌生物細(xì)胞及酶的潛力不能充分發(fā)揮，造成桿菌肽的產(chǎn)率難以提高，從而成為制約提高桿菌肽發(fā)酵水平的瓶頸。選育能耐受高濃度桿菌肽的產(chǎn)生菌固然可以使生產(chǎn)指標(biāo)得以提高，但并不能從根本上解決問題。添加大孔吸附樹脂也可降低發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌的反饋抑制，使桿菌肽產(chǎn)量提高11%以上，但大孔樹脂的加入導(dǎo)致菌絲過早斷裂并衰亡，存在發(fā)酵終點(diǎn)明顯提前的弊端，加入的大孔樹脂和菌絲混在一起，無法有效分離。3）桿菌肽是肽類抗生素，由一系列氨基酸通過酶催化合成，因而氮代謝對(duì)桿菌肽的合成影響明顯。而目前的有機(jī)氮源大多為大宗農(nóng)副產(chǎn)品，其質(zhì)量受產(chǎn)地、加工方式等影響，造成大規(guī)模生成中不同發(fā)酵批次間菌種的次級(jí)代謝水平不一致，進(jìn)而影響下游純化，最終影響產(chǎn)品質(zhì)量。

酵母粉和棉籽蛋白粉，是近年發(fā)展起來的有機(jī)氮源。其中棉籽蛋白粉是一種以特定地區(qū)的優(yōu)質(zhì)棉籽為原料，采用先進(jìn)的技術(shù)生產(chǎn)的高蛋白、低酚、低纖維、微生物利用效果好的有機(jī)氮源，產(chǎn)品的蛋白含量在50%以上，氨基酸組成占總氮的90%以上，游離棉酚的含量控制在600ppm以下，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。酵母粉為標(biāo)準(zhǔn)化有機(jī)氮源，蛋白質(zhì)含量高（蛋白質(zhì)占干菌體總重50%以上），含有18種氨基酸，種類齊全，維生素和礦物質(zhì)等含量豐富。但未見有報(bào)道將兩種有機(jī)氮源配合應(yīng)用于地衣芽孢桿菌生物合成桿菌肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵制備桿菌肽存在的發(fā)酵過程不穩(wěn)定及發(fā)酵水平低的問題，提供一種通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方（特別是氮源類型）、發(fā)酵條件（如發(fā)酵溫度），在發(fā)酵過程的特定時(shí)間段中添加超順磁性微球，減少反饋抑制，來提高桿菌肽產(chǎn)量的方法。

本發(fā)明的關(guān)鍵構(gòu)思為：采用地衣芽孢桿菌菌株為出發(fā)菌株，在微生物發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽過程中，優(yōu)化初始pH值、發(fā)酵溫度及時(shí)間、接種量等條件，優(yōu)化復(fù)合有機(jī)氮源，在桿菌肽合成期間添加超順磁性微球，提高桿菌肽的產(chǎn)量。

本發(fā)明所提供的一種發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的方法，包括以下步驟：

a、制備地衣芽孢桿菌菌株的種子液

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28-30℃、200-240 rpm，培養(yǎng)20-28 h獲得種子液；

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0-5.0克、葡萄糖10.0-20.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸銨1.0-2.0克、氯化鈉1.0-2.0克、七水硫酸鎂1.0-1.5克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌可選用菌株ATCC 10716。

b、制備地衣芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液

將上述種子液以體積百分比6-10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖瓶或發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵15-25小時(shí)之間添加經(jīng)過滅菌后的超順磁性微球，繼續(xù)發(fā)酵，總發(fā)酵時(shí)間72-96 h，發(fā)酵溫度28 -30 ℃，得到發(fā)酵液；

其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉30.0-40.0克、葡萄糖10.0-20.0克、棉籽蛋白粉15.0-30.0克、酵母粉10.0-20.0克、硫酸銨2.0-3.0克、玉米漿3.0-5.0克、磷酸二氫鉀1.0-1.5克、氯化鈉2.0-3.0克、七水硫酸鎂1.0-2.0克，加水定容至1000mL，pH6.5-7.0，121℃滅菌30min。

其中步驟b中所述有機(jī)氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉比例為3:1至1:1。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：其中步驟b中有機(jī)氮源中棉籽蛋白粉和酵母粉添加比例為3:2。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：發(fā)酵罐壓力為0.05±0.01Mpa、攪拌速度為300-400rpm，通氣比為1:0.8-1.2vvm。

本發(fā)明所述超順磁性微球是一種內(nèi)核含磁性的Fe₃O₄，外層包被多孔的高分子聚合物的微球。本發(fā)明中MagneStar?MP-02系列磁珠，商購(gòu)于蘇州納微科技有限公司，該微球的內(nèi)核具有超順磁性，飽和磁化強(qiáng)度為30-40emu/g；微球的粒徑為10-30μm，粒徑分布為單分散；高分子聚合物層呈現(xiàn)多孔性質(zhì)，孔徑為20-30nm,該多孔聚合物表面鍵合了羧基基團(tuán)，羧基含量為200μmol/g；所述超順磁性微球比表面積為150-240m²/g;所述超順磁性微球?yàn)榻?jīng)過鹽酸處理后的酸式結(jié)構(gòu)。所述超順磁性微球由于表面具有羧基基團(tuán)，能夠與含有氨基等堿性基團(tuán)的物質(zhì)鍵合，因此對(duì)發(fā)酵液中帶有堿性基團(tuán)的物質(zhì)，包括桿菌肽各組分，具有一定的吸附能力。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于：超順磁性微球的添加量為1.0-2.0%（w/v），即每升發(fā)酵液添加10-20g。

本發(fā)明的有益效果:

上述優(yōu)選條件，所獲得桿菌肽的產(chǎn)量從550U/ml提高到1228U/ml，為桿菌肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種方法。

本發(fā)明中通過優(yōu)化配方和發(fā)酵條件，選擇特定的優(yōu)質(zhì)氮源：酵母粉、棉籽蛋白粉按一定比例的混合物，以及降低發(fā)酵溫度為30 ℃，提高了桿菌肽產(chǎn)量，雜質(zhì)F的含量控制在2%以下，也保證了批次間發(fā)酵單位的穩(wěn)定性。

在發(fā)酵過程的特定時(shí)間段，通過在發(fā)酵液中添加超順磁性微球，可以非特異性的吸附發(fā)酵液中一些成分，所述成分包括發(fā)酵液中的桿菌肽、雜質(zhì)F，在一定程度上降低發(fā)酵過程中發(fā)酵液內(nèi)桿菌肽含量，因此也適當(dāng)降低了發(fā)酵產(chǎn)物桿菌肽對(duì)產(chǎn)生菌的反饋抑制。方法優(yōu)化后可使桿菌肽產(chǎn)量提高36%以上；提高了產(chǎn)能，降低了能耗及廢棄物的排放。如果應(yīng)用大孔樹脂法，在發(fā)酵液中加入大量的大孔樹脂，我們發(fā)現(xiàn)大量大孔樹脂的加入導(dǎo)致菌絲過早斷裂并衰亡，發(fā)酵終點(diǎn)明顯提前，導(dǎo)致最終產(chǎn)量提高有限。超順磁性微球法與大孔樹脂法相比，克服了上述弊端，發(fā)酵后的桿菌肽產(chǎn)量提高了19%。超順磁性微球法還克服了加入到發(fā)酵液中的大孔吸附樹脂無法回收，導(dǎo)致環(huán)境污染的缺點(diǎn)，超順磁性微球用外加磁場(chǎng)易于回收，再生后可重復(fù)使用，工藝過程綠色環(huán)保。

附圖說明

圖1為菌株發(fā)酵培養(yǎng)15小時(shí)的菌體形態(tài)。

圖2為菌株發(fā)酵培養(yǎng)25小時(shí)的菌體形態(tài)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明均為工業(yè)級(jí)原料；所用的超順磁性微球MagneStar?MP-02系列磁珠由蘇州納微科技有限公司提供，所用的棉籽蛋白粉購(gòu)自青島科瑞，酵母粉購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。用氨水洗脫發(fā)酵后分離的超順磁性微球，所獲得的洗脫液是含有多種成分的初級(jí)分離產(chǎn)物。發(fā)酵液、洗脫液中桿菌肽的效價(jià)、雜質(zhì)F的含量均使用高效液相色譜方法進(jìn)行測(cè)定，其具體步驟是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。

本發(fā)明對(duì)比實(shí)驗(yàn)中所用大孔吸附樹脂的型號(hào)為XAD18，特征孔徑150?，粒徑為0.315-1.25mm，比表面積為800m²/ g，添加量為每升發(fā)酵液添加40-80g。

大孔吸附樹脂預(yù)處理方式為每克樹脂加入6-10ml的2mol/L的HCl，靜態(tài)浸泡2-4小時(shí)后過濾，除去鹽酸，然后用去離子水洗滌至pH值5.0以上。

實(shí)施例1、 500mL搖瓶發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28℃、240 rpm、培養(yǎng)24 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨3.0克、玉米漿5.0克、磷酸二氫鉀1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：500 ml裝量三角瓶6個(gè)，每瓶裝50ml培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)24小時(shí)后接種，接種量為10%，溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速220 rpm，發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

發(fā)酵結(jié)束后，桿菌肽的發(fā)酵單位為651U/ml，結(jié)果見表1。

實(shí)施例2、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉1：1）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，30℃、200rpm、培養(yǎng)20h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨2.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.5克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿12.0克、磷酸二氫鉀4.5克、氯化鈉7.5克、七水硫酸鎂6.0克，加自來水定容至3L，pH6.8，121℃滅菌30min，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)20小時(shí)后接種，接種量為6%，罐溫29 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：1.2 vvm，400 rpm攪拌，發(fā)酵96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為752U/ml，結(jié)果見表1。

實(shí)施例3、10L罐發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：2）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28℃、220 rpm、培養(yǎng)28 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉15.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉1.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.8，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸銨10.0克、玉米漿15.0克、磷酸二氫鉀5.0克、氯化鈉15.0克、七水硫酸鎂5.0克，加自來水定容至5L，pH7.0，121℃滅菌30min，10L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量5L，種子培養(yǎng)28小時(shí)后接種，接種量為8%，罐溫30 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：0.8 vvm，300 rpm攪拌，發(fā)酵96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為847U/ml。結(jié)果見表1。

實(shí)施例4、 500mL搖瓶發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1，超順磁性微球）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28℃、240 rpm、培養(yǎng)24 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨3.0克、玉米漿5.0克、磷酸二氫鉀1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵條件：500 ml裝量三角瓶6個(gè)，每瓶裝50ml培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)24小時(shí)后接種，接種量為10%，溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速220 rpm ，發(fā)酵培養(yǎng)25小時(shí)后，每瓶加入粒徑為10μm 的超順磁性微球0.5g，發(fā)酵周期72 h。

發(fā)酵結(jié)束后，將6瓶發(fā)酵液合并后，磁性分離發(fā)酵液中的超順磁性微球，在超順磁性微球中加入18ml的4%氨水洗脫獲得洗脫液，分別測(cè)定洗脫液與發(fā)酵液清液中的桿菌肽含量。計(jì)算桿菌肽的發(fā)酵單位為885U/ml。結(jié)果見表1，計(jì)算方法見表2。

實(shí)施例5、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉1：1，超順磁性微球）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基， 30℃、200 rpm、培養(yǎng)20 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨2.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.5克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿12.0克、磷酸二氫鉀4.5克、氯化鈉7.5克、七水硫酸鎂6.0克，加自來水定容至3L，pH6.8，121℃滅菌30min，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)20小時(shí)后接種，接種量為6%，罐溫29 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1:1.2vvm，400 rpm攪拌，在培養(yǎng)至15小時(shí)后，加入粒徑為30μm 的超順納米微球介質(zhì)60g，培養(yǎng)周期96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，磁性分離發(fā)酵液中的超順磁性微球。在超順磁性微球中加入360ml的4%氨水洗脫獲得洗脫液，分別測(cè)定洗脫液與發(fā)酵液清液中的桿菌肽含量。計(jì)算桿菌肽的發(fā)酵單位為1068U/ml。具體結(jié)果見表1，計(jì)算方法見表2。

實(shí)施例6、10L罐發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：2，超順磁性微球）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28℃、220 rpm、培養(yǎng)28 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉4.0克、葡萄糖15.0克、酵母粉15.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉1.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.8，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉200.0克、葡萄糖50.0克、棉籽蛋白粉150.0克、酵母粉100.0克、硫酸銨10.0克、玉米漿15.0克、磷酸二氫鉀5.0克、氯化鈉15.0克、七水硫酸鎂5.0克，加自來水定容至5L，pH7.0，121℃滅菌30min，10L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量5L，種子培養(yǎng)28小時(shí)后接種，接種量為8%，罐溫30 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣量1:0.8vvm，300 rpm攪拌，在培養(yǎng)至20小時(shí)后，加入粒徑為20μm 的超順磁性微球100g，發(fā)酵周期96 h。不同發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間的菌體形態(tài)見圖1和圖2。

發(fā)酵結(jié)束后，磁性分離發(fā)酵液中的超順磁性微球，在超順磁性微球中加入600ml 4%的氨水溶液洗脫吸附獲得洗脫液，分別測(cè)定洗脫液與發(fā)酵液清液中的桿菌肽含量。計(jì)算桿菌肽發(fā)酵單位為1228U/ml。結(jié)果見表1，計(jì)算方法見表2。

對(duì)比例1、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽（花生餅粉、酵母粉3：2）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，28℃、220 rpm、培養(yǎng)28 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉1.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉120.0克、葡萄糖60.0克、花生餅粉90.0克、酵母粉60.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿9.0克、磷酸二氫鉀3.0克、氯化鈉6.0克、七水硫酸鎂3.0克，加自來水定容至3L，pH6.5，121℃滅菌30min。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)28小時(shí)后接種，接種量為8%，罐溫29 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：1.0 vvm，300 rpm攪拌，發(fā)酵96 h，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為550U/ml，結(jié)果見表1。

對(duì)比例2、 500mL搖瓶發(fā)酵制備桿菌肽（棉籽蛋白粉、酵母粉3：1，XAD18）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基， 28℃、240 rpm、培養(yǎng)24 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉30.0克、葡萄糖20.0克、棉籽蛋白粉30.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨3.0克、玉米漿5.0克、磷酸二氫鉀1.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：500 ml裝量三角瓶6個(gè)，每瓶裝50ml培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)24小時(shí)后接種，接種量為10%，溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速220 rpm，發(fā)酵培養(yǎng)25小時(shí)后，每瓶加入大孔樹脂XAD18 2g，發(fā)酵培養(yǎng)72 h。

發(fā)酵結(jié)束后，將6瓶發(fā)酵液合并，過濾，分離菌體與清液；菌體部分包含XAD18樹脂加入80%乙醇150ml，浸泡2小時(shí)，過濾；分別測(cè)定浸泡液與清液中的桿菌肽含量。計(jì)算桿菌肽的發(fā)酵單位為723U/ml。結(jié)果見表1，計(jì)算方法見表2。

對(duì)比例3、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽(棉籽蛋白粉、酵母粉1:1, XAD18)

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，30℃、200rpm、培養(yǎng)20h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨2.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.5克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿12.0克、磷酸二氫鉀4.5克、氯化鈉7.5克、七水硫酸鎂6.0克，加自來水定容至3L，pH6.8，121℃滅菌30min，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)20小時(shí)后接種，接種量為6%，罐溫29 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：1.2 vvm，400 rpm攪拌，在培養(yǎng)至15小時(shí)后，加入大孔樹脂XAD18 240g，培養(yǎng)周期96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液200ml，過濾，分離菌體與清液；菌體部分包含樹脂加入80%乙醇100ml，浸泡2小時(shí)后過濾，分別測(cè)定浸泡液與清液中的桿菌肽含量。計(jì)算桿菌肽的發(fā)酵單位為895U/ml。具體結(jié)果見表1，計(jì)算方法見表2。

對(duì)比例4、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽（花生餅粉、酵母粉3：2, 35℃）

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，35℃、220 rpm、培養(yǎng)28 h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉3.0克、葡萄糖20.0克、酵母粉20.0克、硫酸銨1.0克、氯化鈉1.0克、七水硫酸鎂1.0克，加自來水定容至1000mL，pH6.5，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉120.0克、葡萄糖60.0克、花生餅粉90.0克、酵母粉60.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿9.0克、磷酸二氫鉀3.0克、氯化鈉6.0克、七水硫酸鎂3.0克，加自來水定容至3L，pH6.5，121℃滅菌30min。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)28小時(shí)后接種，接種量為8%，罐溫35 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：1.0 vvm，300 rpm攪拌，發(fā)酵96 h，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為604U/ml，結(jié)果見表1。

對(duì)比例5、5L罐發(fā)酵制備桿菌肽(棉籽蛋白粉、酵母粉1:1, 35℃)

地衣芽孢桿菌菌株種子液的制備

將地衣芽孢桿菌菌株的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，35℃、200rpm、培養(yǎng)20h獲得種子液。

其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：玉米淀粉5.0克、葡萄糖10.0克、酵母粉10.0克、硫酸銨2.0克、氯化鈉2.0克、七水硫酸鎂1.5克，加自來水定容至1000mL，pH7.0，121℃滅菌30min。

本發(fā)明所述桿菌肽產(chǎn)生菌為編號(hào)ATCC 10716的菌株。

發(fā)酵培養(yǎng)基組成：

玉米淀粉90.0克、葡萄糖60.0克、棉籽蛋白粉45.0克、酵母粉45.0克、硫酸銨6.0克、玉米漿12.0克、磷酸二氫鉀4.5克、氯化鈉7.5克、七水硫酸鎂6.0克，加自來水定容至3L，pH6.8，121℃滅菌30min，5L自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。

發(fā)酵條件：裝料量3L，種子培養(yǎng)20小時(shí)后接種，接種量為6%，罐溫35 ℃、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比1：1.2 vvm，400 rpm攪拌，發(fā)酵96 h。

發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)檢測(cè)桿菌肽的發(fā)酵單位為829U/ml，結(jié)果見表1。

將表1中結(jié)果比較計(jì)算可知：

在發(fā)酵溫度低于30℃，有機(jī)氮源為棉籽蛋白粉、酵母粉時(shí)，比為花生餅粉、酵母粉時(shí)，即實(shí)施例1相比對(duì)比例1，可使發(fā)酵單位至少提高（651-550）/550=18%，且雜質(zhì)F降到2%以下。

棉籽蛋白粉：酵母粉為3：2時(shí)，比其它比例最多可使發(fā)酵單位提高（847-651）/651=30%，雜質(zhì)F最低（見實(shí)施例3相比實(shí)施例1）。

30℃以下條件下發(fā)酵與35℃發(fā)酵相比：對(duì)比例1相比對(duì)比例4，雜質(zhì)F的量減少6.6%-2.9%=3.7%；實(shí)施例2相比對(duì)比例5，雜質(zhì)F的量減少5.2%-1.8%=3.4%。

其它條件相同的情況下，添加超順磁性微球相比不添加：實(shí)施例4相比實(shí)施例1，發(fā)酵單位提高（885-651）/651=36%；實(shí)施例5相比實(shí)施例2，發(fā)酵單位提高（1068-752）/752=42%；實(shí)施例6相比實(shí)施例3，發(fā)酵單位提高（1228-847）/847=45%。可見添加超順磁性微球使發(fā)酵單位提高均在36%以上。

其它條件相同的情況下，添加大孔吸附樹脂XAD18相比不添加：對(duì)比例2相比實(shí)施例1，發(fā)酵單位提高（723-651）/651=11%；對(duì)比例3相比實(shí)施例2，發(fā)酵單位提高（895-752）/752=19%；可見添加大孔樹脂使發(fā)酵單位提高均在11%以上。

其它條件相同的情況下，添加超順磁性微球相比添加大孔吸附樹脂XAD18：實(shí)施例4相比對(duì)比例2，發(fā)酵單位提高（885-723）/723=22%；實(shí)施例5相比對(duì)比例3，發(fā)酵單位提高（1068-895）/895=19%；可見添加超順磁性微球比添加大孔樹脂使發(fā)酵單位提高在19%以上。

實(shí)施例6相比對(duì)比例1，即綜合優(yōu)化后可使發(fā)酵單位提高（1228-550）/550=123%。

E=（A*B+C*D）/B